Ni NTA Beads 6FF 目录 1. 产品介绍纯化流程在位清洗填料再生问题及解决方案.5 6. 订购信息及相关产品 6 1. 产品介绍 Ni NTA Beads 6FF 是以高度交联的 6% 琼脂糖凝胶为基质, 配体与 Ni N

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抑拜屈
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Ni NTA Beads 6FF 目录 1. 产品介绍...1 2. 纯化流程...2 3. 在位清洗...5 4. 填料再生...5 5. 问题及解决方案.5 6. 订购信息及相关产品 6 1.

1 Ni NTA Beads 6FF 目录 1. 产品介绍纯化流程在位清洗填料再生问题及解决方案.5 6. 订购信息及相关产品 6 1. 产品介绍 Ni NTA Beads 6FF 是以高度交联的 6% 琼脂糖凝胶为基质, 配体与 Ni NTA Beads 相同 ( 产品结构见图 1 所示 ), 具体性能见表 1 Ni NTA Beads 6FF 除了可以耐受苛刻的试剂条件 ( 见表 2) 外, 因其耐压的基质, 可以耐受最高 0.3 MPa 的压力, 更稳定, 因此该产品更适合用于工业大规模蛋白的纯化, 可以在相对较高的流速下, 实现对目的蛋白的纯化表 1. Ni NTA Beads 6FF 产品性能基质载量 (/ml 基质 ) 图 1. Ni NTA Beads 6FF 化学结构示意图微球粒径 (μm) 最大压力储存缓冲液储存温度表 2. Ni NTA Beads 6FF 试剂耐受情况还原剂变性剂试剂种类 Ni NTA Beads 6FF 高度交联的 6% 琼脂糖凝胶 >40mg 6XHis-tagged protein 0.3 MPa, 3 bar 含 20% 乙醇的 1XPBS 4 C-30 C 浓度 5 mm DTE 1 mm DTT 20 mm β-mercaptoethanol 5 mm TCEP 10 mm reduced glutathione 8 M urea 1 / 7 常州天地人和生物科技有限公司

2 去污剂其他类 6 M Gua-HCl 2% Triton X-100 (nonionic) 2% Tween 20 (nonionic) 2% NP-40 (nonionic) 2% Cholate (anionic) 1% CHAPS (zwitterionic) 500 mm imidazole 20% ethanol 50% glycerol 100 mm Na 2 SO M NaCl 1 mm EDTA 60 mm citrate 缓冲液 50 mm sodium phosphate, ph mm Tris-HCl, ph mm Tris-acetate, ph mm HEPES, ph mm MOPS, ph mm sodium acetate, ph 4 2. 纯化流程 2.1 Buffer 的准备可使用下列推荐缓冲液, 也可根据自己的使用习惯配置不同的缓冲液体系, 基本原理就是低咪唑上样, 高咪唑洗脱, 或者高 ph 上样, 低 ph 洗脱缓冲液在使用前最好用 0.22μm 或者 0.45μm 滤膜过滤除菌因为 Ni NTA Beads 6FF 可以用于可溶蛋白和包涵体蛋白的纯化, 两种方法所需缓冲液不同, 具体配置方法见表 3 和表 4 表 3. 可溶性组氨酸标签蛋白纯化所需缓冲液及配方名称体积配方 Lysis Buffer 1L 50 mm NaH 2 PO 4 (7.80 g NaH 2 PO 4 2H 2 O) 300 mm NaCl (17.54 g NaCl) 10 mm imidazole (0.68 g imidazole) 使用 NaOH 溶液调节 ph 至 8.0, Wash Buffer 1L 50 mm NaH 2 PO 4 (7.80 g NaH 2 PO 4 2H 2 O) 300 mm NaCl (17.54 g NaCl) 20 mm imidazole(1.36 g imidazole) 使用 NaOH 溶液调节 ph 至 8.0, Elution Buffer 1L 50 mm NaH 2 PO 4 (7.80 g NaH 2 PO 4 2H 2 O) 300 mm NaCl (17.54 g NaCl) 250 mm imidazole (17.0 g imidazole) 使用 NaOH 溶液调节 ph 至 8.0, 2 / 7 常州天地人和生物科技有限公司

3 表 4. 包涵体组氨酸标签蛋白纯化所需缓冲液及配方名称体积配方 Lysis Buffer 1L 8 M Urea ( g urea) 100 mm NaH 2 PO 4 (15.60 g NaH 2 PO 4 2H 2 O) 100 mm Tris HCl (15.76 g Tris HCl) 使用盐酸溶液调节 ph 至 8.0, Wash Buffer 1L 8 M Urea ( g urea ) 100 mm NaH 2 PO 4 (15.60 g NaH 2 PO 4 2H 2 O) 100 mm Tris HCl (15.76 g Tris HCl) 使用盐酸溶液调节 ph 至 6.3, Elution Buffer 1L 8 M Urea( g urea) 100 mm NaH 2 PO 4 (15.60 g NaH 2 PO 4 2H 2 O) 100 mm Tris Cl(15.76 g Tris Cl) 使用盐酸溶液调节 ph 至 4.5, 2.2 样品准备细菌或酵母表达的蛋白 1) 挑取单菌落到培养基中, 根据载体使用说明加入相应浓度的诱导剂诱导相应的时间 2) 表达结束后, 将培养液转移到离心杯中,7,000rpm(7,500 g), 离心 15min 收集菌体, 然后按照菌体 :Lysis Buffer=1:10(W/V) 加入 Lysis Buffer, 加入终浓度为 1mM 的 PMSF 加入溶菌酶 ( 工作浓度为 mg/ml, 如果表达的宿主细胞内含 plyss 或 plyse, 可以不加溶菌酶 ),( 同时也可加入其他蛋白酶抑制剂, 但不能影响目的蛋白与树脂的结合 ) 3) 将菌体沉淀悬浮起来,( 如果菌液浓度高, 也可考虑加入 10μg/ml RNase A 和 5μg/ml DNase I), 混匀, 放置于冰上, 然后冰上超声破碎细胞, 至菌液基本保持澄清 4) 将澄清的破碎液转移至离心管中,10,000rpm(15,000 g),4 度离心分钟取上清, 置于冰上备用或 -20 度保存酵母昆虫和哺乳细胞分泌表达可溶性蛋白 1) 将细胞培养液转移至离心杯,5000rpm(3,800 g), 离心 10min, 收集菌体得上清, 如上清中不含 EDTA 组氨酸和还原剂等物质, 即可直接加入柱子使用 ; 如含有 EDTA 组氨酸和还原剂等物质, 需用 Lysis Buffer 透析才能加入柱子 2) 对于大量体积的上清, 需加入硫酸铵沉淀浓缩后, 蛋白还需用 Lysis Buffer 透析后才能加入柱子包涵体蛋白纯化 ( 变性条件 ) 1) 将培养液转移到离心杯中,7,000rpm(7,500 g), 离心 15min 收集菌体, 去掉上清 2) 按照菌体 :Lysis buffer( 不含 8M 尿素或 6M 盐酸胍 )=1:10(W/V) 将菌体悬浮起来混匀, 3 / 7 常州天地人和生物科技有限公司

4 冰浴超声破碎 3) 将破碎液转移至离心管中,10,000rpm(15,00 g),4 度离心分钟去掉上清, 步骤 2) 和 3) 可以重复一次 4) 按照菌体 :Lysis buffer( 含 8M 尿素 )=1:10(W/V) 将包涵体悬浮起来 5) 变性条件下进行 His 标签蛋白纯化, 具体缓冲液配方见表 Ni NTA Beads 6FF 的装填 Ni NTA Beads 6FF 被广泛应用于工业纯化, 因此, 涉及到各种中压色谱层析柱的填装, 下面介绍使用 Ni NTA Beads 6FF 填装层析柱的方法层析柱的装填 ( 使用储液器装填 ) 1) 用去离子水冲洗层析柱底筛板与接头, 确保柱底筛板上无气泡, 关闭柱底出口, 并在柱底部留出 1-2cm 的去离子水 2) 将树脂悬浮起来, 小心的将浆液连续地倒入层析柱中用玻璃棒沿着柱壁倒入浆液可减少气泡的产生 3) 如果使用储液器, 应立即在层析柱和储液器中加满水, 将进样分配器放置于浆液表面, 连接至泵上, 避免在分配器或进样管中产生气泡 4) 打开层析柱底部出口, 开启泵, 使其在设定的流速下进行最初应让缓冲液缓慢流过层析柱, 然后缓慢增加至最终流速, 这样可避免液压对所形成柱床的冲击, 也可以避免柱床形成的不均匀如果达不到推荐的压力或流速, 可以用你所使用泵的最大流速, 这样也可以得到一个很好的装填效果 ( 注意 : 在随后的色谱程序中, 不要超过最大装柱流速的 75%) 当柱床高度稳定后, 在最后的装柱流速下至少再上 3 倍柱床体积的去离子水标上柱床高度 5) 关闭泵, 关闭层析柱出口 6) 如果使用储液器, 去除储液器, 将分配器置于层析柱中 7) 将分配器推向柱子至标记的柱床高度处允许装柱液进入分配器, 锁紧分配器接头 8) 将装填好的层析柱连接至泵或色谱系统中, 开始平衡如果需要可以重新调整分配器 2.4 样品纯化 Ni NTA Beads 6FF 装填好后, 可以用各种常规的中低压色谱系统 1) 将泵管道中注满去离子水去掉上塞子, 将层析柱连接至色谱系统中, 打开下出口, 将预装柱接到色谱系统中, 并旋紧 2) 用 3-5 倍柱体积的去离子水冲洗出储存缓冲液 3) 使用至少 5 倍柱床体积的 Lysis Buffer 平衡色谱柱 4) 利用泵或样品环上样注 : 样品的粘度增加使得即使上样体积很少, 也会导致层析柱很大的反压上样量不要超过柱子的结合能力大量的样品体积也可能造成很大的反压, 使得进样器更难使用 4 / 7 常州天地人和生物科技有限公司

5 5) 用 Wash Buffer 冲洗柱子, 直到紫外吸收达到一个稳定的基线 ( 一般至少个柱体积 ) 注 : 在样品和结合缓冲液中加入咪唑可以提高样品纯度 6) 用 Elution Buffer 采用一步法或线性梯度洗脱一步洗脱中, 通常 5 倍柱体积洗脱液就足够了梯度洗脱可以用一个小的梯度, 例如 20 倍柱体积或更多, 来分离不同结合强度的蛋白质 2.5 SDS-PAGE 检测将使用纯化产品得到的样品 ( 包括流出组分洗杂组分和洗脱组分 ) 以及原始样品使用 SDS-PAGE 检测纯化效果 3. 在位清洗当填料使用过程中发现反压过高或者填料上面出现明显的污染时, 需要进行在位清洗操作 (Cleaning-in-Place,CIP) 建议按照下面操作去除填料上残留的污染物, 如沉淀蛋白疏水蛋白和脂蛋白等去除强疏水结合的蛋白, 脂蛋白和脂类通过使用 30% 异丙醇清洗 5-10 个柱体积, 接触时间为分钟可以去除此类污染物然后, 再使用 10 倍柱体积的去离子水清洗也可以选择使用含有去污剂的酸性或碱性溶液, 清洗填料 2 倍柱体积例如, 含有 % 非离子去污剂的 0.1 M 醋酸溶液, 接触时间为 1 2 小时去污剂处理后, 需要使用 70% 的乙醇清洗 5 个柱体积, 以彻底去除去污剂最后使用 10 倍柱体积的去离子水清洗去除离子作用结合的蛋白使用 1.5M NaCl 溶液清洗分钟然后再使用去离子水清洗 10 个柱体积 4. 填料再生组氨酸标签蛋白亲和纯化填料所带的镍离子不需要经常螯合去除和重新挂镍离子当填料使用过程中发现颜色变浅, 或者填料载量明显变低时, 需要进行对填料进行镍离子剥离和重新挂镍离子, 也就是填料再生将填料装填在合适的层析柱内, 按照下面操作流程进行镍离子剥离和重新挂镍离子 1) 使用 5 倍柱体积去离子水清洗填料 ; 2) 使用 5 倍柱体积 100 mm EDTA (ph 8.0) 剥落镍离子 ; 3) 使用 10 倍柱体积去离子水清洗填料 ; 4) 使用 0.5M NaOH 清洗 5 倍柱体积, 停留 10-15min; 5) 使用 10 倍柱体积去离子水清洗填料 ; 6) 使用 3-5 倍柱体积 100 mm NiSO 4 再生挂镍 ; 7) 使用 10 倍柱体积去离子水清洗 ; 填料再生后, 可以立即使用, 如不立即使用, 需要将填料悬浮于等体积的 20% 乙醇中, 置于 4-30 C 保存 5 / 7 常州天地人和生物科技有限公司

6 5. 问题及解决方案问题原因分析推荐解决方案柱子反压过高填料被堵塞裂解液中含有微小的固体颗粒, 建议上柱前使用滤膜 (0.22 或 0.45μm) 过滤, 或者离心去除洗脱组分中没有目的蛋白洗脱组分不纯 ( 含有多种蛋白 ) 填料呈现褐色上样过程中蛋白发生沉淀样品太粘稠蛋白可能是包涵体, 没有在上清中表达量太低目的蛋白结合比较弱, 在洗杂步骤被洗下来了目的蛋白结合过强, 不容易洗脱下来样品中含有高浓度的核酸, 加长破碎时间直至粘度降低, 或者添加 DNase I ( 终浓度 5 μg/ml),mg 2+ ( 终浓度 1 mm), 冰上孵育分钟有机溶剂或者蛋白稳定试剂 ( 如甘油等 ) 可能会引起反压增高, 降低操作流速可以通过电泳检测裂解液分析上清中是否含有目的蛋白, 包涵体蛋白需要按照包涵体蛋白的纯化方式优化表达条件提高 wash Buffer 的 ph, 或者降低咪唑浓度降低 Elution Buffer 的 ph 值, 或者增加 Elution Buffer 中咪唑浓度使用 mM EDTA 溶液剥离镍离子, 同时得到目的蛋白蛋白降解菌体破碎时添加一些蛋白酶抑制剂在 4 C 下进行纯化操作洗杂不彻底样品中含有其他的组氨酸标签蛋白缓冲液中含有 DTT 等还原剂操作温度太低蛋白发生聚集增加 Wash Buffer 体积通过调节 ph 值, 或者咪唑浓度来优化洗杂条件再使用其他的纯化手段 ( 如离子交换, 疏水等 ) 进一步纯化洗脱组分参考表 2, 适当降低还原剂 DTT 的浓度, 或者改用巯基乙醇室温下进行上样在样品和所有的缓冲液中添加稳定剂, 如 0.1% 的 Triton X-100 或者 Tween-20 6 / 7 常州天地人和生物科技有限公司

7 6. 订购信息及相关产品名称货号规格 Ni NTA Beads SA mL SA mL SA mL SA mL SA004C 1L HisPur Ni NTA kit SA004K 3 次 Ni NTA Beads 6FF SA mL SA mL SA mL SA mL SA005C 1L HisCap 6FF SA005C11 1X1mL SA005C51 5x1mL SA005C15 1X5mL SA005C55 5X5mL SA005CS 3X1mL+1X5mL 7 / 7 常州天地人和生物科技有限公司

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Co NTA Beads 6FF 目录 1. 产品介绍纯化流程填料再生问题及解决方案订购信息及相关产品产品介绍 Co NTA Beads 6FF 可以从原核和真核表达系统中一步纯化 His 标签蛋白该产品是以 Co NTA Beads 6FF 目录 1. 产品介绍... 1 2. 纯化流程... 2 3. 填料再生... 4 4. 问题及解决方案... 4 5. 订购信息及相关产品... 5 1. 产品介绍 Co NTA Beads 6FF 可以从原核和真核表达系统中一步纯化 His 标签蛋白该产品是以高度交联的 6% 琼脂糖凝胶为基质, 配体以四配位键螯合钴 Co NTA Beads 6FF 相比 Ni

Ni NTA Beads 6FF 目录 1. 产品介绍 纯化流程 在位清洗 填料再生 问题及解决方案.5 6. 订购信息及相关产品 6 1. 产品介绍 Ni NTA Beads 6FF 是以高度交联的 6% 琼脂糖凝胶为基质, 配体与 Ni N

Ni NTA Beads 6FF 目录 1. 产品介绍纯化流程在位清洗填料再生问题及解决方案.5 6. 订购信息及相关产品 6 1. 产品介绍 Ni NTA Beads 6FF 是以高度交联的 6% 琼脂糖凝胶为基质, 配体与 Ni N