第1期

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因房
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1 54 南京医科大学学报 ( 自然科学版 ) ACTA UNIVERSITATIS MEDICINALIS NANJING(Natural Science) 基础研究仪征地区鲍曼不动杆菌碳青霉烯类抗菌药耐药相关酶表型和基因型分析,2 江培涛, 方敏, 刘棵文, 马超, 王晶晶 2*, 严枫南京鼓楼医院集团仪征医院检验科, 江苏扬州 29; 2 南京医科大学附属肿瘤医院检验科, 江苏南京 209 [ 摘要 ] 目的 : 研究江苏省仪征地区鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类药物耐药相关酶表型和基因型的分布情况, 探讨该地区广泛耐药鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类耐药的主要机制方法 : 根据常规药敏试验结果将鲍曼不动杆菌临床分离株分为广泛耐药组和普通组, 分别选取 25 株和株用改良 EDTA 纸片增效法检测金属 β 内酰胺酶 ; 用碳青霉烯失活法检测碳青霉烯酶 ; 用双纸片协同试验法和三维试验法分别检测染色体和质粒介导的 AmpC 酶 ; 用 PCR 方法检测耐药基因 bla OXA bla OXA 24 bla TEM bla AmpC bla VIM bla NDM, 对部分产物进行测序比对结果 : 鲍曼不动杆菌广泛耐药组和普通组分别占 62.5% 和 37.5% 广泛耐药组中金属 β 内酰胺酶株碳青霉烯酶 4 株染色体和质粒介导的 AmpC 酶分别为株和株 ; 普通组中均未检出上述酶表型广泛耐药组全部检出耐药基因 bla OXA bla TEM bla AmpC, 均未检出 bla OXA 24 bla VIM bla NDM ; 普通组中 bla OXA bla OXA 24 bla TEM bla AmpC 分别检出株, 未检出 bla VIM bla NDM 两组比较, 质粒介导的 AmpC 酶和 bla OXA bla AmpC 基因携带率的差异具有统计学意义 (χ 2 分别为 ,P < 0) 基因测序结果发现部分菌株的序列存在碱基插入或置换的改变结论 : 鲍曼不动杆菌耐药性严重, 产质粒介导的 AmpC 酶和 bla OXA bla AmpC 基因介导的耐药机制是仪征地区鲍曼不动杆菌广泛耐药的主要机制 [ 关键词 ] 鲍曼不动杆菌 ; 碳青霉烯酶 ; 表型 ; 基因型 [ 中图分类号 ] R378 [ 文献标志码 ] A [ 文章编号 ] (209) doi:0.7655/nydxbns209 Phenotypic and genotypic analysis of carbapenems associated with antimicrobial resistance of Acinetobacter baumannii in Yizheng area Jiang Peitao,2,Fang Min,Liu Kewen,Ma Chao,Wang Jingjing,Yan Feng 2 Department of Clinical Laboratory,Yizheng Hospital of Nanjing Drum Tower Hospital Group,Yangzhou 29; 2 Department of Clinical Laboratory,the Affiliated Cancer Hospital of NMU,Nanjing 209,China [Abstract] Objective:To study the phenotypic and genotypic distribution of Acinetobacter baumannii in Yizheng area to carbapenem drug resistance,and to explore the main mechanism of carbapenem resistance of Acinetobacter baumannii. Methods:The clinical isolates of Acinetobacter baumannii were divided into two groups according to the results of routine drug sensitivity test. Twenty five strains of extensively drug resistant Acinetobacter baumannii(xdrab)and of common strains were selected to detect metal β lactamases by modified EDTA disk synergy method. Carbapenem was detected by carbapenem inactivation method,chromosome and plasmide mediated AmpC enzyme were detected by double disk synergy test and modified three dimensional test,and the resistant genes bla OXA,bla OXA 24,bla TEM,bla AmpC,bla VIM,and bla NDM were detected by PCR method,and some positive products were sequenced and compared. Results:The XDRAb group and the common group accounted for 62.5% and 37.5%,respectively. One strain of metal β lactamase,4 strains of carbapenemase,and strain of chromosome and strains of plasmide mediated AmpC enzyme were positive in the XDRAb group,but none of them were detected in the common group. The genes bla OXA,bla TEM,and bla AmpC were detected in all strains of XDRAb,and bla OXA 24,bla VIM,and bla NDM were not detected in all of them. In the normal group,4 strains of bla OXA,5 strains of bla OXA 24,22 strains of bla TEM and 2 strains of bla AmpC were detected respectively,while bla VIM and bla NDM were not detected in all strains. [ 基金项目 ] 江苏省医学创新团队暨领军人才基金通信作者 (Corresponding author),e mail:yanfeng27@sohu.com

2 江培涛, 方敏, 刘棵文, 等. 仪征地区鲍曼不动杆菌碳青霉烯类抗菌药耐药相关酶表型和基因型分析 [J]. 南京医科大学学报 ( 自然科学版 ),209,39(0): The difference of plasmid mediated AmpC enzyme,bla OXA,and bla AmpC gene carrying rate between the two groups was statistically significant(χ 2 =40.627,34.83,5.5,P < 0,respectively). The results of gene sequencing showed that the sequence of some strains was changed by base insertion or replacement. Conclusion:The drug resistance of Acinetobacter baumannii to carbapenem is serious in Yizheng area. The main mechanisms of Acinetobacter baumannii resistance to carbapenem are plasmide mediated AmpC enzyme,bla OXA and bla AmpC gene mediated drug resistance. [Key words] Acinetobacter baumannii;carbapenemase;phenotype;genotype [Acta Univ Med Nanjing,209,39(0):054 06] 鲍曼不动杆菌 (Acinetobacter baumannii,ab) 是医院内获得性感染的重要条件致病菌, 可导致医院获得性肺炎机械通气相关性肺炎导管相关性血流感染等多种类型的医院内感染近年来 Ab 对碳青霉烯类抗菌药物耐药率越来越高, 耐药情况不容忽视中国 CHINET 细菌耐药监测网数据显示, 年 Ab 对碳青霉烯类抗菌药物的耐药率从 3.0% 上升至 66.7%,205 和 206 年 Ab 对亚胺培南 (IPM) 和美罗培南 (MEM) 的耐药率分别为 62.0%/ 70.5% 和 68.6%/7.4% [ 3] 介导鲍曼不动杆菌耐药的机制复杂多样, 其中与碳青霉烯类耐药相关的主要有灭活酶或钝化酶的产生药物主动外排泵的作用膜 [4] 孔蛋白的异常表达或缺失等本研究旨在对江苏省仪征地区 ( 以下简称本地区 ) 检出的 Ab 耐药情况及由碳青霉烯酶介导的碳青霉烯类耐药机制进行分析, 为临床治疗和预防 Ab 感染提供理论依据材料和方法. 材料.. 菌株来源 28 株 Ab 临床分离株分别来自于南京鼓楼医院集团仪征医院和江苏省仪征市人民医院 206 年 7 月 207 年 2 月的门诊及住院患者, 排除同一病患不同时间的重复分离株其中标本来源 :ICU 49 株, 呼吸内科 22 株, 神经外科 32 株, 其他科室 25 株 ; 标本类型 : 痰液标本 97 株, 肺泡灌洗液 6 株, 尿液标本 9 株, 脓液 6 株, 血液标本 4 株, 伤口分泌物 3 株, 胸水 3 株药敏质控菌株 E.Coli ATCC25922 P.aeruginosa ATCC27853 和 A.baumannii ATCC9606 K.peneu moniae ATCC BAA 购自法国梅里埃公司..2 主要仪器与试剂 GHP 9270 数显隔水式恒温孵育箱 ( 上海精宏医疗器械厂 );MicroScan WalkAway 96 Plus 细菌鉴定药敏分析仪 ( 贝克曼公司, 美国 );THERMAL CY CLER 480 热循环仪 (PERKIN ELMER 公司, 美国 ); 天能 6 凝胶电泳图像分析系统 ( 上海天能公司 ); TGL 8R 冷冻高速离心机 ( 珠海 Hema 医学仪器公司 );NanoDrop 20 分光光度计 (THERMO 公司, 美国 ); 亚胺培南 (IPM) 美罗培南 (MEM) 头孢西丁 (FOX) 头孢噻肟 (CTX) 头孢他啶 (CAZ) 药敏纸片 (Oxoid 公司, 英国 ); 乙二胺四乙酸二钠 (EDTA Na 2) 磷酸盐缓冲液 (PBS)( 上海阿拉丁公司 );LB 肉汤 ( 杭州百思生物技术公司 ); 水解酪蛋白 (MH) 琼脂 ( 杭州滨河生物技术公司 ); 细菌基因组 DNA 提取试剂盒 PCRMasterMix TaqDNA 聚合酶及 MgCl 2 dntps 0Xbuffer DNAMarker( 北京 TIANGEN 生化科技公司 ); 琼脂糖 ( 广州赛国生物科技公司 ) 引物合成与 PCR 产物测序 ( 南京思普金生物工程公司 ).2 方法.2. 鲍曼不动杆菌的鉴定和药敏试验所有菌株的常规鉴定和药敏试验均由 Mi croscan WalkAway 96 Plus 系统完成通过 PCR 方法扩增 blaoxa 5 like 基因并测序, 测序结果经 BLAST 比对, 结合生化反应鉴定结果进而确定为 Ab 抗菌药物敏感性试验采用微量肉汤稀释法, 结 [5] 果判断参照 CLSI206 版标准执行根据中国鲍曼不动杆菌感染诊治与防控专家共识 [6] 将以上菌株中仅对替加环素和 ( 或 ) 多黏菌素敏感的菌株定义为广泛耐药鲍曼不动杆菌 (extensively drug resis tant A. baumannii,xdr Ab) 进而抽取碳青霉烯类耐药的 XDR Ab 25 株 ( 编号为 XDR2 至 XDR45) 和碳青霉烯类敏感的普通 Ab(NXDR Ab) 株 ( 编号为 N 至 N) 进行后续实验.2.2 金属 β 内酰胺酶的检测参照文献 [7 9] 用改良 EDTA 纸片增效法检测金属 β 内酰胺酶 (MBLs), 具体步骤如下 : 用灭菌棉签将 0.5 麦氏浊度的待检菌悬液均匀涂布于水解酪蛋白 (MH) 琼脂培养基上, 然后贴两片 CAZ(30 μg) 或 IPM(0 μg) 药敏纸片, 二者间隔 0~5 mm; 配制 5 mol/l EDTA 溶液, 在其中片上滴加 0 μl

3 56 南京医科大学学报用 FOX(30 μg) 和不含抗菌药的空白纸片做及空白对照 36 恒温培养 8~24 h 后观察结果, 滴加过 EDTA 的纸片抑菌环直径比不加的扩大 3 mm 以上, 或形成矢状生长的现象即为.2.3 碳青霉烯酶的检测参照文献 [0] 采用碳青霉烯失活法 (CIM) 检测碳青霉烯酶 ; 用 K.peneumoniae ATCC BAA 生理盐水和 LB 肉汤浸泡的 MEM 纸片 (0 μg) 分别作空白和本底对照结果判断 : 若 Ab 产碳青霉烯酶, 则纸片上的 MEM 被水解, 失去对 ATCC25922 的抑制作用, 纸片周围形成直径 6~ 5 mm 的抑菌圈或直径为 6~8 mm 但可见抑菌圈内有散在菌落, 则判为 ; 反之, 纸片上 MEM 不被水解,ATCC25922 生长受抑制而呈现直径 9 mm 抑菌圈, 则判为.2.4 染色体和质粒型 AmpC 酶的检测双纸片协同试验法检测染色体介导的 AmpC 酶 : 将 0.5 麦氏浊度的待检细菌均匀涂布于 MH 琼脂培养基上, 然后分别贴上含量均为 30 μg 的 FOX 和 CTX 纸片, 二者相距 5~20 mm 36 孵育过夜后观察结果,CTX 抑菌环邻近 FOX 侧出现 D 样截平现象即为参照文献 [] 用 -70 与 37 反复冻融提取并用三维试验检测质粒型 AmpC 酶.2.5 耐药基因的检测及测序按照细菌基因组 DNA 提取试剂盒 ( 离心柱型 ) 操作说明提取细菌基因组 DNA, 检测 DNA 纯度, 波长 260 nm 和 280 nm 下吸光度比值在.7~.9 范围内方可接受根据 GenBank 核酸数据库中耐药基因 bla OXA bla OXA 24 bla TEM bla AmpC bla VIM bla NDM 的序列用 Prim er5.0 软件设计引物, 并委托南京思普金生物技术公司合成 ( 表 ) PCR 反应体系 (20 μl):dna 模板 2 μl; 上下游引物 (20 μmol/l) 各 μl;2 Taq PCRMas termix 0 μl; 灭菌 ddh 2O 6 μl PCR 反应条件 : 95 预变性 5 min;95 变性 30 s,55 复性 20 s, 72 延伸 50 s,35 个循环 ; 最后 72 延伸 0 min PCR 扩增产物经含 0.5 μg/ml 溴化乙啶 (EB) 的 % 琼脂糖凝胶电泳, 在凝胶成像仪下观察结果并拍照.2.6 基因测序将凝胶电泳明显的 PCR 扩增产物根据耐药表型检测结果抽取部分送南京思普金生物技术表 PCR 引物序列 Table Primer sequences of PCR 目的基因引物名称引物序列 (5 3 ) 产物长度 (bp) bla OXA OXA F ACCCCGAGTCAGATTGTTCAAGG 606 OXA R CCAGCCCACTTGTGGTTTTATAT bla OXA 24 OXA 24F GTCCCTGCATCAACATTTAAGATGC 477 OXA 24R CACCCAACCAGTCAACCAACCTACCT bla TEM TEM F CAGAAACGCTGGTGAAAG 70 TEM R AACTACGATACGGGAGGG bla AmpC AmpC F GCCTGGTAAGTATTGGAAAG 696 AmpC R CCGAAACGGTTAGTTGAGCC bla VIM VIM F CCGTAGAAGAACAGCAAGGG 593 VIM R CCATCGGCAATCTGGTAAAG bla NDM NDM F CATTGGCGGCGAAAGTCA 92 NDM R CTCGCACCGAATGTCTGGC bla OXA 5 OXA 5 F ATGAACATTAAAGCACTCTTAC 825 OXA 5 R CAGAATGGGAAAAGGACATGA 公司进行双向测序, 所得序列用工具软件 DNA STAR 拼接后与美国生物技术信息中心基因库 ( 中相关序列进行一致性比对, 以明确 Ab 是否携带相关耐药基因, 并查找有无错义突变.3 统计学方法用 WHONET5.6 软件对 Ab 临床分离株常规药敏结果进行分析 ; 用 SPSS2 软件对计数资料率的比较进行 χ 2 检验分析, 以 P 5 为差异有统计学意义 2 结果 2. 药敏试验结果 28 株 Ab 临床分离株中广泛耐药菌株 (XDR Ab)80 株 (62.5%), 普通菌株 (NXDR Ab)48 株

江培涛方敏刘棵文等. 仪征地区鲍曼不动杆菌碳青霉烯类抗菌药耐药相关酶表型和基因型分析 J. 南京医科大学学报自然科学版 209 39 0 054-06 37.5% 具体耐药情况见表 2 2.

2 mm 图 B 其中 0 株 XDRAb 和 9 株普通 Ab 采表2 57 用 IPM 纸片其抑菌圈直径 XDRAb 为 6 ± 5 mm 普通 Ab 为 32 ± 4 mm 4 株 XDRAb 和 4 株普通 Ab 采用 CAZ

菌圈图 D 两组结果比较见表 3 28 株 Ab 临床分离株常见药物耐药情况 Table 2 Drug resistance of 28 clinical isolates of Ab 抗菌药物 XDR Ab n=80 R 阿米卡星

3 0 2.5 0 9.7 0 6.7 B 75.0 2.5 8.3 0 20.8.2 20.8 6.7 60.4 0 5 0 6.7 39.6 0 妥布霉素 60.4 0 0 98.8 左氧氟沙星 0 0 复方新诺明 39.

3 C D A 滴加 EDTA 的抑菌圈扩大并形成矢状生长 B 滴加 EDTA 的抑菌圈直径扩大 2 mm C 滴加 EDTA 的 FOX 纸片 D 滴加 EDTA 的空白纸片图部分菌株金属β 内酰酶检测结果 Figure

3 碳青霉烯酶的检测结果 25 株 XDR Ab 中编号为 XDR24 26 43 45 的菌株碳青霉烯酶表现为 MEM 药敏纸片周围无抑菌圈现象另株普通 Ab 均未检测出碳青霉烯酶 MEM 纸片周围形成明显

4 江培涛方敏刘棵文等. 仪征地区鲍曼不动杆菌碳青霉烯类抗菌药耐药相关酶表型和基因型分析 J. 南京医科大学学报自然科学版 % 具体耐药情况见表金属β 内酰酶检测结果改良 EDTA 纸片增效法检测 MBLs 结果显示编号为 XDR2 的菌株出现图 A 所示滴加 EDTA 后抑菌圈扩大 3 mm 以上并形成矢状生长的现象表现为其余菌株均为但可见抑菌圈平均扩大 ~ 2 mm 图 B 其中 0 株 XDRAb 和 9 株普通 Ab 采表2 57 用 IPM 纸片其抑菌圈直径 XDRAb 为 6 ± 5 mm 普通 Ab 为 32 ± 4 mm 4 株 XDRAb 和 4 株普通 Ab 采用 CAZ 纸片其抑菌圈直径 XDRAb 为 9 ± 2 mm 普通 Ab 为 22 ± 3 mm 对照显示滴加 EDTA 的 FOX 纸片形成直径 2 mm 的抑菌圈图 C 滴加 EDTA 的空白纸片形成直径 0 mm 的抑菌圈图 D 两组结果比较见表 3 28 株 Ab 临床分离株常见药物耐药情况 Table 2 Drug resistance of 28 clinical isolates of Ab 抗菌药物 XDR Ab n=80 R 阿米卡星 I 庆大霉素亚胺培南 0 美罗培南 0 头孢噻肟 0 头孢吡肟 0 哌拉西林环丙沙星 0 四环素 0 S 为敏感 I 为中介 R 为耐药为无此折点 A B 妥布霉素左氧氟沙星 0 0 复方新诺明 39.6 多黏菌素哌拉西林/他唑巴坦 S 0 I 头孢他定 R 0 头孢唑林 S 98.8 % NXDR Ab n= C D A 滴加 EDTA 的抑菌圈扩大并形成矢状生长 B 滴加 EDTA 的抑菌圈直径扩大 2 mm C 滴加 EDTA 的 FOX 纸片 D 滴加 EDTA 的空白纸片图部分菌株金属β 内酰酶检测结果 Figure Detection of metallic β lactamase in some strains 2.3 碳青霉烯酶的检测结果 25 株 XDR Ab 中编号为 XDR 的菌株碳青霉烯酶表现为 MEM 药敏纸片周围无抑菌圈现象另株普通 Ab 均未检测出碳青霉烯酶 MEM 纸片周围形成明显抑菌圈图 2A 但 XDR43 号菌株 MEM 抑菌圈直径为 2 mm 图 2B 为生理盐水和 LB 肉汤对照两组结果比较见表染色体和质粒型 AmpC 酶的检测结果 2.4. 双纸片协同试验结果在 25 株 XDR Ab 中编号为 XDR39 的菌株出现 A B A 碳青霉烯酶和结果 B 生理盐水和 LB 肉汤空白对照图 2 部分菌株碳青霉烯酶的检测结果 Figure 2 Detection results of carbapenemase of some strains

58 南京医科大学学报如图 3A 所示的截平现象表现为另 24 株 XDR Ab 及株普通 Ab 对 CTX 和 FOX 均表现为耐药且未出现抑菌圈表现为图 3B 两组结果比较见表 3 A 2.5 耐药基因的检测及测序结果 2.5. 碳青霉烯酶相关的 6 个目的基因的 PCR 检测结果在 25 株 XDR Ab

otypes of Ab XDR Ab 普通 Ab 检测项目 B n=25 n= A CTX 靠近 FOX 侧出现截平现象 B CTX 和 FOX 双纸片试验 MBLs Figure 3 碳青霉烯酶图3 部分菌株双纸片协同试验结果 Results of double disk synergistic test of some strains

blaoxa 24 blatem blaampc χ2 值 P值 0.0* 04 2.93 0.39*.0* 24 2 0 24 02 25 25 25 25 40.627 0* 04 34.83 0* 9 05 3.96 47* 22 0.479* 8 0 2 5.

碳青霉烯酶相关的 4 个基因 PCR 产物测序及比对结果选取编号为 XDR22 XDR24 XDR25 XDR43 的菌株进行 blaoxa 基因测序发现编号 XDR22 的菌株 XDR34 XDR36 2 3 4 5 6 25 株 XDR Ab 组中编号为 XDR30 32 34 36 的 4 个样本第到 6 对引物扩增结果 ~6

5 58 南京医科大学学报如图 3A 所示的截平现象表现为另 24 株 XDR Ab 及株普通 Ab 对 CTX 和 FOX 均表现为耐药且未出现抑菌圈表现为图 3B 两组结果比较见表 3 A 2.5 耐药基因的检测及测序结果 2.5. 碳青霉烯酶相关的 6 个目的基因的 PCR 检测结果在 25 株 XDR Ab 和株普通 Ab 中均未检出 MBLs 相关耐药基因 blavim blandm 其余 4 个目的基因的检测结果见表 3 部分菌株的耐药基因 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳结果见图 5 表3 Table 3 Ab 各类酶表型及相关基因型检测结果 Detection of enzyme phenotypes and related gen otypes of Ab XDR Ab 普通 Ab 检测项目 B n=25 n= A CTX 靠近 FOX 侧出现截平现象 B CTX 和 FOX 双纸片试验 MBLs Figure 3 碳青霉烯酶图3 部分菌株双纸片协同试验结果 Results of double disk synergistic test of some strains 2. 三维试验结果在 25 株 XDR Ab 中编号为 XDR2 和 XDR39 的 2 株在 FOX 抑菌圈边缘与切缝交界处未出现缺损表现为其余株 XDR Ab 均表现为图 4A 另株普通 Ab 均未出现缺损表现为阴性图 4B 两组结果比较见表 3 A 染色体介导 AmpC 酶质粒介导 AmpC 酶 blaoxa blaoxa 24 blatem blaampc χ2 值 P值 0.0* *.0* * * * * * *表示此数据为 Fisher 精确概率法计算所得表示无卡方值 B A XDR Ab 三维试验结果 B 普通 Ab 三维试验结果图 4 部分菌株三维试验结果 Figure 4 Three dimensional test results of some strains Marker XDR30 XDR 碳青霉烯酶相关的 4 个基因 PCR 产物测序及比对结果选取编号为 XDR22 XDR24 XDR25 XDR43 的菌株进行 blaoxa 基因测序发现编号 XDR22 的菌株 XDR34 XDR 株 XDR Ab 组中编号为 XDR 的 4 个样本第到 6 对引物扩增结果 ~6 分别对应 blaoxa blaoxa 24 blatem blaampc blavim blandm Marker 大小为 2 0 bp 各条带碱基数 bp 从左至右依次为图5 部分菌株的耐药基因 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳结果 Figure 5 Agarose gel electrophoresis of PCR products of drug resistance genes in some strains

江培涛, 方敏, 刘棵文, 等. 仪征地区鲍曼不动杆菌碳青霉烯类抗菌药耐药相关酶表型和基因型分析 [J].

N7 的菌株进行 bla AmpC 基因测序发现编号 XDR43 的菌株在第 673 位出现碱基 G C 置换, 编号 N7 的菌株总共出现 4 处碱基置换其余基因序列未发现碱基改变 ( 编号为 N7 的菌株 bla AmpC 基因测序及比对结果见图 6~8) 3 讨论鲍曼不动杆菌是一种广泛存在于病房环境和人体皮肤以及呼吸道的不发酵糖类的专性需氧革兰氏球杆菌, 是引起医院感染尤其是各类 ICU

5%, 该结果与国内多中心联 [- 3] 合调查结果一致本研究未发现全耐药 Ab (PDR Ab) β 内酰胺酶是很多细菌产生的一种通过裂解 β 内酰胺环而使抗生素的抗菌活性减弱或消失的灭活酶 MBLs 的活性中心含金属 Zn 2+ 离子, 属于 Am bler 分子结构分类法中的 B 类本研究用改良 EDTA 双纸片增效法检测 MBLs 结果显示,XDR Ab 和普通 Ab

6 江培涛, 方敏, 刘棵文, 等. 仪征地区鲍曼不动杆菌碳青霉烯类抗菌药耐药相关酶表型和基因型分析 [J]. 南京医科大学学报 ( 自然科学版 ),209,39(0): 在第 8 位碱基 (G) 插入 ; 选取编号为 N9 N N2 N3 的菌株进行 bla OXA 24 基因测序发现编号 N2 的菌株在第 457 位碱基 (G) 插入 ; 选取编号为 XDR2 XDR39 N N2 的菌株进行 bla TEM 基因测序未发现碱基序列改变 ; 选取编号为 XDR39 XDR43 N6 N7 的菌株进行 bla AmpC 基因测序发现编号 XDR43 的菌株在第 673 位出现碱基 G C 置换, 编号 N7 的菌株总共出现 4 处碱基置换其余基因序列未发现碱基改变 ( 编号为 N7 的菌株 bla AmpC 基因测序及比对结果见图 6~8) 3 讨论鲍曼不动杆菌是一种广泛存在于病房环境和人体皮肤以及呼吸道的不发酵糖类的专性需氧革兰氏球杆菌, 是引起医院感染尤其是各类 ICU 患者获得性感染的重要病原菌近年来 Ab 的耐药趋势越来越严重, 本研究收集的菌株中碳青霉烯类耐药的 XDR Ab 占临床分离 Ab 的 62.5%, 碳青霉烯类敏感的普通 Ab 占 37.5%, 该结果与国内多中心联 [- 3] 合调查结果一致本研究未发现全耐药 Ab (PDR Ab) β 内酰胺酶是很多细菌产生的一种通过裂解 β 内酰胺环而使抗生素的抗菌活性减弱或消失的灭活酶 MBLs 的活性中心含金属 Zn 2+ 离子, 属于 Am bler 分子结构分类法中的 B 类本研究用改良 EDTA 双纸片增效法检测 MBLs 结果显示,XDR Ab 和普通 Ab 两组差异无统计学意义 ( 精确概率法 P=.0) 据此推测在介导本地区广泛耐药 Ab 的碳青霉烯类耐药机制中, 产 MBLs 并不起主要作用另外本研究通过比较 MBLs 株 IPM 抑菌圈的大小以及空白对照, 发现滴加 EDTA 的抑菌圈比未滴加的平均增大 2~3 mm, 这说明 EDTA 本身具有一定抑菌作用碳青霉烯酶是能够水解至少一种碳青霉烯类抗菌药的一类 β 内酰胺酶, 按前述结构分类法包括 A B D 等 3 类其中 A 类酶常见于一些肠杆菌科细 Figure 6 图 6 编号为 N7 的菌株 bla AmpC 基因正向测序部分峰图 Partial peak map of bla AmpC gene forward sequencing of N7 strain 图 7 编号为 N7 的菌株 bla AmpC 基因部分碱基序列比对图 Figure 7 Alignment of partial Base sequence of bla AmpC gene of N7 strain Figure 8 图 8 编号为 N7 的菌株 bla AmpC 基因编码氨基酸序列比对图 Sequence alignment of amino acid sequence encoding bla AmpC gene of N7 strain

7 60 南京医科大学学报菌, 与 D 类同为丝氨酸酶,B 类为金属酶, 可由转座子质粒或染色体介导本研究用 CIM 法检测碳青霉烯酶 :XDR Ab 组 4 株表现为, 而普通 Ab 组均为, 二者差异无统计学意义 (χ 2 =2.39 P= 0.39) AmpC 酶属于上述分类法中的 C 类, 故又称 AmpC β 内酰胺酶, 通常由细菌的染色体或质粒介导其特点是能水解头孢菌素但棒酸不能抑制其活性 AmpC 酶可根据产生方式分为 3 类 : 与 β 内酰胺类抗生素的存在无关但可持续少量产生的持续低产酶 ; 与 β 内酰胺类抗生素的存在有关的诱导型高产酶, 该酶通常由染色体介导 ; 与 β 内酰胺类抗生素的存在无关但可持续大量产生的持续高产酶持续高产 AmpC 酶的产生通常是由于细菌质粒介导产生去阻遏突变, 该突变使调控基因编码的蛋白质 [2-3] 功能表达异常, 进而引起 AmpC 酶的大量表达 ; 该酶可引起耐药菌株在临床流行, 而且此类病原菌往往表现为多重耐药, 治疗起来相当棘手故检测 AmpC 酶对于临床诊断和治疗此类细菌感染以及流行病学调查具有重要意义本研究用三维试验检测质粒型 AmpC 酶, 结果显示 25 株 XDR Ab 中, 除编号为 XDR2 XDR39 的菌株外均产生质粒型 AmpC 酶 ; 结合改良 EDTA 纸片增效法和双纸片协同试验结果发现 XDR2 产 MBLs 而 XDR39 产生染色体型 AmpC 酶 ; 株普通 Ab 组染色体和质粒型 AmpC 酶均为在上述两种 AmpC 酶中, 两组菌株在质粒型 AmpC 酶的检出率差异有统计学意义 (χ 2 = ,P<0), 说明质粒型 AmpC 酶是本地区 Ab 广泛耐药的主要机制结合本研究菌株来源分布主要以 ICU 等科室为主, 而且 XDR Ab 的检出率高达 62.5%, 推测由质粒介导并持续高产 AmpC 酶是目前本地区 Ab 主要的流行方式和耐药机制 TEM 型酶在我国 Ab 中普遍存在, 导致包括 [4] IPM 在内的 β 内酰胺类抗生素发生高耐药率 OXA 型 D 类碳青霉烯水解酶在 Ab 中最常见, 包括固有的 OXA 5 型水解酶和获得性水解酶 OXA [5] 及 43 型在 Ab 中发现的 MBLs 酶主要有 VIM IMP 和 SIM 型,NDM 近几年才被陆续 [6-7] 报道本研究在检测碳青霉烯酶相关表型的基础上分析与其相关的 6 个耐药基因, 结果显示 TEM 基因在 XDRAb 和普通 Ab 两组中的携带率分别为 0% 和 95.7%(P=0.479), 差异无统计学意义, 表明 TEM 基因介导的超广谱酶虽然广泛流行于各类 Ab 中, 但不是导致其形成广泛耐药的主要机制 AmpC 基因两组中的携带率分别为 0% 和 52.2% (χ 2 =5.5,P<0), 差异有统计学意义, 说明 AmpC 基因介导的耐药机制是本地区 XDRAb 对碳青霉烯类抗菌药物耐药的主要机制之一该结果也进一步印证了双纸片协同试验法和改良三维试验法检测 Ab 染色体和质粒型 AmpC 酶得出的结论 OXA 基因在两组中的表达率分别为 0% 和 7.4%(χ 2 =34.83,P<0),OXA 24 基因在两组中的表达率分别为 % 和 2.7%(χ 2 =3.96,P= 47), 差异均有统计学意义, 该结果说明在获得性碳青霉烯水解酶介导的耐药机制中,OXA 基因 [5,8-9] 编码的水解酶起主要作用, 这与文献报道一致综合比较 CIM 方法检测碳青霉烯酶表型和 PCR 方法检测 OXA 基因型结果, 可以发现两组 Ab 中表型检测的率均明显低于基因型, 甚至会得出相互矛盾的结论, 分析其原因可能与 CIM 方法检测肠杆菌科细菌 KPC 型碳青霉烯酶的敏感性高, 而检测 Ab 等其他菌属 OXA 型 NDM 型碳青霉烯酶时敏感性低有关 [5] 因此, 在检测不动杆菌等非发酵菌碳青霉烯酶表型时, 不推荐用 CIM 方法在两组 Ab 中, 均未检出 MBLs 相关耐药基因 VIM NDM, 而编号为 XDR2 的菌株 MBLs 表型, 推测该菌株所产生的 MBLs 为 IMP 或 SIM 型之一, 该结果也说明 MBLs 介导的耐药机制在本地区 Ab 对碳青霉烯类耐 [20] 药过程中不起主导作用这与丁梦珊等所报道徐州地区 MBLs 相关耐药基因 IMP 检出率高达 86.8% 差异较大导致地区差异的原因可能与实验技术或菌株自身的遗传学差异有关, 尚有待进一步研究根据碳青霉烯酶表型及基因型检测结果挑选 6 株 Ab 进行相关基因测序并与 GenBank 相应核酸序列比对发现同源性均达 98%~% bla OXA 基因测序发现编号 XDR22 的菌株在第 8 位碱基 (G) 插入, 提交基因库比对氨基酸序列显示位于第 3 位的甘氨酸被丝氨酸所取代 ;bla OXA 24 基因测序发现编号 N2 的菌株在第 457 位碱基 (G) 插入, 比对氨基酸序列未发现改变 ;bla TEM 基因测序未发现碱基序列改变, 同源性为 % ;bla AmpC 基因测序发现编号 XDR43 的菌株在第 673 位出现碱基 G C 置换, 比对氨基酸序列发现使第 225 位氨基酸由甘氨酸改变为精氨酸 ; 编号 N7 的菌株总共出现 4 处碱基置换, 比对氨基酸序列未发现改变比较两组菌株氨基酸序列结果发现,XDR Ab 组氨基酸改变明显多于普通 Ab 组, 进而推测耐药基因编码氨基酸的改变程

8 江培涛, 方敏, 刘棵文, 等. 仪征地区鲍曼不动杆菌碳青霉烯类抗菌药耐药相关酶表型和基因型分析 [J]. 南京医科大学学报 ( 自然科学版 ),209,39(0): 度可能与其耐药性的增强呈正相关 [ 参考文献 ] [] 胡付品年 CHINET 中国细菌耐药性监测网 5 种重要临床分离菌的耐药性变迁 [J]. 中国感染与化疗杂志,207,7():93-99 [2] 胡付品, 朱德妹, 汪复, 等. 205 年 CHINET 细菌耐药性监测 [J]. 中国感染与化疗杂志,206,6(6): [3] 胡付品, 郭燕, 朱德妹, 等. 206 年中国 CHINET 细菌耐药性监测 [J]. 中国感染与化疗杂志,207,7(5): [4] Rumbo C,Gato E,López M,et al. Contribution of efflux pumps,porins,and β lactamases to multidrug resistance in clinical isolates of Acinetobacter baumannii[j]. Antimi crob Agents Chemother,203,57(): [5] Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing;twenty sixth informational supplement(m S26)[S].CLSI, 206 [6] 陈佰义, 何礼贤, 胡必杰, 等. 中国鲍曼不动杆菌感染诊治与防控专家共识 [J]. 中华医学杂志,202,92(2): [7] 何友华, 姚庆完. EDTA 纸片增效试验检测鲍曼不动杆菌金属 β 内酰胺酶 [J]. 国际检验医学杂志,205,36 (5): [8] Lee K,Lim YS,Yong D,et al. Evaluation of the Hodge test and the imipenem EDTA double disk synergy test for differentiating metallo beta lactamase producing isolates of Pseudomonas spp. and Acinetobacter spp[j]. J Clin Microbiol,,4(0): [9] Yong D,Lee K,Yum JH,et al. Imipenem EDTA disk method for differentiation of metallo beta lactamase pro ducing clinical isolates of Pseudomonas spp. and Acineto bacter spp[j]. J Clin Microbiol,22,40(0): [0] van der Zwaluw K,de Haan A,Pluister GN,et al. The car bapenem inactivation method(cim),a simple and low cost alternative for the Carba NP test to assess phenotypic carbapenemase activity in gram negative rods[j]. PLoS One,205,0(3):e0690 [] Coudron PE,Moland ES,Thomson KS. Occurrence and de tection of AmpC beta lactamases among Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae,and Proteus mirabilis isolates at a veterans medical center[j]. J Clin Microbiol,20,38 (5): [2] Zorgani A,Daw H,Sufya N,et al. Co occurrence of plas mid mediated AmpC β lactamase activity among Klebsiel la pneumoniae and Escherichia coli[j]. Open Microbiol J, 207,(): [3] Babouee FB,Ellington MJ,Hopkins KL,et al. The differ ential importance of mutations within AmpD in cephalo sporin resistance of Enterobacter aerogenes and Enterobac ter cloacae[j]. Int J Antimicrob Agents,206,48(5): [4] 刘赫, 多丽波. 鲍曼不动杆菌 A 类碳青霉烯酶的研究进展 [J]. 中国抗生素杂志,205,40(4): [5] 陈艺升, 高晶, 张灏旻, 等. 质粒介导的鲍曼不动杆菌 blaoxa 耐药基因研究 [J]. 中华检验医学杂志,207, 40():36-40 [6] Ghazawi A,Sonnevend A,Bonnin RA,et al. NDM 2 car bapenemase producing Acinetobacter baumannii in the United Arab emirates[j]. Clin Microbiol Infect,202,8 (2):E34-E36 [7] Chen Y,Zhou Z,Jiang Y,et al. Emergence of NDM pro ducing Acinetobacter baumannii in China[J]. J Antimi crob Chemother,20,66(6): [8] Kuo SC,Huang WC,Huang TW,et al. Molecular Epide miology of emerging blaoxa Like and blaoxa 24 Like carrying Acinetobacter baumannii in Taiwan[J]. An timicrob Agents Chemother,208,62(3):e0257 [9] Hajjar SM,Dahdouh E,Daoud Z,et al. Phenotypic and ge notypic detection of β lactamases in Acinetobacter spp. iso lates recovered from Lebanese patients over a year peri od[j]. J Glob Antimicrob Resist,208,2:07-2 [20] 丁梦珊, 蔡蕊, 花璇, 等. 耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌碳青霉烯酶耐药基因及整合子检测与分析 [J]. 临床检验杂志,206,0(34): [ 收稿日期 ]

目录一 2014 年全院 5533 株细菌分布及前 10 位主要细菌耐药性结果二按照标本类型 ( 或感染部位 ) 进行的病原菌构成及药敏分析 1 呼吸道标本病原菌构成及药敏分析 2 尿液标本病原菌构成及药敏分析 3 血流骨髓标本病原菌构成及药敏分析 4 皮肤软组织标本病原菌构成及药敏分析 5

目录一 2014 年全院 5533 株细菌分布及前 10 位主要细菌耐药性结果二按照标本类型 ( 或感染部位 ) 进行的病原菌构成及药敏分析 1 呼吸道标本病原菌构成及药敏分析 2 尿液标本病原菌构成及药敏分析 3 血流骨髓标本病原菌构成及药敏分析 4 皮肤软组织标本病原菌构成及药敏分析 5 2014 年安医大一附院病原菌分布及药物敏感性分析编者 : 沈继录编审 : 王中新徐元宏 1 目录一 2014 年全院 5533 株细菌分布及前 10 位主要细菌耐药性结果二按照标本类型 ( 或感染部位 ) 进行的病原菌构成及药敏分析 1 呼吸道标本病原菌构成及药敏分析 2 尿液标本病原菌构成及药敏分析 3 血流骨髓标本病原菌构成及药敏分析 4 皮肤软组织标本病原菌构成及药敏分析 5 伤口引流液标本病原菌构成及药敏分析