CHCN.indd

Size: px

Start display at page:

Download "CHCN.indd"

葱梓仲
5 years ago
Views:

1 安捷伦应用解决方案橙汁中抗坏血酸柠檬酸和苯甲酸的分析应用报告作者食品 Syed Salman Lateef Agilent Technologies, Inc. Bangalore, India 摘要食品添加剂, 如抗氧化剂和防腐剂的添加, 可以延长食品的保质期在本文中, 我们描述了一种定量分析橙汁中抗氧化剂 ( 维生素 C) 和防腐剂 ( 柠檬酸苯甲酸 ) 的方法该方法的开发是通过采用配备 Agilent Poroshell EC-C18 色谱柱的 Agilent 126 Infi nity LC 系统来实现的对样品分析进行部分方法学验证, 证明其线性稳定性, 以及峰面积和保留时间的精密度符合要求该方法中苯甲酸的检测限为.2 µg/ml 在样品回收率的研究中, 所有化合物的回收率都大于 9% 该方法通过采用 Agilent 129 Infi nity LC 系统可有效地转换成一个快速的超高效液相色谱 (UHPLC) 方法新方法分析速度比原方法快 5 倍, 并且苯甲酸的检测限不变两种方法都能被食品制造商有效采用, 实现对食品添加剂的质量控制

2 引言抗氧化剂, 如抗坏血酸的抗氧化作用是通过减少环境中的氧来实现的抗坏血酸优先被氧化并生成去氢抗坏血酸 (DHA), 从而防止了基质的氧化防腐剂, 如柠檬酸或苯甲酸防止或抑制食品中微生物的生长在一些水果中天然含有抗坏血酸柠檬酸和苯甲酸 [1], 额外添加这些成分可延长果汁的保质期虽然果汁中苯甲酸的含量法规限值为 4 µg/ml 到 6 µg/ml, 但我们更加关注的是由苯甲酸和抗坏血酸在一定条件下反应生成的致癌物质苯 [2,3] 据报道, 抗坏血酸的含量随时间温度和其他因素变化而减少并最终生成 DHA AOAC 官方方法中检测分析维生素 C 含量的方法是首先氧化抗坏血酸生成 DHA, 然后再进行衍生和荧光检测对于 UV 分析,DHA 在波长 22 nm 以上紫外吸收很小, 而抗坏血酸在 nm 波长处有紫外吸收 ( 取决于缓冲液的 ph 值 [5] ) AOAC 官方方法采用 UV 检测分析橙汁中的苯甲酸本文运用简单的样品提取步骤并采用 UV 检测器对抗坏血酸柠檬酸和苯甲酸进行定量分析试剂和化学品所有试剂和溶剂均为 HPLC 级高纯水由 Milli Q 水净化系统制备 (Millipore Elix 1, 美国 ) 梯度使用的乙腈购自 Lab-Scan 公司 ( 泰国 ), 磷酸二氢钾购自 Fluka 公司 ( 德国 ) 磷酸购自 Fluka 公司 ( 瑞士 ) 抗坏血酸柠檬酸和苯甲酸标准品均购自 Sigma-Aldrich 公司 ( 印度 ) 购买在印度生产的知名国际品牌橙汁实验部分仪器及软件 Agilent 126 Infi nity 二元液相色谱系统由以下几个模块组成 : Agilent 126 Infi nity 二元泵 (G1312B) Agilent 126 Infi nity 自动进样器和恒温器 (G1367E, G133B) Agilent 126 Infi nity 柱温箱 (G1316A) Agilent 126 Infi nity 二极管阵列检测器 (G4212B) 配备 1 mm 最大光强流通池采用 Agilent 129 Infi nity LC 系统实现了 UHPLC 分析的开发和运行该系统由以下几个模块组成 : Agilent 129 Infi nity 二元泵 (G422A) Agilent 129 Infi nity 自动进样器和恒温器 (G4226A, G133B) Agilent 129 Infi nity 柱温箱 (G1316C) Agilent 129 Infi nity 二极管阵列检测器 (G4212A) 配备 1 mm 最大光强流通池色谱柱 : Agilent Poroshell 12 EC-C18, mm,2.7 µm ( 部件号 ) 工作站软件 : B.4.2 版 Agilent ChemStation 工作站 2

3 色谱参数反相液相色谱法和 UHPLC 法的色谱参数见表 1 标准品制备准确称取抗坏血酸柠檬酸和苯甲酸, 用流动相 A 分别配制浓度为 5 µg/ml (ppm) 5 ppm 和 1 ppm 标准储备液超声 1 min 使苯甲酸溶解完全用流动相 A 依次稀释上述三种标准储备液配制成线性浓度水平的标准溶液, 见表 2 ph 值 2.5 的流动相 A 能防止抗坏血酸的电离样品制备将适量的磷酸滴加到 5 ml 橙汁中, 调节其 ph 值到 2.5 并涡旋混合样品溶液在 1897 g 离心力下离心 5 min, 通过.2 µm 安捷伦再生纤维素滤膜过滤 ( 部件号 ) 过滤后的样品溶液直接用于样品分析步骤 5 µl 流动相 A 作为空白进样分析, 每个线性浓度水平重复分析六次每个浓度水平的峰面积和保留时间的数据被用于计算相对标准偏差 (RSD) 根据苯甲酸低线性浓度进样计算其检测限 (LOD) 和定量限 (LOQ) 确定线性浓度之前, 进样分析萃取后的橙汁样品以测定其中抗坏血酸柠檬酸和苯甲酸的大致浓度以每个线性浓度水平的平均峰面积对溶液浓度作图得线性曲线色谱条件参数 Agilent 126 Infinity LC 系统 Agilent 129 Infinity LC 系统 TCC 温度 2 C 2 C 采集速率 4 Hz 4 Hz DAD 波长 (nm) 21.,23., ,23.,243.5 流通池 1 mm,1 µl 1 mm,1 µl 样品恒温箱 4 C 4 C 流动相 A 2 mm 磷酸二氢钾缓冲溶液 (KH2PO4), 用磷酸调节 ph 值至 mm 磷酸二氢钾缓冲溶液 (KH2PO4), 用磷酸调节 ph 值至 2.5 流动相 B 6% 甲醇 -4% 乙腈 6% 甲醇 -4% 乙腈梯度时间 (min) %B 时间 (min) %B 流速 1. ml/min 1.5 ml/min 进样量 5 µl, 清洗端口 3. s 4 µl, 清洗端口 5. s 表 1 Agilent 126 Infinity LC 和 Agilent 129 Infinity LC 系统使用的色谱参数浓度水平抗坏血酸 (µg/ml) 柠檬酸 (µg/ml) 苯甲酸 (µg/ml) 表 2 三种目标分析物的稀释溶液浓度 3

4 进行回收率实验时, 将橙汁的 ph 值调节到 2.5 添加高浓度和低浓度的维生素 C 柠檬酸和苯甲酸到橙汁中, 配制成高浓度和低浓度的加标样品高浓度和低浓度加标样品的差异用于回收率计算为评价该方法的耐用性, 改变了四个关键的方法参数流速 ± 2% TCC 温度 ± 5% 进样量 ± 5% 和波长 ± 3% 针对每一个变动, 重复进样分析浓度分别为 18 ppm 7 ppm 和 5 ppm 的维生素 C 柠檬酸和苯甲酸混合加标样品七次分析了三种不同品牌橙汁中该三种酸性物质的含量随后将该方法成功转换成一个 UHPLC 方法评估每个标准品的 LOD LOQ 和线性, 同时用峰面积和保留时间的 RSD 验证该方法的精密度结果与讨论分离与检测 Agilent Poroshell EC-C18 色谱柱被用于进一步实验在一个低的 TCC 温度和 6% 甲醇 4% 乙腈的流动相 B 下, 标准品峰与基质峰实现了良好的分离 ph 值 2.5 时, 游离型抗坏血酸在波长 nm 处具有最大的紫外吸收在这个波长下基质吸收较少, 所以能简单地定量分析抗坏血酸在波长 21. nm 处检测柠檬酸, 而在波长 23. nm 处检测苯甲酸因为抗坏血酸在低温下稳定, 所以在整个分析过程中, 自动进样器温度一直恒定在 4 C Margolis 等人 [6] 报道指出当抗坏血酸储存在自动进样器样品瓶中 22h 后, 其浓度会显著下降结果显示, 在不同批次的自动进样器样品瓶中抗坏血酸的浓度损失可高达 89% 然而,Margolis 的研究表明样品瓶在经过酸碱清洗后, 抗坏血酸的最大损失只有 4% 在本研究中, 测试了三种不同的样品瓶 : MS 校验样品瓶 (p/n ) ALS 样品瓶 (p/n ) 经酸碱清洗的 ALS 样品瓶校准标准品储存于缓冲溶液中, 并放置于 4 C 的 ALS 恒温箱中,16h 后在所有三种样品瓶的样品中, 抗坏血酸的峰面积损失为 3%, 而柠檬酸和苯甲酸的峰面积损失均小于 1% 本研究表明这三种样品瓶都可以用于本分析在本应用报告中, 使用的是 MS 校验样品瓶图 1 展示了采用 Agilent 126 Infi nity LC 系统分离抗坏血酸柠檬酸和苯甲酸的色谱图一步升至 25% 流动相 B 的梯度程序对于从基质中洗脱出苯甲酸峰非常必要维持高比例的有机相 13 min 以上, 可确保完全去除来自橙汁的基质峰采用多种色谱柱分离检测维生素 C 柠檬酸和苯甲酸标准品用流动相 A 溶解, 同时添加标准品到橙汁中, 配制成加标样品用以测试基质干扰安捷伦苯基 - 己基柱和 Poroshell EC-C18 色谱柱对水溶性标准品具有良好的分离性能 min 图 1 采用 Agilent Poroshell 12 EC-C18 色谱柱分离抗坏血酸柠檬酸和苯甲酸标准品的色谱图, 于波长 23 nm 处获得 4

5 检测限 (LOD) 和定量限 (LOQ) 信噪比大于 3 时的被测物浓度可被认定 1.2 为 LOD, 同时信噪比大于 1 时的被测物浓度可被认定为 LOQ 峰间值法用于计算噪音并与被分析物的峰高进行比较获得 S/N 值在本应用报告中, 测定了苯甲酸的 LOD 和 LOQ 以 S/N = 3 和 S/N = LOQ.2 µg/ml 16 分别计算得 LOD 为.5 µg/ml,loq 为.2 µg/ml.4 线性绘制了三种化合物不同浓度范围的校准曲线苯甲酸在 LOQ 水平开始进行线性关系考察每个浓度水平的校准溶液进样六次, 取其平均值用于建立校准曲线校准曲线的线性范围涵盖了橙汁中三种化合物的一般浓度图 3 展示了抗坏血酸的线性水平三种化合物的 LOD LOQ 值, 以及线性结果列于表 min 图 2.2 µg/ml 苯甲酸校准液 ( 柱上量 1 ng,loq 水平 ) 与空白样品的叠加色谱图 ( 在 LOQ 水平 ) 该浓度下 S/N 为 16 mau y = 14.11x R 2 = ppm 图 3 1 µg/ml 到 225 µg/ml 抗坏血酸的线性水平及相关系数编号名称 LOD µg/ml S/N LOQ µg/ml S/N 线性范围 (µg/ml) R 2 值浓度水平, 重复次数 = 6 准确度 1 抗坏血酸 L1=87% (98% 1%) 2 柠檬酸 % 11% 3 苯甲酸 L1 = 16% 96 11% 表 3 抗坏血酸柠檬酸和苯甲酸的线性水平橙汁中三种化合物的含量在线性范围内 5

6 保留时间 (RT) 和峰面积的精密度通过 RSD(%) 衡量各个线性水平化合物峰面积的精密度如图 4 所示, 水平 1(L1) 的苯甲酸具有最大的 RSD 值 1.9% 类似地, 保留时间的精密度计算结果表明其最大 RSD 值仅为.13% 低的峰面积和保留时间的 RSD 值表明本方法的重现性和精密度是可以被接受的图 4 为峰面积 RSD 值的图示耐用性 RSD (%) 为考察本方法的耐用性, 使用了分别含 18 µg/ml 7 µg/ml 和 5 µg/ml 的抗坏血酸柠檬酸和苯甲酸的标准混合溶液改变四种关键方法参数 ( 流速 TCC 温度进样量和波长 ) 进行测试, 重复七次进样采集数据, 并采用后六次重复进样的目标物峰面积进行计算峰面积和保留时间允许的最大偏差分别设定为 ± 5% 和 ± 3% 图 4 每个浓度水平重复进样六次的峰面积 RSD(%) 6

7 % % 23 nm % % % % % 1. ml/min ± 2% 1.2 ml/min ml/min TCC 2 C ± 5% 21 C C µl ± 5% 5.25 µl µl nm ± 3 nm nm nm 表 4 方法耐用性实验结果表 4 中红色数字表示峰面积的偏差已超出了标准方法所允许的偏差范围表 4 总结了耐用性实验的结果红色数字表示该组合所得峰面积的偏差已超过允许的偏差范围流速改变 2% 导致了抗坏血酸的峰面积和保留时间均发生改变尽管峰面积的偏差超出了 5% 的允许范围但保留时间的偏差却在允许的范围内同样, 对于抗坏血酸,TCC 温度的微小偏差引起其峰面积的最大偏差这些结果表明在分析过程中保持柱温恒定的重要性柠檬酸和苯甲酸峰面积的重现性在很大程度上受进样精密度和波长准确度的影响对 UV DAD 进行适当的校准, 并且通过准确度检验是十分重要的耐用性研究结果表明在正常情况下运用该方法是非常可靠的, 同时其性能在很大程度上不受参数刻意改变的影响当然, 有些参数十分关键, 必需严格控制样品回收率实验由于无法进行空白试验, 所以对三种目标化合物进行加标回收率实验将一个含抗坏血酸 (3 µg) 柠檬酸(4 µg) 和苯甲酸 (2 µg) 的低浓度标准混合溶液添加到橙汁中 ( 用磷酸调节 ph 到 2.5) 另一高浓度混合标准溶液含抗坏血酸 (6µg) 柠檬酸(8 µg) 和苯甲酸 (4 µg) 也同样添加到另一份橙汁样品中如上所述, 从橙汁样品中提取目标分析物利用校准曲线 ( 见第 5 页图 3 及化合物名称回收率 (%) 抗坏血酸 1 ± 3 柠檬酸 91 ± 12 苯甲酸 98 ± 6 表 5 三次平行加标回收率实验的结果线性段落 ), 相应峰面积被计算转换为浓度值用计算得到的高浓度加标样品浓度减去低浓度加标样品浓度, 与高低不同加标样品加标量的差比较计算回收率这种减差法可以避免实验中任何化合物 / 基质的降解产物造成的影响进行三次平行加标回收率实验, 其结果列于表 5 由于抗坏血酸最大吸收波长的 nm 处具有最小的背景吸收, 因此其获得了极佳的回收率三种目标分析物的回收率都大于 9% 7

8 样品分析在本研究中, 采用上述过程对橙汁中的抗坏血酸柠檬酸和苯甲酸进行提取并采用所建立的色谱分析方法进行定量分析分析了三种不同的橙汁样品 ( 每种样品重复三次 ), 分别标记为 O-juice 1 O-juice 2 和 O-juice 3 样品制备如上所述分析测试结果代入线性方程计算得分析物的浓度 ( 表 6), 三种品牌的橙汁中三种分析物的浓度有差异, 结果列于表 6 O-juice 1 的营养标签上标明含 111 µg/ml 的抗坏血酸, 但其实际测得量为 145 µg/ml 这可能是因为橙汁中天然存在着抗坏血酸, 从而使其含量增加, 又或者是由产品批次的差异造成虽然 O-juice 1 标明未添加任何防腐剂, 但还是发现有痕量的苯甲酸存在 O-juice 3 标明添加了抗氧化剂 E3 和酸性调节剂 E33( 未标明用量 ), 它们分别对应着抗坏血酸和柠檬酸用本方法对两种化合物进行了检测和定量分析另外, 在该样品中还检测到了浓度为 2.25 µg/ml 的苯甲酸, 见图 µg/ml 图 5 在波长 23 nm 处, 检测三种不同品牌橙汁中的苯甲酸 6 8 µg/ml O-juice O-juice 2 O-juice nm 2 _ 2 2 _ 2 2 _ 2 2 _ 2 µg/ml O-juice1 145 ± ± ±.7 O-juice 2 93 ± ± 43 ± O-juice ± ± ±.6 表 6 三种不同品牌橙汁中抗坏血酸柠檬酸和苯甲酸的含量 min 8

9 UHPLC 方法通过采用 Agilent 129 Infi nity LC 系统.389 将 HPLC 分析方法转换成一个 UHPLC 分析方法通过采用一个更短的色谱柱和相 4 同的流动相开发出了一种更简单更快速的分析方法 UHPLC 方法只需 5 min 即可完成整个分析, 如图 6 所示, 而一般的 HPLC 方法则需用时 25 min 提高 5 倍分析速度的同时也节省了 68% 的溶剂该快速分析方法也解决了在分析过程中抗坏血酸的损失问题这里应该注意的是在 UHPLC 方法中有机相 B 的最大比例为 7% 而不是 9% 探讨了 9% 和 7% 两种有机相比例的可行性, 其都能运用在基 min 图 6 采用 Agilent Poroshell 12 EC-C18 色谱柱 (3. 75 mm,2.7 µm 粒径 ) 的 UHPLC 方法分离抗坏血酸柠檬酸和苯甲酸标准品于 Agilent 129 LC Infi nity 系统的方法上苯甲酸的检测限是.5 µg/ml, 定量限是.2 µg/ml(s/n =16), 这与用 Agilent 126 Infi nity LC 方法所获得的结果一致抗坏血酸的校准曲线呈线性, 如图 7 所示 1 mau 8 6 y = x R 2 = ppm 图 7 采用 Agilent 129 Infinity LC 系统分析得到抗坏血酸浓度在 1 µg/ml 到 225 µg/ml 呈线性 (5 ng 到 1125 ng 柱上量 ) 9

10 相关浓度水平的峰面积和保留时间偏差的 RSD(%) 计算与 HPLC 方法相同结果显示所有浓度水平的峰面积偏差的 RSD(%) 均小于 2.5%, 如图 8 所示保留时间偏差的 RSD(%) 均小于.5% 结论采用 Agilent Poroshell 12 EC-C18 色谱柱分离和定量分析了抗坏血酸柠檬酸和苯甲酸开发了一种部分验证的耗时 25 min 的分析方法采用该方法在少量基质干扰或无基质干扰的情况下定量分析了各种橙汁中抗坏血酸柠檬酸和苯甲酸的含量, 同时获得了 >9% 的回收率采用 Agilent 129 Infi nity LC 系统通过提高流速和采用更短的色谱柱将该方法有效地转换成一个用时仅 5 min 的 UHPLC 方法两种方法的线性和精密度均符合要求因此这两种方法均能用于橙汁质量控制中分析抗坏血酸柠檬酸和苯甲酸的含量 RSD (%) 图 8 UHPLC 方法用 RSD(%) 衡量峰面积的精密度, 每个浓度水平重复进样六次 1

11 参考文献 1. INCHEM chemical safety information for intergovernmental organization: documents/cicads/cicads/cicad26. htm#subsectionnumber: US FDA, Food contamination and adultration: Data on Benzene in Soft Drinks and Other Beverages Data through May 16, FoodContaminantsAdulteration/ ChemicalContaminants/Benzene/ ucm55815.htm 3. L.K Gardner, G.D Lawrence, Benzene Production from Decarboxylation of Benzoic Acid in the Presence of Ascorbic Acid and a Transition-Metal Catalyst, J. Agric. Food. Chem, 41: , K. Zerdine; M.L. Rooney; J Vermue, The Vitamin C Content of Orange Juice packed in an Oxygen Scavenger Material, Food Chemistry, 82: , L. Novakova; P. Solich; D. Solichova, HPLC methods for simultaneous determination of ascorbic acid and dehydroascorbic acids, Trends in Analytical Chemistry, 27: , S.A. Margolis; E. Park, Stability of Ascorbic Acid in Solutions Stored in Autosampler Vials, Clinical Chemistry, 47:

12 lc:cn 安捷伦科技 ( 中国 ) 有限公司, 年 9 月 1 日, 中国印刷出版号 CHCN

5989_5672.qxd

5989_5672.qxd 使用 HPLC Online SPE 方法分析复方甘草制剂中的吗啡应用甘草, 固相萃取, 二维液相色谱, 超高效液相色谱作者肖尧李浪安捷伦科技 ( 中国 ) 有限公司, 北京,100102 摘要目的 : 建立两种复方甘草制剂中吗啡成分测定的 Online SPE-UHPLC