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1 中国热带医学 7 年第 7 卷第 期 China Tropical Medicine,November 7,Vol.7,No. 多重耐药肺炎克雷伯杆菌外排泵 AcrABTolC 的研究 论著 方法 摘要 : 目的 李佛萧 *, 刘向群. 徐州医科大学, 江苏徐州 ;. 徐州医科大学附属徐州市立医院, 江苏徐州 探讨 AcrABTolC 外排泵系统在多重耐药肺炎克雷伯杆菌中的表达情况及对其耐药性的影响 采用 VITEK Compact 全自动微生物鉴定及药敏分析系统对临床分离菌进行鉴定及药敏分析, 收集多重耐药菌 株 ; 采用微量肉汤稀释法测定药物最低抑菌浓度 (minimal inhibitant concentration, MIC) 及其逆转实验对多重耐药肺炎克 雷伯杆菌进行外排泵表型检测 ; 利用荧光定量 PCR 测定外排泵 acrb 基因的表达情况 结果 3 株多重耐药肺炎克雷 伯菌在应用外排泵抑制剂羰基氰氯苯腙 (carbonyl cyanide mchlorophenylhydrazone, ) 后,9 株 (3.%) 对庆大霉素 的 MIC 值下降至原值的 / 或 / 以下 ;3 株 (.%) 对阿莫西林 / 棒酸的 MIC 值下降至原值的 / 或 / 以下 ; 株 (6.67%) 对头孢吡肟的 MIC 值下降至原值的 / 或 / 以下 ; 株对左氧氟沙星 (.%) 的 MIC 值下降至原值的 / 或 / 以下 ;5 株 (.67%) 对环丙沙星的 MIC 值下降至原值的 / 或 / 以下 3 株 (76.67%) 外排泵表型阳性, 荧光定量 PCR 结果显示 株 (93.33%) 高表达 acrb 基因 结论 药的重要机制之一 关键词 : 肺炎克雷伯杆菌 ; 多重耐药 ; 外排泵 外排泵 AcrABTolC 的表达增强可能是肺炎克雷伯杆菌多重耐 中图分类号 :R 文献标识码 :A 文章编号 :9977(7)5 DOI:.36/j.cnki.6/r.7..5 Study on expression of active efflux pump AcrABTolC involved in multidrug resistant Klebsiella pneumoniae LI Foxiao, LIU Xiangqun. Xuzhou Medical University, Xuzhou, Jiangsu, China Corresponding author: LIU Xiangqun, hxlxq6@sina.com Abstract: Objective To investigate the expression of efflux pump AcrAB TolC involved in multidrug resistant Klebsiella pneumoniae and its effect on antibiotic resistance. Methods With VITEK compact automatic bacteria identification system, all strains of K. pneumonia were identified and the susceptibility to antibiotics was analyzed and the multidrug resistant strains were collected. The efflux pump phenotypes of multidrug resistant K. pneumoniae were texted with the antibiotics minimal inhibitory concentration (MIC) and reversion experiments. The mrna expression of pump encoding gene acrb in the strains was detected by using quantitative real time RT PCR. Results Of the 3 multidrug resistant K. pneumoniae strains, after adding carbonyl cyanide m chlorophenylhydrazone (), all of the MICs values of antibiotics tested decreased by 5% or more when compared to the former for instance, 9 strains (3.%) against gentamicin; 3 strains (.%) against amoxicillin/clavulanic acid; strains (6.67%) against cefepime; strains (.%) against levofloxacin; 5 strains (.67%) against ciprofloxacin. Twentythree strains (76.67%) strains showed positive results in the assay, and quantitative realtime RTPCR showed (93.33%)strains overexpressing acrb gene. Conclusion AcrABTolC efflux pump in K. pneumoniae is an important mechanism resulting in multidrug resistance. Key words: Klebsiella pneumonia; multidrug resistance; efflux pump The high expression of 肺炎克雷伯杆菌 (Klebsiella pneumoniae,kpn) 是人类呼吸道及肠道的定植菌, 可以引起肺炎 尿路感染 败血症 菌血症 腹泻等相关感染性疾病, 是社区获得性和医院内感染的主要致病菌之一 KPN 引起的医院感染率逐年增高, 约占所有革兰氏阴性菌的 [] % 以上, 且多耐药肺炎克雷伯杆菌的不断增加常常导致抗菌药物治疗的失败 住院时间延长甚至死亡率的增高, 因而如何治疗这类多耐药或泛耐药的 KPN 相关感染已成为临床医师的巨大挑战 外排泵系统 的高度表达是 KPN 获得多重耐药的重要机制 迄今为止, 在 KPN 中发现的外排泵有 AcrABTolC Oqx AB KexD KmrA KpnGH KdeA KpnEF [], 其中属于抗药小结分裂区 (RND) 家族的 AcrABTolC 在肠杆菌科中检出率最高,KPN 对 β 内酰胺类 喹诺酮类 氯霉素及替加环素的敏感性下降与外排泵 AcrABTolC 相 [3 5] 关 本研究探讨外排泵 AcrABTolC 在多重耐药 KPN 临床菌株中的表达及其对耐药性的影响, 为临床治疗多重耐药 KPN 相关的感染提供新思路 作者简介 : 李佛萧 (99 ), 女, 在读硕士, 研究方向 : 呼吸系统感染及耐药机制 * 通信作者 : 刘向群, hxlxq6@sina.com

2 中国热带医学 7 年第 7 卷第 期 China Tropical Medicine,November 7,Vol.7,No. 材料与方法. 菌株 年 9 月 7 年 月期间徐州市中心医院 徐州矿务局总院及徐州市第一人民医院 3 家三级医院检验科微生物室培养出的肺炎克雷伯杆菌 细菌培养严格按照全国临床检验操作规程中临床微生物常规鉴定程序操作 经分离培养后细菌鉴定采用法国生物梅里埃公司的 VITEK Compact 全自动微生物鉴定及药敏分析系统进行菌种鉴定并行药敏分析 随机选取 3 株多重耐药肺炎克雷伯杆菌作为实验菌株, 筛选标准为对 3 类或 3 类以上抗菌药物均耐药, 为多重耐药菌 质控菌株为阴沟肠杆菌 ATCC 73. 体外抗菌药物最低抑菌浓度及其逆转实验实验中所用的抗菌药物庆大霉素 (gentamycin, GM) 阿莫西林 / 棒酸 (amoxicillin / clavulanic acid, AMC) 头孢吡肟 (cefepime, FEP) 左氧氟沙星 (levofloxacin,lev) 环丙沙星 (ciprofloxacin, CIP) 亚胺培南 (imipenem, IMP) 购自中国药品生物制品检定所 羰基氰氯苯腙 () 购自 Sigma 公司 采用微量肉汤稀释法测定各药物最低抑菌浓度 (MIC), 判断标准依据美国临床实验室标准化协会 (Clinical and Laboratory Standards Institute, CLIS) 颁布的准则, 质控菌株为大肠杆菌 ATCC 59 加入 ( 终浓度 μg/ml) [5] 后再次测定菌株的 MIC 以加入 的 MIC 值比不加降低 倍或以上 [6] 作为外排泵表型阳性的判定标准.3 细菌 RNA 的提取和逆转录使用 Trizol 法提取细菌 RNA 并用紫外分光光度计测算 A 6 和 A 值, 计算核酸纯度和浓度 逆转录应用 RevertAid First Strand cdna Synthesis Kit 试剂盒按照说明书进行 Trizol RevertAid First Strand cdna Synthesis Kit DNase I 购自 Thermo Fisher Scientific 公司. 荧光定量 PCR 外排泵内膜蛋白 acrb 基因和内 [7] 参基因 rpob 引物参照文献, 引物由武汉转导生物科技发展有限公司合成 引物序列 引物长度 产物长度见表 实时定量 PCR 在 CnFX Conect 荧光定 量 PCR 检测系统中完成, 每个样品均为 3 个重复, 实 用 Power SYBR Green PCR Master Mix 试剂盒进行, 反应体系共 μl, 为 SYBR Green PCR Master Mix 5 μl ddh O μl 引物 (F R) μl cdna.5 μl; 反应程序为 : 预变性 95 3 min, 个循环 (95 变性 s,55 退火 s,7 延伸 s), 溶解 曲线从 65 升至 95.5 数据分析方法肺炎克雷伯菌 ATCC33 作为 参照菌株,rpoB 基因为管家基因, 在 KPN 中恒定表达, 作为内参基因, 根据 CT 方法计算 ( 以 标准菌株 ATCC33 的 mrna 的表达水平为., 其 他菌株的表达水平以相对于标准菌株的数值表示结 果, 大于 表示表达增加 ) 引物名称 Primer rpob F rpob R acrb F acrb R 结果 表 Table 序列 (5 3 ) Sequence(5 3 ) qrtpcr 引物序列 Primers used in qrtpcr CGTATCGTAAAGTGACCGACG GGCCGTTTTCATCCAGGTTG CTGCCGTCACTGGAAATCC CATCCCGGTCCAGTCGTAG 引物长度 Primer length/bp. 体外药敏试验及逆转实验结果 3 株多重耐药 KPN 临床菌株在应用 后,9 株 (3.%) 对 GM 的 MIC 值下降至原值的 / 或 / 以下, 株 (6.67%) 恢复 了对 GM 的敏感性 ;3 株 (%) 对 AMC 的 MIC 值下降 至原值的 / 或 / 以下, 株 (3.33%) 恢复了对 AMC 的敏感性 ; 株 (6.67%) 对 FEP 的 MIC 值下降至原 值的 / 或 / 以下,6 株 (.%) 恢复了对 FEP 的敏 感性 ; 株 (.%) 对 LEV 的 MIC 值下降至原值的 / 或 / 以下 ;5 株 (.67%) 对 CIP 的 MIC 值下降至 原值的 / 或 / 以下, 株 (3.33%) 恢复了对 CIP 的敏 感性 3 株 (76.67%) 外排泵表型阳性 见表. acrb 基因 qrtpcr 结果 acrb 和 rpob 荧光定 9 9 产物长度 Product length/bp 3 表 Table 加入 前后 3 株多重耐药肺炎克雷伯杆菌 MIC 的改变 MICs changes of 3 Klebsiella pneumoniae isolates with or without 菌株 MIC (μg/ml) 外排泵表型 Strain GM GM AMC AMC FEP FEP LEV LEV CIP CIP IMP IMP Efflux pump phenotype K / / K / / K3 / / K / /

3 中国热带医学 7 年第 7 卷第 期 续表 China Tropical Medicine,November 7,Vol.7,No. 3 菌株 MIC (μg/ml) 外排泵表型 Strain GM GM AMC AMC FEP FEP LEV LEV CIP CIP IMP IMP Efflux pump phenotype K5 / / K6 / / K7 / / K / / K9 / / 5 K / / K / / K / / K3 / / K / / K5 / / K / / K7 / / K / / K9 / / K / / K / /... K / / K3 / / K / /.65.. K5 / / K6 / / K7 / / K / / K9 / / K3 / /.65 量 PCR 结果中的熔解曲线除主峰外未见杂峰, 说明无 非特异性扩增, 扩增效果好, 用于定量研究分析结果 可信 qrtpcr 检测结果显示 株 (93.33%)acrB 基 因表达较内参基因 rpob 增加, 说明 AcrABTolC 在多 重耐药 KPN 中广泛存在,acrB 的见表 3 图,acrB 溶解及扩增曲线见图 图 3 表 3 acrb 的 Table 3 of acrb K K K K K K. K K K K K K. K K K K K K K K K K K K K K K K K K

4 中国热带医学 7 年第 7 卷第 期 China Tropical Medicine,November 7,Vol.7,No ACTT33 K K K3 K K5 K6 K7 K K9 K KKK3KK5KK7KK9KKKK3KK5K6K7 K K9 K3 图 acrb 的 Fig. of acrb d(rfu)/dt 温度 Temperature/ 图 acrb 的溶解曲线 Fig. Dissociation curve of acrb RFU 循环 Cycles 图 3 Fig. 3 acrb 的扩增曲线 acrb amplification curve 3 讨论 KPN 是人类呼吸道及肠道的常居菌, 也是社区获得性和医院内感染都相关的重要条件致病菌 近年 [9] 来 KPN 感染在医院内感染中比率持续上升, 对各种抗生素的耐药率以及多重耐药肺炎克雷伯杆菌 耐碳青霉烯类肺炎克雷伯杆菌甚至泛耐药肺炎克雷伯杆菌的检出率不断攀升, 使临床抗感染治疗面临巨大的困难 5 年中国 CHINET 耐药监测显示在耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌中, 以 KPN 为最多, 其对美罗培南 亚胺培南的耐药率高于 %, 各医院泛耐药肺炎克雷伯杆菌的总检出率高达 9.7% [] 细菌耐药一般为各种耐药机制协同作用的结果, 而对于多重耐药菌来说, 外排泵在其耐药性方面发挥了突出作用, 是 [] 最为重要的机制 AcrABTolC 是目前被广泛研究的一种外排泵系统, 它主要由膜融合蛋白 AcrA 内膜 蛋白 AcrB 和外膜蛋白 TolC 三部分组成 有研究显示 [3] AcrA 与 AcrB 的表达存在相关性, 因此常常作为一个整体研究, 而 TolC 为其中的非特异性组分, 可在多个外排泵系统中发挥作用 AcrB 不仅可以特异性的摄取及转运特异的底物 ( 喹诺酮类 大环内酯类 β 内酰胺类等 ), 而且能为整个泵系统提供能量, 因此本实验选择对 acrb 基因进行荧光定量 PCR 实验检测其 AcrABTolC 与其他 RND 家族的外排泵一样, 是由质子驱动力为能源的, 而 作为一种实验室最常应用的外排泵抑制剂, 可以阻断外排泵的能量来源, 从而干扰外排泵对抗生素的主动泵出, 底物抗生素在细菌胞内浓度升高从而降低细菌对抗生素的 MIC 甚至恢复对药物的敏感性 本实验中药敏结果显示,3 株多重耐药的肺炎克雷伯临床菌株中有 3 株在使用 后出现了对

5 中国热带医学 7 年第 7 卷第 期 China Tropical Medicine,November 7,Vol.7,No. 5 一种或一种以上抗菌药的 MIC 明显下降,GM AMC FEP LEV CIP 加用 后 MIC 值下降至原值的 / 或 / 以下的菌株数分别为 9 株 (3.%) 3 株 (.%) 株 (6.67%) 株 (.%) 5 株 (.67%), 其中部分菌株对某些抗生素由耐药变为敏感, 提示在多重耐药的肺炎克雷伯菌中外排泵系统广泛存在, 可以有效逆转由外排泵介导的耐药作用 进一步用实时荧光定量 PCR 检测 acrb 基因的表达水平发现 株 (93.33%)acrB 基因表达较内参基因 rpob 增加, 且表达水平为标准菌株的数倍, 表明外排泵 AcrABTolC 的表达增强可能是肺炎克雷伯杆菌多 [] 重耐药的重要因素, 与国外研究报道一致 在本实验研究中,K 及 K 的外排泵表型阴性, 与 qrt PCR 的结果检测的 acrb 基因不表达或表达量相对较少相一致, 提示这两株 KPN 的多重耐药性与外排泵之外的其他机制相关, 如产生灭活酶或者钝化酶 靶位改变等 另外值得注意的是 K 的 acrb 基因表达量较标准菌株升高 倍以上, 但是 MIC 逆转实验为阴性, 考虑在此菌株中外排泵介导的耐药水平相较于其他机制可能为低水平耐药 KPN 的多重耐药机制复杂, 除 AcrABTolC 外排泵外, 可能有其他外排泵参与, 有待进一步研究 参考文献 [] 张晓妹, 田露, 范敏, 等. 肺炎克雷伯菌感染的临床分布及耐药性分析 [J]. 热带医学杂志, 5, 5(7): [] LI X Z, PLÉSIAT P, NIKAIDO H. The challenge of effluxmediated antibiotic resistance in Gram negative bacteria[j]. Clin Microbiol Rev, 5, (): 337. [3] BIALEKDAVENET S, LAVIGNE J P, GUYOT K, et al. Differential contribution of AcrAB and OqxAB efflux pumps to multidrug resistance and virulence in Klebsiella pneumoniae[j]. J Antimicrob Chemother, 5, 7():. [] YUHAN Y, ZIYUN Y, YONGBO Z, et al. Over expression of AdeABC and AcrAB TolC efflux systems confers tigecycline resistance in clinical isolates of Acinetobacter baumannii and Klebsiella pneumoniae [J]. Rev Soc Bras Med Trop,, 9(): 57. [5] ZHONG X, XU H, CHEN D, et al. First emergence of acrab and oqxab mediated tigecycline resistance in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae predating the use of tigecycline in a Chinese hospital[j]. PLoS ONE,, 9(): e55. [6] DENG M, ZHU M H, LI J J, et al. Molecular epidemiology and mechanisms of tigecycline resistance in clinical isolates of Acinetobacter baumannii from a Chinese University Hospital[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 3, 5(): [7] CAMPOS C B, AEPFELBACHER M, HENTSCHKE M. Molecular analysis of the ramra locus in clinical Klebsiella pneumoniae isolates with reduced susceptibility to tigecycline[j]. New Microbiol, 7, (): 353. [] HE Y, GUO X, XIANG S, et al. Comparative analyses of phenotypic methods and S rrna, khe, rpob genes sequencing for identification of clinical isolates of Klebsiella pneumoniae[j]. Antonie Van Leeuwenhoek,, 9(7): 9. [9] 黄洪琳, 易斌. 长期住院老年患者下呼吸道感染病原菌分布及耐药性分析 [J]. 实用预防医学, 7, (): 557. [] 伊怀文, 侯高林, 王刚. 某三甲医院多重耐药菌感染及分布 [J]. 热带医学杂志, 7, 7(7): 99. [] 胡付品, 朱德妹, 汪复, 等. 5 年 CHINET 细菌耐药性监测 [J]. 中国感染与化疗杂志,, (6): [] ZHONG H Q, ZHANG S, PAN H, et al. Influence of induced ciprofloxacin resistance on efflux pump activity of Klebsiella pneumoniae[j]. J Zhejiang Univ Sci B, 3, (9): 373. [3] PADILLA E, LLOBET E, DOMÉNECH SÁNCHEZ A, et al. Klebsiella pneumoniae AcrAB efflux pump contributes to antimicrobial resistance and virulence[j]. Antimicrob Agents Chemother,, 5(): 773. [] NAVON VENEZIA S, KONDRATYEVA K, CARATTOLI A. Klebsiella pneumoniae: a major worldwide source and shuttle for antibiotic resistance[j]. FEMS Microbiol Rev, 7, (3): 575. 收稿日期 :7 编辑 : 王佳燕

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