36 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.34No 司 ; 无内毒质粒提取试剂盒购自 Omega 公司 ; QuikChange LightningEnzyme 购自 Stratagene 公司 ; 限制性内切酶购自 TaKaRa 公司 ; 双荧光报告基因检

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敕粕褚
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1 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2014,34(10):35 40 DOI: /j.cb 调节猪 TNF α 表达的 mirnas 鉴定 1 李虹仪 2 习欠云 2 张永亮 (1 龙岩学院生命科学学院预防兽医学与生物技术福建省高等学校重点实验室龙岩 ) (2 华南农业大学动物科学学院广州 ) 摘要肿瘤坏死因子 α(tnf α) 是脂肪细胞的分泌产物之一, 在脂肪中行使着复杂的调节功能, 为了研究猪脂肪组织中 TNF α 的表达受到哪些 mirna 的调控, 从猪脂肪组织基因组中获得猪 TNF α3 端非翻译区 (UTR) 序列, 与荧光素酶质粒 PGL3 control 连接构建猪 TNF α 的萤光素酶表达质粒 PGL3 TNF α3 UTR 生物信息学预测 mir 19a,miR 124,miR 130a,miR 301,miR 506 等 mirnas 均靶向猪 TNF α, 将这些 mirna 分别与 PGL3 TNF α3 UTR 质粒共转到细胞中, 以乱序序列作为阴性对照 (NC), 检测 mirna 对质粒荧光素酶活性的作用结果发现 mir 19a,miR 124 和 mir 130a 均能够显著抑制萤光素酶的活性 (P<0.01), 为了验证这 3 个 mirna 是否通过各自种子序列起调控作用, 突变了 PGL3 TNF α3 UTR 中这 3 个 mirna 种子序列的结合位点, 结果发现 mirnas 对突变质粒中的荧光素酶均无明显抑制作用 (P>0.05) 结果证明,miR 19a,miR 124 和 mir 130a 与猪 TNF α 均有直接的靶向关系并通过各自种子序列抑制 TNF α 的表达关键词肿瘤坏死因子 α mirna 荧光素酶中图分类号 Q786 肿瘤坏死因子 (tumornecrosisfactor α,tnf α) 是一个多功能细胞因子, 在细胞中起着重要的免疫调节作用 [1 2], 同时也调节着脂肪细胞的分化与凋亡猪脂肪的含量直接影响着猪肉品质, 而脂肪组织的沉积受一系列功能基因 (PPARγ GPDH 和 TNF α 等 ) 的作用以及信号途径 (p38/mapk Wnt/β catenin 等 ) 的调节 [3 4] mirna 是生物体内长约 22nt 的一种内源性 RNA, 通过种子序列与靶基因非翻译区 (UTR) 相结合抑制靶基因的表达, 研究表明, 上述功能基因及信号通路相关基因的表达均受 mirna 作用, 预示着 mirna 可能通过调节靶基因对猪肉品质起到一定的调控作用目前已有研究显示 TNF α 受多个 mirna 间接或直接调控, 如 mir 155 通过靶向脂多糖相关通路蛋白促进 TNF α 的翻译 [5] ;mir 146 在白血病细胞模型中能通过作用于 Ago2 和 RBM4 对 TNF α 的表达进行调节 [6] ; 收稿日期 : 修回日期 : 转基因生物新品种培育科技重大专项重点项目 (2014ZX B) 国家自然科学基金 ( ) 资助项目通讯作者, 电子信箱 :zhangyl@scau.edu.cn mir 19a 抑制子通过减少对 TNF α 的抑制作用减少肿瘤的生长 [7], 以及人脂肪细胞中过表达 mir 145 将促进甘油的释放以及 TNF α 的分泌等 [8] 目前大部分的研究结果与免疫调节相关, 且均使用人类细胞进行研究, 在猪脂肪组织中的相关报道比较少见在前期研究中, 我们利用肥胖型的蓝塘猪与瘦肉型的长白猪进行比较分析, 发现差异表达基因 mir 181a 直接靶向 TNF α 并调节着猪皮下脂肪细胞的聚脂 [9],miRNA 与靶基因之间的调节关系呈现网络状, 细胞中同一靶基因受多个 mirna 的调节, 为了较全面阐明调控猪脂肪组织 TNF α 的 mirna, 本研究选择猪 TNF α 作为对象, 对其相互作用的 mirna 进行预测, 并构建猪脂肪组织 TNF α 表达质粒及其突变质粒, 研究直接靶向猪 TNF α 的 mirna, 为后续研究 mirna 调控猪脂肪细胞分化相关机制以及多个 mirna 之间的相互调节关系奠定基础 1 材料与方法 1.1 材料胶回收试剂盒和质粒小提试剂盒均购自天根公

2 36 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.34No 司 ; 无内毒质粒提取试剂盒购自 Omega 公司 ; QuikChange LightningEnzyme 购自 Stratagene 公司 ; 限制性内切酶购自 TaKaRa 公司 ; 双荧光报告基因检测试剂盒购自 Promega 公司 ; 胎牛血清 DMEM 液体培养基双抗 ( 青链霉素 ) 胰蛋白酶购自 GIBCO 公司转染试剂 Lipofectamine2000 购自 Invitrogen 公司 mirna 模拟物 mimics 及阴性对照 (NC) 由上海吉玛公司合成 1.2 靶向猪 TNF α3 UTRmiRNA 的预测使用在线分析软件 (TargetScan:htp://www. targetscan.org/ miranda:htp:// microrna/home.do Pictar:htp://pictar.mdc berlin.de/ 等 ) 对调节猪 TNF α 的 mirna 进行综合分析, 预测可能调节猪 TNF α 的 mirna 1.3 猪 TNF α-3 UTR 序列的扩增根据猪 TNF α 序列 (NM_214022) 设计引物, 上游引物 TNF UTR xbai(5 ~3 ):TCTAGACAGAGTGGGTA TGCCAATGC, 下游引物 TNF UTR HpaI(5 ~3 ): GTTAACACCAGTAGGGCGGTTACAGAC, 以猪脂肪 DNA 为模板,PCR 扩增 TNF α 3 UTR 序列,PCR 反应程序为 :94 5min;(94 30s,56 30s,72 1.5min) 35cycles;72 10min 1.4 TNFα UTR 表达质粒的构建 PCR 产物经凝胶电泳分离回收, 与 PGL3 control xbai HpaI 双酶切载体进行连接, 将扩增的猪 TNF α 3 UTR 约 1100bp 序列连接于 PGL3 control 荧光素酶基因下游, 构建 PGL3 TNFα UTR 质粒,xbaI HpaI 限制性酶酶切及测序鉴定阳性重组体 1.5 PGL3 TNFα UTR mutant1/2 质粒的构建对 PGL3 TNFα UTR 质粒进行定点突变, 设计各 mirna 种子序列突变双链引物 :1(miR 19a/130a): CCAGCTCCCTCTTATTTATAGCCAGACTTGGCATTATTA TTT2(miR 124):GGGCTGCCTCCTAGCCTCGACCGATC CTTTTGCTTATG, 分别与 PGL3 TNFα UTR 质粒模板退火后进行循环延伸, 反应条件为 94 2min;(94 20s, 60 10s,68 2min) 25cycles;68 5min 扩增产物用 DpnⅠ 消化 1h, 去掉模板质粒后进行转化测序, 鉴定阳性突变体 1.6 细胞培养及转染 CHO( 中国仓鼠卵巢 ) 细胞按接种到 24 孔板, 用含 5% 胎牛血清,100U/ml 青霉素及 100U/ml 链霉素的 DMEM 培养基,37,5% CO 2 条件下培养,24h 内细胞汇合 90% 时, 将 70ngmiRNA mimics 与 2μg PGL3 TNFα UTR 或 PGL3 TNFα UTR mutant 用 Lipofectamine2000 共同转染到细胞中, 以 NC 与质粒或突变质粒共转作为阴性对照, 同时共转带有海肾荧光基因的 prl TK 作为参照, 每个样品 8 个重复,48h 后收集细胞 1.7 双荧光报告基因检测收集的细胞用 PBS 洗两次后加入 80μl1 细胞裂解液, 裂解的细胞液 4,12000r/min 离心 30s 后取上清, 取 50μl 上清液于 96 孔板 ( 白板 ) 中, 加入 50μl LARI, 于多功能酶标仪中检测萤火虫萤光素酶活性检测完再往各孔里加入 50μlStop&Glo TM 试剂, 再次于多功能酶标仪中检测海肾萤光素酶的活性 1.8 数据统计组间差异采用 t 检验进行分析, 以 P<0.05 作为差异显著性检验标准所有数据分析均由 SPSS19.0 统计软件完成 2 结果 2.1 靶向猪 TNF α3 UTR 的 mirna 预测经比对人 TNF α3 UTR 与猪 TNF α3 UTR 的序列有 80% 是保守的, 利用 Targetscan,PicTar,miRanda3 个数据库对人 TNF α3 UTR 进行综合预测, 再将人 TNF α3 UTR 预测得到的 mirna 结合位点与猪 TNF α 3 UTR 的序列进行比对, 得到保守结合的 mirna ( 表 1) 表 1 预测保守结合的 mirnas 及其序列 Table1 PredictedmiRNAsandthesequences mirna 序列 mir 181a AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGUU mir 19a UGUGCAAAUCUAUGCAAAACUGA mir 124 UAAGGCACGCGGUGAAUGCCA mir 130a CAGUGCAAUGUUAAAAGGGCAU mir 301 CAGUCCAAUAGUAUUGUCAAAGC mir 506 UAUUCAGGAAGGUGUUACUUAA 2.2 重组质粒 PGL3 TNF α UTR 的鉴定按照设计引物, 扩增猪基因组中 TNF α3 UTR 序列约 1100bp( 图 1), 胶回收后与 PGL3 control 双酶切质粒进行连接, 构建约 6300bp 的质粒 PGL3 TNF α3 UTR, 从酶切鉴定图 2 中可以看出, 质粒单酶切时, 在 marker5000bp 上约 6000bp 处有明显单一条带, 而在质粒双酶切时分别在 5000bp 处及 1100bp 有明显单一

2014,34(10) 李虹仪等 : 调节猪 TNF α 表达的 mirnas 鉴定 37 条带, 说明质粒构建成功图 1 TNF α3 UTR 序列的扩增 Fig.

处有明显单一条带, 而在质粒双酶切时分别在 5000bp 处及 1100bp 有明显单一条带, 说明突变质粒构建成功测序结果见图 5 图 3 PGL3 TNF α UTR mutant 菌液鉴定 Fig.

2 PGL3 TNF α3 UTRplasmid constructionanddigestion M:DNAMarkerDL15000;1:PGL3 TNF α3 UTRplasmid;2: PGL3 TNF α3 UTR plasmid/xba Ⅰ;3 PGL3 TNF α 3 UTR plasmid/xbaⅠ +HpaⅠ 2.

3 2014,34(10) 李虹仪等 : 调节猪 TNF α 表达的 mirnas 鉴定 37 条带, 说明质粒构建成功图 1 TNF α3 UTR 序列的扩增 Fig.1 AmplificationofTNF α3 UTRsequence M:DNAMarkerDL2000;1and2arereplicant 挑单菌用通用引物 M13 进行菌液鉴定, 目的片段约 1300bp( 图 3), 选阳性克隆进行质粒提取及酶切鉴定, 从图 4 可以看出, 与 PGL3 TNF α UTR 相同, 质粒单酶切时, 在 marker5000bp 上约 6000bp 处有明显单一条带, 而在质粒双酶切时分别在 5000bp 处及 1100bp 有明显单一条带, 说明突变质粒构建成功测序结果见图 5 图 3 PGL3 TNF α UTR mutant 菌液鉴定 Fig.3 VericationofPGL3 TNF α UTR mutantusingm13primers M:DNAMarkerDL2000;1 ~7:Diferentsinglecolony 图 2 PGL3 TNF α3 UTR 质粒及酶切鉴定 Fig.2 PGL3 TNF α3 UTRplasmid constructionanddigestion M:DNAMarkerDL15000;1:PGL3 TNF α3 UTRplasmid;2: PGL3 TNF α3 UTR plasmid/xba Ⅰ;3 PGL3 TNF α 3 UTR plasmid/xbaⅠ +HpaⅠ 2.3 突变载体 PGL3 TNF α UTR mutant 质粒的构建由于 mir 19 和 mir 130 之间的作用位点相近, 因此设计这两处位点全突变引物, 以 PGL3 TNF α UTR 为模板进行全质粒扩增, 经 DpnⅠ 消化后转化 DH5α, 图 4 PGL3 TNF α UTR mutant 质粒及酶切鉴定 Fig.4 PGL3 TNF α UTR mutantplasmid M:DNAMarkerDL15000;1:PGL3 TNF α UTR mutantplasmid; 2: PGL3 TNF α UTR mutantplasmid/xba I; 3: PGL3 TNF α UTR mutantplasmid/xbai+hpai 图 5 TNF α 各 mirna 结合位点突变结果 Fig.5 MutatedsiteofmiRNAsbindingtoTNF α 2.4 MiR 19,miR 124 与 mir 130a 抑制荧光素酶活性为验证各 mirna 与 TNF α 之间的靶关系, 本试验用各 mirnamimics 分别与构建的带有荧光素酶基因的质粒 PGL3 TNF α UTR 共转 CHO 细胞, 以 NC 替换 mirnamimics 作为对照,48h 后收集细胞裂解液进行荧光素酶活性检测从图 6 可以看出, 与对照组相比, mir 19a,miR 124 和 mir 130amimics 能够与荧光素酶下游的 TNF α3 UTR 结合, 抑制其翻译从而使荧光素酶活性减弱 (P<0.01), 而 mir 301 和 mir 506 则与对照组无显著差异分别突变了质粒 PGL3 TNF α UTR 上 mir 19a,miR 124 和 mir 130a 种子序列的结合位点后, 其荧光素酶活性均与对照组差异不显著 (P>0.05, 图 7), 初步得出结论 mir 19a,miR 124 和 mir 130a 通过各自种子序列与 TNF α3 UTR 结合抑制 TNF α 的翻译

38 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.34No.102014 图 6 荧光素酶活性验证各 mirna 与 TNF α 的靶关系 Fig.

7 MiR 19a,miR 124andmiR 130a havenoefectonthemutatedtnf α 3 讨论目前 mirna 靶基因的预测多基于生物信息学的计算机辅助算法, 常用的数据库有 TargetScan miranda Pictar 等, 但猪这个物种的基因信息很少能在这些数据库中搜索得到, 因此本试验利用人 TNF α 基因 (NM_ 000594.

4 38 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.34No 图 6 荧光素酶活性验证各 mirna 与 TNF α 的靶关系 Fig.6 MiR 19a,miR 124andmiR 130adirectly regulatestnf αexpresionvia3 UTRsites meansnotsignificantdiferencebetweentreatments(p<0.01) 图 7 荧光素酶活性验证各 mirna 与 TNF α 突变序列的关系 Fig.7 MiR 19a,miR 124andmiR 130a havenoefectonthemutatedtnf α 3 讨论目前 mirna 靶基因的预测多基于生物信息学的计算机辅助算法, 常用的数据库有 TargetScan miranda Pictar 等, 但猪这个物种的基因信息很少能在这些数据库中搜索得到, 因此本试验利用人 TNF α 基因 (NM_ ) 与猪的高相似度 (80%), 先用人的基因在这些数据库中进行预测, 综合几个数据库的预测结果后将这些 mirna 的结合位点及前后序列与猪 TNF α 基因进行比对, 最终得到结合位点保守的 mirna, 以此来解决猪相关数据库缺乏的问题试验结果也显示, 预测并验证的这些 mirna 中,miR 19a 与 mir 181 和人 TNF α 存在着直接或间接的靶向关系 [7,10] 双荧光报告基因已广泛应用于 mirna 靶关系的验证, 其中萤火虫荧光素酶是一个 61kDa 的单亚基蛋白质, 海肾荧光素酶为 36kDa 的单亚基蛋白质, 两种酶活性均不需要翻译后修饰, 在翻译完成时即有遗传报告基因的功能, 本试验将猪 TNF α 连接到萤火虫荧光素酶基因下游,miRNA 通过抑制 TNF α 的表达来抑制荧光素酶的活性, 并以共转物海肾荧光素酶基因的活性作为参照, 通过较正后的荧光素酶活性可以获得各 mirna 对靶基因 TNF α 的抑制程度, 筛选得到有显著抑制效果的 mirna 中 mir 19a 的抑制率为 45%,miR 124 和 mir 130a 的抑制率均达到了 58% 动物中的 mirna 主要通过其种子序列以不完全配对的方式抑制基因的翻译表达, 其调控作用呈现网络 [11 12] 状, 一条 mirna 调控多个靶基因和一个靶基因受多条 mirna 调控的现象普遍存在 [13 14] 本试验结果也显示, 猪 TNF α 同样受到多条 mirna(mir 19a,miR 124,miR 130a 和 mir 181a) 的调控, 且均通过各自种子序列对靶基因起抑制作用 TNF α 序列中各 mirna 种子序列的结合位点改变以后, 上述 mirna 对 TNF α 的抑制效果均不显著而作用于 TNF α 的这几个 mirna 同样也作用于其他靶基因, 包括脂肪分化相关基因, mirna 与 TNF α 靶向关系的验证将为这种调控网络的完整呈现奠定基础 4 结论本试验成功构建了猪 TNF α 表达质粒及其突变质粒, 预测并初步鉴定了 mir 19a,miR 124 和 mir 130a 与 TNF α 有直接的靶向关系, 能通过其种子序列抑制 TNF α 的表达这些结果可以为后续研究 mirna 如何进一步调节猪脂肪组织中的 TNF α 以及共同调控猪 TNF α 的这些 mirna 之间的相互调节关系提供研究基础参考文献 [1]BorzeckaK,PlociennikowskaA,BjorkelundH,etal.CD14 mediatesbindingofhighdosesoflpsbutisdispensablefortnf alphaproduction.mediatorsinflamm,2013,2013: [2]MoriokaS,BroglieP,OmoriE,etal.TAK1kinaseswitchescel fatefromapoptosistonecrosisfolowingtnfstimulation.jcel Biol,2014,204(4): [3] TakadaI,KouzmenkoA P,KatoS.PPAR gammasignaling crostalkinmesenchymalstemcels.pparres,2010,2010. [4]BluherM,BashanN,ShaiI,etal.ActivatedAsk1 MKK4 p38mapk/jnkstressignalingpathwayinhumanomentalfat tisuemaylink macrophageinfiltration towhole bodyinsulin

5 2014,34(10) 李虹仪等 : 调节猪 TNF α 表达的 mirnas 鉴定 39 sensitivity.jclinendocrinolmetab,2009,94(7): [5]TiliE,MichaileJJ,CiminoA,etal.ModulationofmiR 155 and mir 125b levels folowing lipopolysaccharide/tnf alpha stimulationandtheirposiblerolesinregulatingtheresponseto endotoxinshock.jimmunol,2007,179(8): [6]ElGazarM,ChurchA,LiuT,etal.MicroRNA 146aregulates bothtranscriptionsilencingandtranslationdisruptionoftnf alphaduringtlr4 inducedgenereprogramming.jleukocbiol, 2011,90(3): [7]LiuM,WangZ,YangS,etal.TNF alphaisanoveltargetof mir 19a.IntJOncol,2011,38(4): [8] Lorente CebrianS,MejhertN,KulyteA,etal.MicroRNAs regulatehumanadipocytelipolysis:efectsofmir 145arelinked totnf alpha.plosone,2014,9(1):e [9]LiH Y,ChenX,GuanLZ,etal.MiRNA 181aregulates adipogenesisby targeting tumornecrosisfactor alpha (TNF alpha)intheporcinemodel.plosone,2013,8(10):e [10]ZhaoJ,GongAY,ZhouR,etal.DownregulationofPCAFby mir 181a/bprovidesfeedbackregulationtoTNF alpha induced transcriptionofproinflammatorygenesinliverepithelialcels.j Immunol,2012,188(3): [11] ChenY,WangC,LiuY,etal.miR 122targetsNOD2to decreaseintestinalepithelialcelinjuryincrohn sdisease. BiochemBiophysResCommun,2013,438(1): [12]MenonB,SindenJ,Franzo RomainM,etal.RegulationofLH receptormrna binding protein by mir 122 in ratovaries. Endocrinology,2013,154(12): [13]KarbienerM,FischerC,NowitschS,etal.microRNAmiR 27b impairshumanadipocytediferentiationandtargetsppargamma. BiochemBiophysResCommun,2009,390(2): [14]LeeEK,LeeM J,AbdelmohsenK,etal.miR 130suppreses adipogenesis by inhibiting peroxisome proliferator activated receptorgammaexpresion.molcelbiol,2010,31(4): IdentificationmiRNAsThatRegulatePorcineTNF α ExpresionThroughTargetingTNF αutr LIHong yi 1 XIQian yun 2 ZHANGYong liang 2 (1FujianProvincialKeyLaboratoryofPreventiveVeterinaryMedicineandBiotechnology,ColegeofLifeScience, LongyanUniversity,Fujian ,China) (2ColegeofAnimalScience,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou ,China) Abstract TNF αisoneofthesecretoryproductsofadipocyteandisamultifunctionalcytokinethatplays animportantroleinregulatinglipogenesis.mirna isakindofendogenousrna withlengthofabout22nt, whichregulates60% ofmammaliangeneviaitsseedsequence.author spreviousworkfoundmir 181a,which targetingporcinetnf α,ishighlyexpresedinafat richpigbreedandhasanefectsonadipocytediferentiation byregulationoftnf α.inordertofindoutwhichmirnasthattargetingtheporcinetnf α,3enduntranslated regionofporcinetnf αwereamplifiedandthepcrproductwasdigestedwithxbaiandhpai,thenligatedto pgl3 controlatthecorespondingsitestoconstructtheluciferaseexpresionplasmidpgl3 TNF α UTR.Then fivemirna mir 19a,miR 124,miR 130a,miR 301, mir 506 were predicted to targettnf α using bioinformaticanalysis(softwaresoftargetscan:htp:// miranda:htp:// org/microrna/home.doandpictar:htp://pictar.mdc berlin.de/).mimicsofthesefivemirnasweresynthesis andcotransfectedwithpgl3 TNF α UTRintoCHOcelsrespectively,takingscrambledsequenceasnegative control.theresultsshowedthattnf αwasthetargetofmir 19a,miR 124andmiR 130abyadualluciferase asay(p<0.01).toverifywhethertnf αexpresionwasinhibitedbytheseedsequencesofthesethree mirnas,bindingsitesofmir 19a,miR 124andmiR 130aonTNF α3 UTRweremutatedtodesigntherite directedmutagenesisprimers,afterpcr amplifying,theproductsweredigestedwithdpnitoremovethe

6 40 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.34No originalyun mutatedtemplate.thenthemutatedvectorspgl3 TNF α UTR mutant1(mir 19/130a)and2 (mir 124)wereconstructed.ThemutatedplasmidswerecotransfectedwithmiR 19a,miR 124andmiR 130a respectively,andtheresultofdualluciferaseasayshowedthattheyalhavenosignificantefectondepresing theexpresionoftnf α(p>0.05).theresultshowedthatporcinetnf αisthetargetofmir 19a,miR 124 andmir 130aandtheyalinhibittheexpresionofTNF αbytheirseedsequences,whichprovidedtheevidence ofinterelationshipbetweentnf αandthethreemirnas. Keywords TNF α mirna Luciferaseasay

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽