Agilent Poroshell 120 固定相在黄油抗氧化剂分离中的选择性比较 应用简报 食品检测与农业 作者 Rongjie Fu 安捷伦科技 ( 上海 ) 有限公司 摘要 对 Agilent Poroshell 120 的各种固定相 ( 包括 EC-C18 SB-C18 SB-Aq Bonu

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1 Agilent Poroshell 1 固定相在黄油抗氧化剂分离中的选择性比较 应用简报 食品检测与农业 作者 Rongjie Fu 安捷伦科技 ( 上海 ) 有限公司 摘要 对 Agilent Poroshell 1 的各种固定相 ( 包括 EC-C1 SB-C1 SB-Aq Bonus- RP 和 Phenyl-Hexyl) 在九种人工抗氧化剂分离中的选择性进行了比较 然后采用 Agilent Poroshell 1 SB-Aq 色谱柱并以水 ( 含乙酸改性剂 ) 和乙腈作为流动相, 对黄油样品中这些化合物的分析方法进行优化 该方法能够很好地分离抗氧化剂, 并适用于定量分析 前言 油和脂肪等含不饱和脂肪酸的食品容易引起脂质氧化, 导致食品酸败 出现异味及其营养价值降低 通常将合成的抗坏血酸棕榈酸酯和酚类抗氧化剂加入食品中以防这些不饱和脂肪酸发生氧化 相关部门允许使用一种或几种抗氧化剂来增强食物的抗氧化功能, 但过量摄入抗氧化剂可能对人体健康造成一定的影响 例如,2,,- 三羟基苯丁酮具有致突变作用, 丁基羟基苯甲醚和 2,- 二叔丁基 -- 甲酚可能致癌, 而没食子酸丙酯可能导致肾损伤 [1] 欧洲和美国的监管机构规定了某些抗氧化剂的最高浓度, 并禁止使用其他抗氧化剂 [2] 因此, 食品及食品成分中抗氧化剂的测定非常重要 表 1 列出了最常加入食品中的九种抗氧化剂及其结构和缩写 目前, 中国采用一种标准 HPLC 方法来测定脂肪中的抗氧化剂 该方法使用长 1-2 cm 内径. mm 并填充有 µm C1 键合二氧化硅颗粒的色谱柱, 以及由乙酸 ( 洗脱液 A) 和甲醇 ( 洗脱液 B) 组成的流动相 但是, 该方法的

2 分析速度相当慢, 分析时间达到 分钟以上 [] 脂肪加工业的 QC 实验室正在寻求缩短分析时间的方法, 因为已经发现某些抗氧化剂于室温下会在溶剂中发生明显降解 因此, 出于经济实用性考虑, 需要一种快速 准确而稳定的方法 本应用简报介绍了使用配备 Poroshell 1 色谱柱的 Agilent 12 Infinity 液相色谱仪分析黄油中的九种抗氧化剂 实验中比较了各种固定相的分离选择性 由于 Poroshell 1 SB-Aq 色谱柱相比其他固定相具有更出色的选择性和保留时间, 因此选择该色谱柱进行方法开发, 然后对方法进行优化, 使其适合分析各种黄油样品 表 1. 本研究所用的人工抗氧化剂 峰号名称 CAS 结构 1 没食子酸丙酯 (PG) ,,- 三羟基苯丁酮 (THBP) 叔丁基对苯二酚 (TBHQ) 1-- 去甲二氢愈创木酸 (NDGA) -- 丁基羟基苯甲醚 (BHA) 1-1- Ionox-1-2- 没食子酸辛酯 (G) ,- 二叔丁基 -- 甲酚 (BHT) 12-- 没食子酸十二酯 (DG)

3 材料与方法 HPLC 分析采用 Agilent 12 Infinity 液相色谱仪, 该液相色谱仪包括 :Agilent 12 Infinity 二元泵 (G2A) Agilent 12 Infinity 自动进样器 (G22A) Agilent 12 Infinity 柱温箱 (G11C) 和 Agilent 12 Infinity 二极管阵列检测器 (G212A) 色谱柱 Agilent Poroshell 1 EC-C1,. 1 mm, 2. µm ( 部件号 -2) Agilent Poroshell 1 SB-C1,. 1 mm, 2. µm ( 部件号 -2) Agilent Poroshell 1 SB-Aq,. 1 mm, 2. µm ( 部件号 -1) Agilent Poroshell 1 Bonus-RP,. 1 mm, 2. µm ( 部件号 -1) Agilent Poroshell 1 Phenyl-Hexyl,. 1 mm, 2. µm ( 部件号 -12) 用甲醇配制分析物浓度分别为.1 mg/ml 的混标储备液 用乙腈 : 异丙醇 (: v:v) 将储备液稀释成一系列浓度不同的标准溶液以考察分析方法的线性, 标准溶液的浓度包括 和 1 ppm 黄油从超市购得, 分别产自美国 瑞士 澳大利亚和新西兰 按照中国国家标准方法配制样品溶液 [] 对于加标样品, 在萃取之前, 加入溶于溶剂中的抗氧化剂储备液 称取 1. g 黄油并加入. ml 乙腈饱和的正己烷进行萃取 将该混合物涡旋混合以溶解黄油, 向其中加入 1 ml 正己烷饱和的乙腈, 再次涡旋混合 1 分钟, 静置直至发生分层 收集乙腈层, 并采用正己烷饱和的乙腈再次进行萃取 将收集的乙腈混合, 并用氮气流浓缩至 1 ml 的体积, 然后用异丙醇配制成 2 ml 使用安捷伦.2 µm 再生纤维素膜过滤器 ( 部件号 -222) 对这些溶液进行过滤, 然后将其转移至自动进样器样品瓶中等待进样 结果与讨论选择性比较 Poroshell 1 色谱柱填充表面多孔颗粒填料, 具有类似于亚 2 µm 颗粒的性能, 而背压比填充亚 2 µm 颗粒的色谱柱低 %-% 最近推出了可用于 Poroshell 1 色谱柱的新型固定相, 使这种色谱柱可通过改变选择性来进行方法开发 随后尝试采用各种键合相进行方法开发, 证明可以由这些色谱柱轻松获得不同的选择性 图 1 和图 2 为采用乙酸 : 甲醇和乙酸 : 乙腈流动相的五种不同反相方法所得到的叠加色谱图 除采用 Poroshell 1 Bonus-RP 色谱柱和甲醇有机相这一条件外, 所有色谱方法均获得了对称的峰形 这可能是由 Poroshell Bonus-RP 键合相中嵌入的酰胺基团引起的, 流动相中含甲醇时, 与酸性分析物具有很强的氢键吸引作用 五种色谱柱之间选择性的差异由键合相的差异造成, 例如键合类型 封端以及二氧化硅表面硅醇基的含量和类型 影响选择性的其他因素 ( 包括流动相组成 温度和 ph) 在本研究中完全相同 这五种键合相均以 2. µm Poroshell 1 表面多孔二氧化硅为基础 其中包括高度封端的 EC-C1 色谱柱, 可提供最佳的总体峰形 ;SB-C1 和 SB-Aq 未封端色谱柱, 与硅醇基发生相互作用, 并提供 C1 固定相的可替代选择性 ;Bonus-RP, 可提供独特选择性的极性嵌入式胺类分析专用柱 ; 以及 Phenyl-Hexyl 键合色谱柱, 改善了对芳香族化合物的选择性 采用乙腈 /1.% 乙酸作为流动相时,Phenyl-Hexyl 和 EC- C1 色谱柱无法很好地分离峰 和峰 SB-C1 和 SB-Aq 均可分离所有九个峰, 但 SB-C1 相比 SB-Aq 具有更长的保留时间, 且峰 和峰 之间的分离度较差 将流动相改为甲醇 :1.% 乙酸时, 所有色谱柱上的洗脱顺序均发生变化, 且若干峰的分离度较差, 但 SB-Aq 仍可很好地分离全部九种化合物 在 SB-Aq 色谱柱上对两种流动相进行了仔细比较, 采用乙腈 :1.% 乙酸能够使所有化合物获得更出色的分离度和更高的性能 因此, 选择 Poroshell 1 SB-Aq 并以乙腈 :1.% 乙酸作为流动相进行进一步方法开发

4 , Poroshell 1 Phenyl-Hexyl,. 1 mm min Poroshell 1 SB-C1,. 1 mm min 1 2 Poroshell 1 EC-C1,. 1 mm min Poroshell 1 SB-AQ,. 1 mm min Poroshell 1 Bonus-RP,. 1 mm min 图 1. 在选择性不同的各种 Agilent Poroshell 1 固定相上获得的乙腈 :1.% 乙酸中九种抗氧化剂的色谱图 条件, 图 1 洗脱液 : A 1.% 乙酸,B 乙腈 进样量 : 2 µl 1 ppm 混合物, 溶于 1% 甲醇中 流速 :. ml/min 梯度 : 时间 (min) %B 2. 2 柱温 : C 检测器 : UV, nm

5 min, Poroshell 1 Phenyl-Hexyl,. 1 mm Poroshell 1 SB-AQ,. 1 mm min, Poroshell 1 SB-C1,. 1 mm min,, Poroshell 1 Bonus-RP,. 1 mm min Poroshell 1 EC-C1,. 1 mm min 图 2. 在选择性不同的各种 Agilent Poroshell 1 固定相上获得的甲醇 :1.% 乙酸中九种抗氧化剂的色谱图 条件, 图 2 洗脱液 : A 1.% 乙酸,B 甲醇 进样量 : 2 µl 1 ppm 混合物, 溶于 1% 甲醇中 流速 :. ml/min 梯度 : 时间 (min) %B 1 柱温 : C 检测器 : UV, nm

6 在 Poroshell 1 SB-Aq 上的方法开发方法应按照上文有关 Poroshell 1 SB-Aq 和乙腈 :1.% 乙酸流动相的描述进行调整, 但实际样品 ( 黄油 ) 比标准品更复杂 在处理黄油中的干扰组分时, 为获得良好的分离, 可调整梯度以使目标抗氧化剂获得理想的分离度 图 显示了在改进的梯度下, 九种 1 ppm 抗氧化剂所得到的色谱图 所有化合物都具有对称的峰形, 最后一个峰的洗脱时间从原梯度下的.2 分钟延长至. 分钟 实际样品分离必须使用稍长一些的梯度, 以获得理想的分离 图. 采用 Agilent Poroshell 1 SB-Aq 色谱柱分离 1 ppm 标准品所得到的色谱图 条件, 图 洗脱液 : A 1.% 乙酸,B 乙腈 进样量 : 2 µl 1 ppm 混合物, 溶于 % 乙腈 /% 异丙醇中 流速 :. ml/min 梯度 : 时间 (min) %B 1 1 停止时间 : 1 分钟 柱温 : C 检测器 : UV, nm

7 利用紫外检测器在 nm 下得到的线性相关系数和检测限 (LD) 数据如表 2 所示 所有九种化合物的线性系数均非常出色 在信噪比为 的情况下计算得到 LD 所有抗氧化剂的 LD 均小于等于.1 ppm 这相当于黄油样品中的.2 mg/kg 左右或更低 稳定的保留时间对于准确鉴定复杂食品基质中的分析物至关重要 图 显示了对 1 ppm 混标进行八次连续进样所得到的叠加色谱图 所有峰的保留时间均具有良好的重现性, 在 Poroshell 1 SB-Aq 色谱柱上进行八次重复进样所得的峰保留时间的相对标准偏差均小于.1% 表 2. 九种抗氧化剂的线性相关系数和理论 LD 编号名称 校准曲线 范围 (ppm) 相关系数 LD ( 信噪比 = ) (ppm) 1 PG Y =.1X THBP Y = 1.X TBHQ Y = 2.1X NDGA Y =.X BHA Y = 2.1 X G Y =. X Ionox-1 Y = 1.12 X DG Y =.X BHT Y = 1. X _ min 图. 采用 Agilent Poroshell 1 SB-Aq 色谱柱对 1 ppm 标准品进样八次所得到的叠加色谱图 条件与图 相同

8 对五种不同黄油的萃取物 ( 图 ) 和 1 ppm 加标黄油 ( 图 ) 进行分析, 以考察系统适用性 将样品与 1 ppm 加标样品的色谱图进行比较, 可以看到黄油基质中的额外峰, 但对标准峰仅产生了几个干扰峰 例如, 峰 在未加标的样品 1 和样品 中难以区分, 而峰 则在未加 标样品 2 中难以区分 尽管存在一些干扰物质, 但使用该 HPLC 方法仍可测量黄油中 ppm 级抗氧化剂的含量 如果需要较低含量的 LD, 三重四极杆质谱仪将是更理想的检测器选择 图. 采用 Agilent Poroshell 1 SB-Aq 色谱柱分离五种不同的黄油 条件与图 相同

9 图. 采用 Agilent Poroshell 1 SB-Aq 色谱柱分离加入 1 ppm 标准品的五种不同的黄油 条件与图 相同 结论 Agilent Poroshell 1 色谱柱填充表面多孔颗粒填料, 具有类似于亚 2 µm 颗粒的性能, 而背压比填充亚 2 µm 颗粒的色谱柱低 %-% 最近推出的 Poroshell 1 色谱柱的新型固定相使它们能够通过多种化学键合相提供独特而不同的选择性, 适用于方法开发过程 将 Poroshell 1 SB-Aq 与 Agilent 12 Infinity 液相色谱仪结合使用, 开发出一种用于测定黄油中抗氧化剂的快速分析方法 分析时间可缩短至 1 分钟, 仅为传统 µm 色谱柱分析时间的三分之一 对黄油样品和加标黄油样品进行萃取, 并考察系统适用性 最终获得了 ppm 级的满意结果 所开发的方法适用于食品行业的 QC 实验室对黄油中的抗氧化剂进行分析 参考文献 1. Li Tao et al.food Res.Dev.(Japan), 2, 2 () 2. Gerd Vanhoenacker, Frank David, Pat Sandra. Ultrafast analysis of synthetic antioxidants in vegetable oils using the Agilent 12 Infinity LC system ( 使用 Agilent 12 Infinity 液相色谱系统对植物油中的合成抗氧化剂进行超快速分析 ) 应用简报, 安捷伦科技公司, 出版号 -EN (). Anon.Method for the determination of antioxidants in oils and fats for import and export - liquid chromatography.sn/t 1-2.China Standard (2) 更多信息 这些数据仅代表典型的结果 有关我们的产品与服务的详细信息, 请访问我们的网站

10 查找当地的安捷伦客户中心 : 免费专线 : --2,--2( 手机用户 ) 联系我们 : LSCA-China_@agilent.com 在线询价 : 仅限研究使用 不可用于诊断目的 安捷伦对本资料可能存在的错误或由于提供 展示或使用本资料所造成的间接损失不承担任何责任 本资料中的信息 说明和指标如有变更, 恕不另行通知 安捷伦科技 ( 中国 ) 有限公司,1 1 年 月 1 日, 中国出版 1-1CHCN

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