孕烷 X 受体 (pregnane X receptor, PXR) 属于核受体 (nuclear receptors, NRs) 超家族的一员, 是一个配体依赖性的转录调节因子 [1] 配体激活后的 PXR 进入细胞核, 与视黄醛 X 受体 (retinoid X receptor, RXR) 形

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何吕
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1 SUMO 特异性蛋白酶 1 (SENP1) 对 hpxr 调控 P-gp 基因表达的影响 *1 李樱媚, 许晨舒, 黎张燕, 陈孝 ( 中山大学附属第一医院药学部, 广州 ) 关键词 : 孕烷 X 受体 ; P- 糖蛋白 ; 小类泛素化蛋白 ; SUMO 特异性蛋白酶 1 中图分类号 : R966 文献标识码 : A 文章编号 : (2015) Effects of SUMO specific protease 1(SENP1) on hpxr-mediated P-gp gene expression LI Ying-mei, XU Chen-shu, LI Zhang-yan, CHEN Xiao (Department of Pharmacy, The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou, ) Abstract: The study aimed to investigate the effects of SUMO specific protease 1 (SENP1) on human PXR-mediated MDR1 transcriptional activity and mrna expression. Empty vector and expression plasmids, including PXR, SENP1 and SENP1 mutant (SENP1m) were transiently transfected into HepG2 and LS174T cells using Lipo2000. Transcriptional activity was detected by dual luciferase reporter gene assay, and mrna level was measured using real-time polymerase chain reaction. The results showed that SENP1 could remarkably reduce the rifampicin (RIF)-induced MDR1 reporter activity and mrna level in hpxr over expressed HepG2 and LS174T cells (P<0.05), whereas adding SENP1m restored the RIF-induced increases (P<0.05). These results indicated that SENP1 could repress the RIF-induced hpxr-mediated MDR1 transcriptional activity and mrna expression. Key words: pregnene X receptor; P-glycoprotein; SUMO protein; SUMO specific protease 1 收稿日期 : ; 修回日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 ( ). * 通讯作者 Tel: , frankwychen@hotmail.com

2 孕烷 X 受体 (pregnane X receptor, PXR) 属于核受体 (nuclear receptors, NRs) 超家族的一员, 是一个配体依赖性的转录调节因子 [1] 配体激活后的 PXR 进入细胞核, 与视黄醛 X 受体 (retinoid X receptor, RXR) 形成异二聚体, 随后结合到靶基因的 PXR 反应元件上, 进而介导该基因的转录表达 PXR 下游靶基因的表达产物主要是一类与外源性药物及内源性物质代谢转运相关的酶及蛋白, 包括 I 相代谢酶如 CYP3A CYP2B 和 CYP2C,II 相代谢酶如 UGT 和 GST,III 相药物转运蛋白如 P- 糖蛋白 (P-gp) MRP 和 BCRP 等 [2] 作为 ATP 结合盒 (ATP-binding cassette, ABC) 转运蛋白超家族的一员,MDR1 (P-gp 的编码基因 ) 是 PXR 最重要的靶基因之一 P-gp 在药动学与肿瘤耐药机制方面发挥了重要作用一方面, 它可影响药物的药动学过程, 其介导的某些口服药物的肠肝循环, 提高了药物的生物利用度 ; 另一方面,P-gp 的高表达是临床上常见肿瘤多药耐药性产生比较经典的机制因此, 研究 P-gp 的诱导或抑制具有重要临床意义小类泛素修饰蛋白 (small ubiquitin-related modifier, SUMO) 是一类蛋白质翻译后修饰分子, 包括 SUMO1 SUMO2 SUMO3 和 SUMO4 四种亚型 SUMO 化修饰是指一个或多个 SUMO 分子与底物蛋白通过共价连接形成复合物, 而 SUMO 分子在复合物发挥相应的功能后可以从靶蛋白上游离出来, 实现去 SUMO 化 [3] 在这个动态可逆的过程中,SUMO 蛋白酶 (SUMO-specific proteases, SENPs) 发挥了重要的作用一方面, 催化 SUMO 前体的成熟, 启动 SUMO 化修饰的第一步 ; 另一方面, 催化底物去 SUMO 化, 维持 SUMO 化与去 SUMO 化的平衡尽管哺乳动物细胞中 SUMO 的底物非常广泛, 但是至今发现的 SENPs 仅有 6 种, 分别为 SENP1 SENP2 SENP3 SENP5 SENP6 和 SENP7 研究表明,SENPs 在基因转录细胞周期及癌症发生发展等方面发挥了重要的调控作用核受体超家族中的 RXR PPARγ PPARα 和 LXR 等成员均可以被 SUMO 修饰 [4 7] SUMO 化修饰通过影响 NRs 的核内再定位异二聚体形成及与靶基因反应元件结合等方面, 调节了 NRs 的转录功能而 SENPs 作为 SUMO 化与去 SUMO 化平衡的杠杆, 亦对 NRs 的转录调节通路产生重要作用 SENPs 在对雄激素受体 (androgen receptor, AR) 雌激素 (estrogen receptor, ER) 维生素 D 受体 (vitamin D receptor, VDR) 等核受体进行催化去 SUMO 化的同时, 亦对其转录活性及下游相关靶基因的表达具有调控作用已有研究表明,PXR 可以被

3 SUMO 化, 并抑制 TNF-α 诱导的炎症反应 [8] 但是 SENPs 对 PXR 及其下游基因的影响仍不清楚因此, 本研究旨在探讨 SENP1 是否影响 hpxr 调控的 P-gp 基因 (MDR1) 转录活性及其下游基因 MDR1 的 mrna 表达材料与方法细胞与质粒 HepG2 细胞 ( 人肝癌细胞 ) 和 LS174T 细胞 ( 人结肠癌细胞 ) 购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心 pcmv-hpxr 表达质粒由美国堪萨斯大学 Jeff Staudinger 教授惠赠 ;tk-mdr1-luc 报告基因质粒由美国匹兹堡大学 Xie Wen 教授惠赠 ;pflag-hsenp1 pflag-hsenp1m (SENP1 酶活性位点突变质粒 ) 表达质粒由美国安德森癌症中心 Edward T. H.Yeh 教授惠赠 ;prl-tk 内参质粒购自 Promega 公司药物与试剂 Dimethylsulfoxide (DMSO) 购自美国 MP 公司 ; 利福平 (rifampicin,rif) 购自美国 Sigma 公司 ; 高糖 DMEM 培养基胎牛血清 0.25% 胰酶 PBS Lipofectamine 2000 OPTI-MEM 培养基及 Trizol 购自美国 Life 公司 ; 双荧光素酶报告基因试剂盒购自美国 Promega 公司 ;RT-PCR 试剂盒及 Real-time PCR 荧光染料购自日本 Takara 公司 ;GAPDH MDR1 引物由美国 Invitrogen 公司设计合成主要仪器 SW-CJ-2FD 超净台, 苏州苏净集团安泰公司 ;311 型 CO 2 培养箱, 美国 Thermo 公司 ;XSZ-D2 显微镜, 重庆光学仪器厂 ;ThermoMultiskan MK3 酶标仪, 美国 Thermo 公司 ;Infinite F500 多标记分析仪, 瑞士 Tecan 公司 ; 普通 PCR 仪, 日本 Takara 公司 ;ABI 7500 荧光定量 PCR 仪, 美国 Life 公司细胞培养 HepG2 细胞和 LS174T 细胞置于含 10% 胎牛血清 100 u ml 1 青霉素 100 mg ml 1 链霉素的高糖 DMEM 培养基中,37 5%CO 2 常规培养转染及给药待对数生长期 HepG2 LS174T 细胞长满 80%~90% 时,0.25% 胰酶消化后以每孔 ~ 或 ~ 接种于 96 孔板或 12 孔板, 12 h 后用 Lipofectamine 2000 瞬时转染法将质粒转入细胞中检测双荧光报告基因活性时, 每孔各加入 tk-mdr1-luc (75 ng) 和 prl-tk (5 ng) 其中空白对照组为 Empty Vector 60 ng; 单质粒组分别为 60 ng pcmv-hpxr pflag-hsenp1 或 pflag-hsenp1m ; 共转染组分别为 pcmv-hpxr 和 pflag-hsenp1 或

4 pflag-hsenp1m 各 60 ng 质粒混合后与 0.5 ml Lipofectamine 2000 室温孵育 20 min, 加至 96 孔板中检测基因表达水平时, 各表达质粒用量调整为 0.8 mg, 按以上分组用 4 ml Lipofectamine 2000 转入 12 孔板转染后 5~6 h, 更换为含药 DMEM 培养基,0.1% DMSO 为空白对照组,RIF 为阳性诱导组报告基因活性检测 HepG2 LS174T 细胞给药 24 h 后, 弃去培养基, 用 PBS 清洗 1 次, 每孔加入 20 ml 1 Passive Lysis Buffer ( 被动裂解液,PLB), 室温下振荡 15 min 后置于 Infinite F500 多标记分析仪中设置程序为自动加样, 先加入 20 ml Luciferase Assay Substrate, 检测萤火虫荧光素酶活性, 再加入 20 ml Stop&Glo Reagent, 检测海肾荧光素酶活性计算时, 以海肾荧光素酶活性值为内参进行校正, 每孔荧光素酶活性值 = 萤火虫荧光素酶活性值 / 海肾荧光素酶活性值 0.1% DMSO 作为对照组, 将 RIF 处理组的荧光素酶活性值与之相比, 以倍数表示活性值高低 Real-time PCR HepG2 LS174T 细胞给药 24 h 后, 弃去培养基, 用 PBS 清洗 1 次,Trizol 提取细胞总 RNA 超微量分光光度计测定 RNA 浓度, 取 1 mg 逆转录成 cdna 后进行实时荧光定量 PCR 检测引物序列为 : GAPDH 上游引物 : 5'-GGATTTGGTCGTATTGGG-3' 下游引物 : 5'-GGAAGATGGTGATGGGATT-3' MDR1 上游引物 : 5'-CCATAGCTCGTGCCCTTGTTAGA-3' 下游引物 : 5'-CGGTGAGCAATCACAATGCAG-3' 扩增条件为 :94 30 min 95 5 s,60 34 s (40 个循环 ) s 60 1 min,95 15 s ( 融解曲线 ) 实验所得数据按 2 - Ct 法进行计算分析, 即首先利用 ABI 7500 数据分析软件对样品的荧光定量 PCR 反应结果进行分析并自动计算出 Ct 值, 将各个样品中 MDR1 的 Ct 值减去内参 GAPDH 的 Ct 值得到 Ct 值然后计算各个样品重复 3 次实验的平均 Ct 值, 再将 RIF 组的平均 Ct 值减去 DMSO 组的平均 Ct 值, 得到 Ct 值最后按 2 - Ct 计算基因表达倍数统计学方法各组实验均设有至少 3 次独立水平的重复实验, 数据均以 Mean±SD 表示, 采用 SPSS 20.0 软件进行两独立样本 t 检验分析比较各组间差异 P<0.05 认为具有统计学差异

5 结果 1 SENP1 对 hpxr 介导的 MDR1 报告基因活性的影响如图 1 所示, 在转染了空白 SENP1 及 SENP1 mutant 质粒后, 利福平对 HepG2 及 LS174T 细胞中 MDR1 报告基因的活性均无明显影响高表达 hpxr 后, 利福平对上述两种细胞系中 MDR1 报告基因活性分别诱导至 (3.46±0.84) 倍和 (4.17±0.81) 倍共转染 SENP1 后利福平的诱导作用明显下降, 分别为 (0.95± 0.21) 倍和 (1.76±0.31) 倍而共转染 SENP1m 后利福平的诱导作用可升高至 (2.49±0.44) 倍和 (2.91±0.21) 倍结果均具有统计学意义 (P<0.05) 因此, SENP1 可以下调 hpxr 介导的 MDR1 报告基因活性 Figure 1 RIF-induced MDR1 reporter activity in HepG2 and LS174T cells. ** P< 0.01 vs PXR group; # P<0.05, ## P<0.01 vs PXR+SENP1 group 2 SENP1 对 hpxr 介导的 MDR1 mrna 表达的影响如图 2 所示, 利福平对转染了空白 SENP1 及 SENP1 mutant 质粒的 HepG2 及 LS174T 细胞中 MDR1 mrna 表达均无明显影响高表达 hpxr 后, 利福平对上述两种细胞系中 MDR1 mrna 表达分别诱导至 (3.31±0.62) 倍和 (5.23±1.21) 倍共转染 SENP1 后利福平的诱导作用明显下降, 分别为 (1.45±0.38) 倍和 (2.21±0.27) 倍而共转染 SENP1m 后利福平的诱导作用可升高至 (2.35±0.40) 倍和 (3.68±0.23) 倍结果均具有统计学意义 (P<0.05) 因此,SENP1 可以下调 hpxr 介导的 MDR1 mrna 的表达

6 Figure 2 RIF-induced MDR1 mrna expression in HepG2 and LS174T cells. * P <0.05 vs PXR group, # P<0.05, ## P<0.01 vs PXR+SENP1 group 讨论近年来发现,SENPs 在体内参与调控了细胞周期生长发育核糖体生成基因转录及肿瘤新生血管的形成等过程作为一个新型的基因转录调控分子, SENPs 对核受体家族的转录调控主要通过以下 3 种方式进行 :(1) SENPs 直接催化 NRs 去 SUMO 化, 影响 NRs 二聚体形成及与靶基因反应元件结合这是迄今发现的最普遍的调控方式 SUSP1 (SENP6) 催化 RXRα-SUMO1 去 SUMO 化, 增强 RXRα 转录活性 [9] ;SENP2 催化 PPARγ 去 SUMO 化, 增加其下游脂肪生成相关基因的表达 [10] ;SENP1 及 SENP2 均可催化 VDR-SUMO2 去 SUMO 化, 且 SENP1 能提高 VDR 对维生素 D 的敏感性, 增加下游基因 CYP24A1 的表达 [11] (2) SENPs 催化 NRs 相关的转录激活因子或阻遏因子如 SRC-1 GRIP1 和 HDAC1 等去 SUMO 化, 间接影响 NRs 介导的转录过程 SENP1 对 HDAC1 去 SUMO 化, 从而增强 AR 的转录活性 [12] (3) SENPs 直接与 NRs 相互作用, 影响其转录活性 SENP2 可作为共调节分子抑制 ER 转录活性, 从而抑制雌激素依赖性与非依赖性乳腺肿瘤细胞的增殖,SENP2 对 ER 的这种转录调节并不依赖其去 SUMO 化酶活性, 而是与其氨基末端的一个转录阻遏功能域相关 [13] 本实验室前期研究发现,PXR 可被 SUMO2 和 SUMO3 修饰, 且 SENP1 可以催化 PXR 去 SUMO 化, 但 SENP1 对 PXR 的转录调控却未见国内外相关报道

7 因此, 本研究采用了人肝癌细胞系 HepG2 及人结肠癌细胞系 LS174T, 通过双荧光素酶报告基因及实时荧光定量 PCR 两种方法, 探讨 SENP1 对 PXR 的转录活性及其下游基因 MDR1 mrna 表达的影响研究结果显示, 与空白质粒组相比, 高表达 SENP1 组及 SENP1m 组利福平对 MDR1 报告基因活性及 mrna 表达的诱导均无显著差异, 表明 SENP1 或 SENP1m 对 MDR1 转录及基因表达没有直接影响 ; 而高表达 PXR 组利福平的诱导作用可达到 3~6 倍, 由此证明 PXR 高表达模型构建成功通过比较高表达 PXR 高表达 PXR+SENP1 高表达 PXR+SENP1m 的 HepG2 及 LS174T 细胞中利福平对 MDR1 的诱导作用, 发现 SENP1 可以显著下调 hpxr 介导的 MDR1 转录活性及基因表达水平, 且这种调节依赖于 SENP1 的酶活性另外实验中观察到, 无论是报告基因水平还是基因表达水平,LS174T 细胞中利福平对高表达 hpxr 组的诱导作用以及 SENP1 对 MDR1 的下调程度均明显高于 HepG2 细胞, 这与我们所知的 LS174T 细胞中 P-gp 表达较多有关 P-gp 过表达是肿瘤化疗失败产生多药耐药的主要原因临床上超过 50% 的抗肿瘤药物, 如紫杉醇长春新碱等, 既是 PXR 的配体, 又是 P-gp 的转运底物, 因此导致化疗的不敏感性本研究首次报道了 SENP1 可以下调 hpxr 介导的 MDR1 转录活性及其 mrna 表达水平, 但这仅仅是在转录及基因表达水平证实, 下一步还需从蛋白层面观察 SENP1 对 P-gp 蛋白表达的影响, 并进一步探讨 SENP1 调控 MDR1 表达的具体分子机制, 为临床上抑制或逆转肿瘤的多药耐药提供新思路 References [1] Kliewer SA, Moore JT, Wade L, et al. An orphan nuclear receptor activated by pregnanes defines a novel steroid signaling pathway [J]. Cell, 1998, 92: [2] Xu C, Li CY, Kong AN. Induction of phase I, II and III drug metabolism/transport by xenobiotics [J]. Arch Pharm Res, 2005, 28: [3] Hannoun Z, Greenhough S, Jaffray E, et al. Post-translational modification by SUMO [J]. Toxicology, 2010, 278: [4] Schneider Aguirre R, Karpen SJ. Inflammatory mediators increase SUMOylation of retinoid X receptor α in c-jun N-terminal kinase-dependent manner in human hepatocellular carcinoma cells [J]. Mol Pharmacol, 2013, 84:

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结直肠癌 (, ) 是消化道最常见的恶性肿瘤之一, 死亡率在世界上排名第位, 在我国排名第位, 每年约有万人死于发生发展的病理机制十分复杂, 目前认为基因突变是癌变过程中

结直肠癌 (, ) 是消化道最常见的恶性肿瘤之一, 死亡率在世界上排名第位, 在我国排名第位, 每年约有万人死于发生发展的病理机制十分复杂, 目前认为基因突变是癌变过程中中国病理生理杂志, ( ): - 杂志网址 : : [ 文章编号 ] - ( ) - - 可变剪接在结肠癌与正常组织间的 * 差异表达陶敏, 黄良祥, 蔡鹏威, 晋龙, 吴文冰, 曾长青, 黄毅, 伍严安 ( 福建医科大学省立临床医学院, 福建省立医院, 福建福州 ) [