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堪莉晏
5 years ago
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1 ICS X 04 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 巴氏杀菌乳和 UHT 灭菌乳中复原乳的鉴定 Identification of reconstituted milk in pasteurized and UHT milk 发布实施中华人民共和国农业部发布

2 前言本标准的第 4 章为强制性条文, 其余为推荐性条文本标准的附录 A 和附录 B 为资料性附录本标准由中华人民共和国农业部提出本标准由全国畜牧业标准化技术委员会归口本标准起草单位 : 中国农业科学院畜牧研究所本标准主要起草人 : 王加启卜登攀魏宏阳李树聪于建国郭宗辉付宝华周凌云刘世军黄萌萌刘光磊

3 巴氏杀菌乳和 UHT 灭菌乳中复原乳的鉴定 1 范围本标准规定了巴氏杀菌乳和 UHT 灭菌乳中复原乳的鉴定和相应的检测方法本标准适用于巴氏杀菌乳和 UHT 灭菌乳中复原乳的鉴定 2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款凡是注日期的引用文件, 其随后所有的修改单 ( 不包括勘误的内容 ) 或修订版均不适用于本标准, 然而, 鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本凡是不注日期的引用文件, 其最新版本适用于本标准 GB/T 婴幼儿配方食品和乳粉蛋白质的测定 GB/T 分析实验室用水规格和试验方法 ISO 5538:1987 乳和乳制品取样品质检验 3 术语和定义下列术语和定义适用于本标准 3.1 生乳 raw milk 从健康奶畜挤下的常乳, 仅经过冷却, 可能经过过滤, 但未经过巴氏杀菌低于巴氏杀菌的热处理净乳和其他的杀菌处理 3.2 复原乳 reconstituted milk 3.3 炼乳或 / 和全脂乳粉与水勾兑成的原料乳巴氏杀菌 pasteurilization 经低温长时间 (62 ~65, 保持 30min) 或经高温短时间 (72 ~76, 保持 15s; 或 80 ~ 85, 保持 10s~15s) 的处理方式 3.4 超高温瞬时灭菌 UHT 经 135 以上保持数秒的处理方式生乳经 UHT 灭菌处理后, 乳果糖含量应该低于 600mg/L 4 复原乳的鉴定 4.1 巴氏杀菌乳 1

4 当巴氏杀菌乳每 100g 蛋白质中糠氨酸含量大于 12mg 时, 则鉴定为含有复原乳 4.2 UHT 灭菌乳当 UHT 灭菌乳发生下列情况之一时, 则鉴定为含有复原乳 : a)w t > 190; 式中 : W 待测 UHT 灭菌乳样品中每 100g 蛋白质中所含糠氨酸的毫克数 ; t 待测 UHT 灭菌乳贮存天数 ; 0.7 待测 UHT 灭菌乳每贮存一天每 100g 蛋白质中产生的糠氨酸毫克数 b) 当 UHT 灭菌结束时乳每 100g 蛋白质中糠氨酸含量为 140mg~190mg 时, 乳果糖含量 (mg/l) 与糠氨酸含量 ( 每 100g 蛋白质所含毫克数 ) 比值小于 2 5 试验方法 5.1 糠氨酸含量的测定原理牛奶在加热过程中会发生梅拉德反应, 使蛋白质和糖生成特定产物之一糠氨酸 (ε-n-2- 呋喃甲基 -L- 赖氨酸 ) 糠氨酸的含量利用高效液相色谱紫外 (280nm) 检测器测定, 依据糠氨酸标准物质定量试剂与材料除非另有说明, 在分析中仅用分析纯试剂和 GB/T6682 中一级水甲醇 (CH 3 OH): 色谱纯, 用 0.45μm 滤膜真空脱气过滤高纯度氮气 :99.99% mol/L 盐酸溶液 mol/L 盐酸溶液三氟乙酸 ( 色谱纯 ) 溶液 : 体积分数为 0.1% 糠氨酸 (furosine)( ε-n-(2- 呋喃甲基 )-L- 赖氨酸 ) 标准贮备溶液 : 将糠氨酸标准物用 3mol/L 盐酸溶液 ( ) 配制成 200μg/mL 的标准贮备液, 该标准贮备溶液在 -20 C 可贮存 24 个月糠氨酸标准工作溶液 : 取 0.1mL 标准贮备溶液 ( ), 用 3mol/L 盐酸溶液 ( ) 定容至 10mL, 配制成 2μg/mL 的糠氨酸标准工作溶液仪器和设备检测实验室常用仪器设备高效液相色谱仪, 带有梯度系统,UV- 检测器凯氏定氮仪 2

5 C18 萃取柱,500mg 硅胶色谱柱 : 颗粒大小 5μm, 柱直径 4.6 mm, 长 250mm 干燥箱 :110 C ± 2 C 带螺盖耐热试管, 或者其他能够密封的耐热试管 : 容积为 20mL 注射器 :10mL 采样取代表样 250mL 送往实验室, 样品不应受到破坏或者在转运和贮藏期间发生变化采样参照 ISO5538:1987 执行分析步骤试样水解液的制备吸取 2.00mL 试样, 置于带密闭的耐热试管 ( ) 中, 加入 6mL 的 10.6mol/L 盐酸溶液 ( ), 混匀向试管中缓慢通入高纯度氮气 ( )1min~2min, 密闭试管, 然后将其置于干燥箱 ( ) 中, 在 110 C 下加热水解 23h~24h 加热约 1h 后, 轻轻摇动试管加热结束后, 将试管从干燥箱中取出, 冷却后干过滤, 保留滤液供测定试样水解液中蛋白质含量的测定吸取 2.00mL 试样水解液 ( ), 按 GB/T 测定试样溶液中蛋白质含量试样水解液中糠氨酸含量的测定试样水解液的纯化将 C18 萃取柱 ( ) 安装在注射器上, 先后分别用 5mL 甲醇和 10mL 水润湿萃取柱, 保持萃取柱湿润状态吸取 0.500mL 试样水解液于萃取柱, 用注射器 ( ) 缓慢推入 C18 萃取柱内吸取 3mol/L 盐酸溶液洗脱萃取柱中的样品至 3 ml 测定 1) 色谱条件 :C18 硅胶色谱柱,250mm 4.6mm,5μm 粒径, 柱温 32 2) 洗脱液 :0.1% 三氟乙酸溶液 ( ) 为洗脱液 A, 甲醇 ( ) 为洗脱液 B 3) 洗脱梯度 : 见表 1 序号时间 min 表 1 洗脱梯度流量 ml/min 洗脱液 A % 洗脱液 B % ) 测定 : 利用洗脱液 A 和洗脱液 B 的混合液 (50:50), 以 1mL/min 的流速平衡色谱系统注 3

6 入 20μL~50μL 的 3 mol/l 盐酸溶液平衡柱子, 以检测溶剂的纯度注入 10μL 待测溶液测定糠氨酸含量每测定 10 个样品后测定一次标准工作溶液 ( ), 以校准仪器糠氨酸的出峰时间应该在 8min~10min( 参见附录 A 和附录 B) 结果计算糠氨酸含量以样品质量分数 W 计, 数值以每 100g 蛋白质中所含毫克数表示, 按如下公式计算 : W b D = 100 (1) m 式中 : W 样品中每 100g 蛋白质中糠氨酸的含量, 单位为毫克 (mg); b 样品水解液中糠氨酸浓度, 单位为微克每毫升 (μg/ml); D 测定时稀释倍数 (D=6); m 样品水解液中蛋白质浓度, 单位为毫克每毫升 (mg/ml) 计算结果精确到小数点后一位精密度在重复性条件下获得两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 5% 5.2 乳果糖含量的测定原理牛奶在加热处理过程中, 部分乳糖异构为乳果糖, 经 β-d- 半乳糖苷酶水解后生成半乳糖和果糖, 通过酶法测定产生的果糖量计算牛乳中乳果糖含量试剂与材料除非另有说明, 在分析中仅用分析纯试剂和 GB/T6682 中一级水碳酸氢钠 (NaHCO3) 过氧化氢 (H2O2), 质量分数为 30% 辛醇 (C8H18O) 灭菌水 g/L 硫酸锌溶液 g/L 亚铁氰化钾溶液 mol/l 氢氧化钠溶液 (NaOH) 4

7 mol/l 氢氧化钠溶液 (NaOH) 缓冲液 A:pH=7.5 称 4.8g 磷酸氢二钠 (Na2HPO4),0.86g 磷酸二氢钠 (NaH2PO4 H 2O) 和 0.1g 硫酸镁 (MgSO4 7H2O) 溶解于 80mL 水中, 用 1mol/L 氢氧化钠溶液调整 ph 到 7.5±0.1(20 ), 稀释到 100mL, 摇匀缓冲液 B:pH=7.6 称取 14.00g 三乙醇胺 [N(CH2CH2OH)3HCl] 和 0.25g 硫酸镁 (MgSO4 7H2O) 溶解于 80mL 水中用 1mol/L 氢氧化钠溶液 ( ) 调整 ph 到 7.6±0.1(20 ), 稀释到 100mL, 摇匀缓冲液 C 将 40.0mL 缓冲液 B 用水稀释到 100mL, 摇匀 β-d- 半乳糖苷酶悬浮液用 3.2mol/L 硫酸铵溶液将活性为 30IU/mg 的 β-d- 半乳糖苷酶 (EC ) 制备成浓度为 5mg/mL 的悬浮液葡萄糖氧化酶悬浮液用灭菌水将活性为 200IU/mg 的葡萄糖氧化酶 (EC ) 制备成浓度为 20mg/mL 悬浮溶液过氧化氢酶悬浮液用灭菌水将活性为 65000IU/mg 的过氧化氢酶 (EC ) 制备成浓度为 20mg/mL 的悬浮液己糖激酶 / 葡萄糖 -6- 磷酸脱氢酶悬浮液在 1mL 浓度为 3.2mol/L 硫酸铵溶液中加入 2mg 活性为 140IU/mg 的己糖激酶 (EC ) 和 1mg 活性为 140IU/mg 的葡萄糖 -6- 磷酸脱氢酶 (EC ), 轻摇均匀, 成悬浮液磷酸葡萄糖异构酶悬浮液用 3.2mol/L 硫酸铵溶液将活性为 350IU/mg 的磷酸葡萄糖异构酶 (EC ) 制备成浓度为 2mg/mL 的悬浮液 ATP 溶液将 50mg 5 -ATP-Na2 和 50mg 碳酸氢钠 ( ) 溶于 1mL 水中 NADP 溶液将 10mg β-nadp-na2 溶于 1mL 水中 5

8 5.2.3 仪器和设备检测实验室常用仪器设备水浴或干燥箱 : 温度能维持在 40 ± 分光光度计, 能在 340nm 波长处检测采样同分析步骤试液制备量取 50.0mL 样品到 100mL 容量瓶中, 用水稀释到刻度后混匀纯化吸取 10.0mL 试液 ( ) 于 50mL 锥形瓶中, 依次加入 1.75mL 亚铁氰化钾溶液 ( ) 1.75mL 硫酸锌溶液 ( ) 和 6.5mL 缓冲液 A( ) 每加入一种溶液后, 充分振荡均匀全部溶液加完后, 静置 10min, 过滤, 弃去最初的 1mL~2mL 滤液, 收集滤液水解乳糖和乳果糖吸取 5.00mL 滤液于 10mL 容量瓶中, 加入 50μL 的 β-d- 半乳糖苷酶悬浮液 ( ), 混匀后加盖在 40 水浴或干燥箱培养至少 10h 葡萄糖氧化依次加入 2.0mL 缓冲液 C( ) 100μL 葡萄糖氧化酶悬浮液 ( ) 1 滴辛醇 ( ) 0.5mL 浓度为 0.33mol/L 氢氧化钠溶液 ( ) 50μL 过氧化氢 ( ) 和 0.1mL 过氧化氢酶悬浮液 ( ), 每加入一种试剂均要摇匀全部溶液加完后, 在 40 水浴或干燥箱中培养 3h 冷却后稀释至 10mL, 过滤, 弃去最初的 1mL~2mL 滤液, 收集滤液空白依照到步骤处理空白溶液, 但不加 β-d- 半乳糖苷酶悬浮液 ( ) 测定测定步骤见表 2 比色皿中依次加入 : 缓冲液 B( ) ATP 溶液 ( ) NADP 溶液 ( ) 滤液 ( ) 水表 2 测定步骤步骤空白样品 0.100mL 0.100mL 0.100mL 0.100mL 6

9 混合均匀后, 静置 3min 加入己糖激酶 / 葡萄糖 -6- 磷酸脱氢酶悬浮液 ( ) 20μL 20μL 混合均匀, 等反应停止后 ( 约 10min), 记录吸光值 Ab1 As1 加入磷酸葡萄糖异构酶悬浮液 ( ) 20μL 20μL 混合均匀, 等反应停止后 (10min~15min), 记录吸光值 Ab2 Ab2 注 1: 以上反应均在同一比色皿中完成注 2: 如果 1mL 滤液吸光值增加超过 1.3, 则减少样品滤液取样体积, 注意增加水以保证比色皿中反应液总体积不变结果计算吸光值差样品吸光值差 ΔAs 的计算 : 空白吸光值差 ΔAb 的计算 : 样品净吸光值差 ΔAL 的计算 : 乳果糖含量 ΔAs=(As2-As1) (2) ΔAb=(Ab2-Ab1) (3) ΔAL=ΔAs-ΔAb (4) 乳果糖的含量以样品的质量浓度 c 计, 数值以毫克每升 (mg/l) 表示, 按下列公式计算 : 式中 : 精密度 ΔAL 样品净吸光值差 ; ML V1 400 c = ΔAL (5) ε d V V ML 乳果糖的摩尔质量 (342.3g/mol); ε NADPH 在 340nm 处的摩尔吸光值 (6.3 L mmol -1 cm -1 ); V1 比色皿液体总体积,V1=3.240mL; V2 比色皿中滤液的体积,V2=; d 比色皿光通路长度,d=1.00cm; V 测试样体积 (L) 计算结果精确到小数点后一位 2 在重复性条件下获得两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 5% 7

10 附录 A ( 资料性附录 ) 糠氨酸的分离图谱峰 AU 保留时间 (min) 注 : 横轴表示保留时间, 单位为分钟 (min); 纵轴表示吸光度 (AU); 峰 1 表示糠氨酸峰图 A.1 糠氨酸标准物图谱 8

11 附录 B ( 资料性附录 ) 巴氏杀菌乳样品中糠氨酸的分离图谱注 : 横轴表示保留时间, 单位为分钟 (min); 纵轴表示吸光度 (AU); 峰 1 表示糠氨酸峰图 B.1 巴氏杀菌乳中糠氨酸图谱 9

<4D F736F F D203534B8C9C0D2BCB0BCD3B9A4B8C9C0D2D6C6C6B7D6D0CCEDBCD3B5C4C4FBC3CACBE1D1CEB5C4B2E2B6A82E646F63>

<4D F736F F D203534B8C9C0D2BCB0BCD3B9A4B8C9C0D2D6C6C6B7D6D0CCEDBCD3B5C4C4FBC3CACBE1D1CEB5C4B2E2B6A82E646F63> 中华人民共和国国家标准 GB 22031 2010 食品安全国家标准干酪及加工干酪制品中添加的柠檬酸盐的测定 National food safety standard Determination of added citrate content in cheese and processed cheese products 2010-03-26 发布 2010-06-01 实施中华人民共和国卫生部