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1 和长链非编码! 在食管鳞癌中的表达及临床意义 刘磊 沈素朋 邝钢 梁佳 郭炜 董稚明 王佳磊 河北医科大学第四医院 河北石家庄 河北医科大学实验诊断教研室 河北石家庄 摘要 目的 检测食管鳞状细胞癌 (%)!'!# (*+! %+( ##!,"&%! -.. 组织中微小 /01 ",%/01 "/ 和长链非编码 /01.#%&' &%&%$"&' /01.#&/01. 的表达 探讨 "/ 和. 在 -.. 发生及发展中的作用机制 方法 应用实时荧光定量./,!#2" *+!&2"2!2"3 )%#4,!(!"&,!2"%&*/5./ 的方法检测 "/ 和. 在 例 -.. 组织中的表达情况及相关性 结果 -.. 组织中 "/ 的相对表达量显著高于相应癌旁组织 678 3(6829 : "/ 的相对表达量与 -.. 患者淋巴结转移有关 3(29:. 在 -.. 中的相对表达量显著低于相应癌旁组织 3( 29:. 的相对表达量与 -.. 患者淋巴结转移有关 3( 29 : 并且. 与 "/ 的相对表达量呈负相关,9: 结 "/ 在 -.. 中表达上调而. 表达降低 且两者之间有相关性 提示 "/ 与. 可能存在一定的调控作用 这一机制可能在 -.. 发生发展中起重要作用 关键词 食管癌 微小 /01 长链非编码 /01 淋巴结转移中图分类号 / 文献标识码 1 文章编号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长链非编码 /01#%&' &%&%$"&' /01#&/01 收稿日期 修回日期 基金项目 国家自然科学基金资助项目 河北省自然科学基金 通讯作者 董稚明!"#$%&'" "&'% 是一类转录本长度超过 ) 同时不编码蛋白质的 /01 分子 &/01 主要通过表观遗传修饰 转录和转录后调控 个层面调控基因的转录及表达 并参与基因组印迹及染色质修饰 转录激活 转 著

2 录后调控 蛋白功能调节等多种重要的信号转导过 程 尽管多数 的功能尚不明确 但是越来越多的研究表明 与肿瘤的发生发展关系密切 起着致癌或抑癌的作用 食管鳞状细胞癌!"! #$!%$!&'%! 中 亦发挥着重要功能 ()* 是利用转录组芯片从 组织及癌旁组织中 表达谱研究中筛选出来的 在 组织中 ()* 的表达下调 且经前期实验验证其在 组织中表达下降 本研究运用生物学信息软件预测可能靶向调控 ()* 的 %' 并结合芯片筛选数据选取能够与 ()* 结合的 %'+,- 进行研究 检测其在 中的表达状态及其与 ()* 的关系 分析其与患者临床病理资料间的关系 以期为寻找 临床诊断和治疗的分子靶点提供新思路 资料与方法 研究对象本研究所用组织标本均来自河北医科大学第四医院生物样本库.* 年保存的食管癌患者手术切除的 组织及相应癌旁组织 距癌组织边缘.% 共 例 其中 男性 ** 例 女性 例 年龄 *. 岁 中位年龄 岁 采集的每例标本一部分置于!/& 液中 0)1 冰箱中保存 用于 和 的提取 肿瘤组织及癌旁组织均经常规的病理诊断证实 按照国际抗癌联盟的标准进行 分期 期 例 + 期 例 *+ 期, 例 *) 期 例 + 按照 肿瘤病理学分级标准 2 年版 进行分级 高分化患者 例 + 中低分化 *) 例 全部患者术前均未进行化疗和放疗 所有研究对象对本研究均签署知情同意书 本研究经河北医科大学第四医院伦理委员会批准 主要试剂总 提取试剂盒 购自德国 345 公司 反转录试剂盒购自美国 46'/&" 公司 %' 第一链合成试剂盒购自 45 生化科技有限公司 %' 荧光定量检测试剂盒购自 45 生化科技有限公司 7 引物由生工生物 工程 上海 股份有限公司 靶向调控 ()* 的 %' 预测前期实验结果显示 ()* 在 中 表达下降且可能与其基因启动子区甲基化有关 但是在部分未发生甲基化的癌组织中 ()* 仍有表达降低 推测 ()* 在 中低表达除受启动子区甲基化的调节外 可能还有其它转录后水平的调控机制 因此选取 例经检测甲基化阴性的 组织进行研究 应用生物信息学软件 48! 9:::;%'&&!;"&-! 和 %' 9/:::;%'&;&" 预测可能靶向调控 (22)*2 的 %'+,- #7 法检测 组织中 %'+,- 的表达按 提取试剂说明书提供的方法提取 例 及癌旁组织的总 按反转录试剂盒说明书提供的步骤将 反转录合成 %' 对应的 第一链 按照配套荧光定量检测试剂盒说明书设计上游引物 %'+,- 的上游引物序列为 * 反向引物及内参 由试剂盒提供 荧光定量 7 反应条件,+ 预变性 %'7 循环中模板变性,+ 变性 22 退火 *+ 退火 延伸 共 +2 个循环 于 / $ 7 扩增仪上机检测 利用溶解曲线验证 7 反应的特异性 读取 / 值 采用 / 9/ / %'+,- / 法计算 %'+,- 在癌组织及相应癌旁组织中的相对表达量 所有实验均重复 * 次 取 * 次结果的平均值为实验结果 #7 法检测 (22)*2 在 组织中的表达按反转录试剂盒说明书提供的步骤将 反转录成 以此 为模板进行 7 扩增 检测 (22)*2 的表达 (22)*2 正向引物序列为 55* 反向引物序列为 55555* 内参照 57 的正向引物序列为 * 反向引物序列为 * 7 反应条件,+ *2,+ 变性 2*2 共 +2 个循环 读取 / 值 采用 / 9/ / (22)*2 / 57 法计算 (22)*2 在癌组织及相应癌旁组织中的相对表达量 +2 著

3 统计学处理采用 */ 软件对本研究的结果数据进行统计分析 表达量以 表示 两基因间的相关性用 *!" 相关系数表示 *// 表示差异有统计学意义 结果 生物信息软件在线预测与 //()/ 结合的 $ %2 我们应用 $ %:! 和 22 在线预测可能靶向 //()/ 的 $ %2 软件预测到 $ % &' 与 //()/ 有结合位点 并且结合 例 组织中基因芯片的数据结果 选出 $ %&' 作为候选基因进行研究 $ %&' 在 组织中的表达及其与临床病理资料的关系 %+ *% 法检测 及相应癌旁组织中 $ %&' 的表达水平 结果显示 组织中!" #$%&' ()*( + $ %&' 的表达水平显著高于相应癌旁组织... 4//)&//) *<.. ": =:" 分析. 例 患者的临床病理资料 +, 0 发现 $ %&' 的表达水平与患者的淋,- " "! #$%&' -. /0 1 +$$ 巴结转移情况有关 有淋巴结转移组患者的肿瘤组织中 $ %&' 的表达. 0." 0- "! 0,- " "! #$%&'. )* 水平显著高于无淋巴结 /0 0 "-.0""!. "! 1 -. 转移组 4..)'..006!"!# $ %&'!"!# () 4..)...'6.(* * *.. 而与患者 + 分 +!, -.)&/-0) '-0 1('0 / " 期 病理分级及性别和年, )) //)0//0) -0(-0 龄等无关 *.. 0-' &) $, 0 -)-0& -0-0)..(). 在 组织中的表达及其 0 //))//0& ///////0) //'& /' /' /' 0 ) //)&//0) ///0'///00 与临床病理资料的关系 5$7 "! $ %+*% 检测结果 8 ) //)'//00 ///0///0/ /( //// /&/ //&' 3 ) 显示 组 0( //)///' ///)///0& 织中..(). 的表 9!,!3 :, 3 ;,, 0 //)////( ///)///0) 达量显著低于相应癌旁 0&& / 0( /0 *!!,5 )( //)//0& ///0///0 组织 4...0' &6 ('0 8 0' //'//0) //////0 0) /0' 0'&' /// *<..0 分析. 例 8 )0 //)//0 ///0//// %,!"!# $ %&'..(....&.. 著 &.

4 患者的临床病理资料 发现 的表达水平与患者的淋巴结转移情况有关 有淋巴结转移组患者的肿瘤组织中 的表达水平显著低于无淋巴结转移组!"#$%#$& '!# #$#%%(%#%) 而与患者 *+ 分期 病理分级及性别和年龄等无关 (# 1 )./0,- 组织中./0) 与 %% % 的相关性 (1 相关分析结果显示 /1 & %% % 与./0) 间的表达呈负相关 1%#)(2%#% %% % 0/' ;1/ %% % %#$ %#%$ %#%%$ %#%%%$ $ %% *,+ (2!, :7 %#%$%%%% %#%%%%% %#% %%%% %#%%%%% %#%%%%% %#%%%%% %#%%%%%! "#$%& ' ()* +,- 讨 食管癌是人类常见的恶性肿瘤之一 在全球范围内 食管癌在恶性肿瘤中的发病率和死亡率分别 位居第 位和第 位 我国的食管癌病理类型以,- 为主 是全球食管癌发病率和死亡率最高的国家 尤其是我省的磁县和涉县更是食管癌的高发区 我省在磁县 涉县等地也投入了大量的财政资金进行食管癌的流行病学调查 病因学研究及内镜普查等防治工作 寻找早期诊断和治疗的新靶点对降低,- 的发生率和死亡率具有重要意义 近年来随着研究的不断深入 非编码 0*3 40*3 不再被认为是基因组转录的 噪音 根据转录本的长度 长度 5%% 的命名为长链非编码 2 %% 的命名为短链非编码 40*3 在肿瘤的表达差异及在肿瘤发生发展过程中的作用被广泛研究 40*3 主要通过基因组印记及染色质修饰 转录激活 转录后调控和蛋白功能等参与多种重要的信 号转导过程 这些功能的调节异常或一些 40*3 的激活可能导致肿瘤的发生 67 等报道 在鼻咽癌中 40*3 +,8 表达下调 且体外实验结果显示 +,8 对细胞增殖 克隆形成有显著抑制作用 可能在鼻咽癌中扮演抑癌基 1#)(2# 因的角色 9 等通过检测 例非小细胞肺癌及相应癌旁组织中 40*3 生长停滞特异性基因 反义./0) 0*3$ 1:611;4//4 / 0*3 $ 83-3-$ 的表达情况 发现肺癌组织中 83-3-$ 呈低表达 且与患者的淋巴结转移和远处转移呈负相关 虽然越来越多的研究表明 40*3 在人类多种肿瘤中表达异常并与肿瘤的发生发展有关 但其在肿瘤中异常表达的机制尚未明确 +/0*3 是长约 $ 的短链非编码 0*3 有研究 著

5 表明 在 的发生发展中起重要作用 & 年!"#$% 等提出竞争性内源 ' 的假说 $!' 可能作为 ' 通过竞争性结合 反应元件从而调节基因表达 因此 靶向调控 $!' 的发现可能为肿瘤发生发展机制的研究提供新的分子途径!' ( 经实验验证其在 组织中的表达显著低于相应癌旁组织 且其启动子区富含 )* 岛 经检测 ( 在 组 织中呈高甲基化状态 且与其表达降低有关 但是在部分未发生甲基化的癌组织中 ( 仍有表达降低 推测 ( 在 中低表达除受启动子区甲基化的调节外 可能还有其它转录后水平的调控机制 目前关于 ( 在 中作用及机制尚未见报道 我们应用生物学信息软件预测 预测可能靶向调控 ( 的 并结合 例 组织芯片的数据结果选取 +&, 进行下一步实验 实验结果显示 +&, 在 组织中的表达量显著高于相应癌旁组织 与组织芯片 表达谱中 +&, 在癌组织中高表达结果相一致 +&, 的表达与 患者的淋巴结转移情况有关 提示 +&, 可能与 的转移有关 并且高表达 +&, 的 组织中 ( 表达下调 两者在 组织中的表达具有相关性 近来研究表明 $!' 表达可能还受到 的调控 通过结合 $!' 的序列从而起到直 接调控 $!' 表达的作用 -!. 等研究发现在胰腺癌中 $!' /0(1* 表达升高 &(, 可以靶向抑制其表达 &(, 对 /0(1* 有直 接靶向调控作用!. 等发现在乳腺癌中 可能以类似调控 表达的方式直接靶向抑制 * 的表达 这些关于 $!' 和 调控作用的研究为研究肿瘤的发生机制提供了新的理基础 综上所述 本研究检测 +&, 在 组织中高表达 ( 表达下降 且两者有一定相关性 可能对 ( 有靶向调控作用 在后续研究中应进一步检测其对细胞功能及两者间的直接调控作用 有望扩展 发生过程中潜在的基因调节网络 为 发生机制的研究提供理基础 参考文献 1# 2 $3 4 $#!.!#!'#"!. 1!2!!"5' 25#6 )6#.6#!!" 2!!2!!'! '67' $ '!'6 3!'# )5, " #% )6!2! 5-82 $3 9)6#!!" 2:$ 2#! 2 25 #% (.!! #). $ ;5 #5 '$$ ' 6'!#!" 26 6$ 2#!) 2 '$!' $ ) 2# $#.' $ % 2563! #56! $ #%!'6 8#26 ): +&3 沈素朋 刘胜男 师雅斌 等 3 长链非编码 ( 在食管鳞状细胞癌中的表达和甲基化状态及其与临床病理特征的关系 3 中国肿瘤生物治疗杂志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著 ++

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