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1 第 27 卷第 16 期 中国现代医学杂志 Vol. 27 No 年 8 月 China Journal of Modern Medicine ug DOI: /j.issn 文章编号 : (2017) 小鼠 11β- 1 基因真核表达载体的构建及应用 辛婧 1, 叶磊 2, 杨可 1, 沈亚非 1, 邓飞 1 [1. 河南省漯河市中心医院 ( 漯河市医学高等专科学校第一附属医院 ) 内分泌科, 河南漯河 ;2. 河南省漯河市召陵区人民医院神经内科, 河南漯河 ] 摘要 : 目的构建小鼠 11β- 羟类固醇脱氢酶 (11β- 1) 基因的慢病毒真核表达载体 PLJM1-11β- HSD1-GFP, 建立小鼠前体脂肪细胞 (3T3-L1) 高表达 11β- 1 基因的稳定感染细胞株, 为 11β- 1 基因的功能研究奠定基础 方法利用逆转录聚合酶链反应 (RT-PCR) 从小鼠肝脏 cdn 中扩增 11β-HSD1 开放阅读框 ORF, 构建针对 11β- 1 基因的真核表达载体, 转化感受态 DH5α 菌株, 抽提质 粒并进行测序鉴定 用测序成功的质粒和慢病毒包装质粒共同转染 293T 细胞, 产生慢病毒并转染 3T3-L1 细 胞 根据绿色荧光效率挑取单克隆细胞团筛选出稳定细胞株, 通过 Western blot 鉴定 PLJM1-11β-HSD1-GFP 转染成功 结果经酶切 PCR 及测序验证,PLJM1-11β-HSD1-GFP 真核表达载体构建成功, 并包装慢病毒, 绿色荧光效率 90% 以上, 并利用其慢病毒悬液成功感染 3T3-L1 细胞, 筛选出的稳定感染细胞株的 3T3-L1 细胞成功高表达 11β-HSD1 蛋白 结论成功构建了 11β- 1 基因的真核表达载体, 并建立高表达 11β- 1 的稳定感染细胞株 PLJM1-11β-HSD1-GFP-3T3-L1, 为进一步研究 11β- 1 基因的功 能, 特别是在肥胖中的研究奠定了基础 关键词 :11β- 1 基因 ; 真核表达载体 ; 前体脂肪细胞 ; 肥胖 中图分类号 :Q782 文献标识码 : Construction and role of mouse PLJM1-11 茁 -HSD1-GFP plasmid Jing Xin 1,LeiYe 2,Ke Yang 1,Ya-feiShen 1,Fei Deng 1 (1. Department of Endocrinology, Luohe Central Hospital, Luohe, Henan , China; 2. Department of Neurology, the People's Hospital of Shaoling District, Luohe, Henan , China) bstract: Objective To construct alentiviral vector of PLJM1-11 茁 -HSD1-GFP and establish astable cell line of 3T3-L1 with high expression of mouse gene, and lay the foundation for the research of gene. Methods Open reading frame (ORF) fragment of mouse gene was amplified from mouse liver tissues by RT-PCR, then inserted into the PLJM1-NRG1-GFP vector and transformed into competent DH5 琢 strain of. The plasmid was extracted and used for sequencing. The successfully-sequenced plasmid PLJM1-11 茁 -HSD1-GFP and the packaging plasmid were transfected to 293T cell line to produce recombinant lentivirus. 3T3-L1 cell line was transfected by recombinant virus and the stable cell line was isolated by selecting the single clone with GFP, and high expression of 11 茁 -HSD1 was identified by Western blot. Results The eukaryotic expression vector of PLJM1-11 茁 -HSD1-GFP was constructed and confirmed by DN sequencing. The lentivirus vector of named PLJM1-11 茁 -HSD1-GFP was successfully constructed and the virus was packaged in 293T cells. 3T3-L1 cells were transfected by recombinant virus and the stable cell line was selected by green fluorescence efficiency, which showed that the lentivirus vector transfection rate was over 90%. dramatically elevated protein level of 11 茁 -HSDl was expressed in the positive clones of 3T3-L1 cells compared with the control group. Conclusions Mouse PLJM1-11 茁 -HSD1-GFP plasmid has been successfully constructed. The 3T3-L1 cells 收稿日期 :

2 第 16 期辛婧, 等 : 小鼠 11β- 1 基因真核表达载体的构建及应用 transfected by PLJM1-11 茁 -HSD1-GFP could effectively elevate the expression of used in the functional researches of mouse gene, especially those related to obesity. Keywords: gene; eukaryotic expression vector; 3T3-L1 cell; obesity gene, and can be 11β- 羟类固醇脱氢酶 (11beta-hydroxysteriod dehydrogenase,11β-hsd1) 在体内广泛分布, 表达于脂肪 肝脏 肌肉 性腺及中枢神经系统等, 以脂肪 [1] 组织和肝脏中的含量最高 它是糖皮质激素的代谢酶, 有重要的生物学活性, 有还原酶与氧化酶的双重作用, 但以还原酶作用为主, 需要烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸 (NDP + ) 参与, 有活化糖皮质激素的作用, 可以使人体无活性的可的松 ( 动物的皮质酮 ) 转化为有活性的氢化可的松 ( 皮质醇 ) [2] 资料显示, 11β-HSD1 的转基因小鼠显示内脏脂肪组织肥厚 ; 在代谢综合征患者脂肪库中细胞内 11β-HSD1 的 [3] 活性是普遍增加的 这可能与糖皮质激素能增加脂肪细胞内合成代谢有关, 而 11β-HSD1 主要使糖皮质激素活化, 提示其可能与向心性肥胖 胰岛素抵 [4] 抗及糖尿病有关 本研究拟构建 11β- 1 基因的真核表达载体, 并建立高表达该基因的稳定感染细胞株, 以进一步研究该基因与肥胖 胰岛素抵抗及糖脂代谢相关性 1 材料与方法 1.1 材料 PolyTtract_Series9600 TM mrn Isolation System 试剂盒 末端转移酶 (TdT) 逆转录酶(MV) 及 Taq DN 聚合酶均购自美国 Promega 公司, 焦碳酸二乙酯 (DEPC) 及 Expand TM Template PCR System 购自日本 TaKaRa 公司,DH5α 菌株及 PLJM1-NRG1-GFP 载体由南京医科大学分子遗传研究室李建民教授馈赠,Lipofectamine 2000 细胞转染试剂盒购自美国 Invitrogen 公司,3T3-L1 前体脂肪细胞株 293T 细胞购自上海细胞生物研究所,DMEM 培养液 10% 胎牛血清购自南京生兴公司,3- 异丁基 -1- 甲基磺嘌呤 (MIX) 胰岛素及地塞米松购自美国 Sigma 公司, 11β-HSD1 兔源抗体购自美国 Research Genetics 公司, 二抗羊抗兔 IgG- 辣根过氧化物酶及 β-actin 抗体购自武汉生物有限公司 1.2 方法 引物设计根据 Genank 登录号 NM_ mrn 序列设计引物, 由上海华大基因科技有限公司合成 正向引物 :GGGGCTGCGGTCCGCCCC TGGCGTTTGTTCC; 反向引物 :GGGG TTCCTCGGCCTGTTCTTCCTGTCC 正向引物酶切位点为 I, 反向引物酶切位点为 I 扩增目的片段大小 881 bp 小鼠肝脏总 RN 的抽提用 PolyTtract_Series9600 TM mrn Isolation System 试剂盒提取 L/C 8 周的小鼠肝脏组织总 RN, 提取 2μl 经琼脂糖凝胶电泳观察总 RN 完整性, 并用紫外分光光度计分别测定 260 nm 280 nm 波长下的光密度 (OD) 值, 并检测总 RN 的纯度, 其余 RN 于 -70 冰箱冷冻保存 逆转录聚合酶链反应 (RT-PCR) 扩增目的基因取 2μgmRN 加入 PrimeSript TM RTreagent Kit 逆转录反应体系中,42 孵育 90 min, 逆转录合成 cdn, 结束后加入 RNase H 内切酶,37 孵育 30 min, 降解 RN 以上述小鼠的 cdn 为模板扩增目的片段 PCR 的反应条件为 :94 预变性 5min, s,54 30 s,72 延伸 1min,35 个循环, min,4 2min, 获取小鼠基因全长开放阅读框 ORF 真核表达质粒 PLJM-11β-HSD1-GFP 制备以上述小鼠 3T3-L1 细胞的 cdn 为模板, 相应引物扩增 11β-HSD1 全长 ORF, 用 TaKaRa DN Fragment Purification Kit 纯化靶 DN 片段 将纯化后的 PCR 产物行 I 和 I 双酶切 对酶切后产物用 1% 琼脂糖凝胶行电泳检测 并在切胶仪上切下目的片段 用 Ultra-Sep Gel Extraction Kit (OMEG) 纯化切胶产物 将酶切纯化后的目的片段 11β-HSD1 连接至 PLJM1-NRG1(NheI/EcoRI) 载体 (10μl 体系 : 目的片段 2μl, 载体 1μl,2 Ligase buffer 5μl,T4 连接酶 1μl,ddH 2 O 1μl; 条件 22 1h) 用连接产物转化大肠杆菌 DH5α 菌株, 在氨苄青霉素 (mpicillin,mp) 抗性的 L 固体平板上生长过夜 (37 孵箱 16~18 h) 在过夜后的固体平板上挑取 5 个单克隆, 分别加至 mp 抗性的 5ml L 培养基里摇菌过夜并做好标记, 次日以菌液为模板, 以 11β-HSD1-F/R 为引物作 PCR 并行 1% 琼脂糖凝胶电泳鉴定 对获取的阳性克隆进行保种, 同时经碱裂解法提取质粒 DN, 以 CMV-F 和 11β-HSD1-R 13

3 中国现代医学杂志 第 27 卷 为测序引物并送上海华大基因科技有限公司进行测序 序列分析应用 NCI 网站 LST 分析软件, 对上述测序结果进行序列比对, 鉴定 PLJM1-11β-HSD1-GFP 载体多克隆位点区表达序列的可靠性和准确性 PLJM1-11β-HSD1-GFP-3T3-L1 慢病毒细胞株的构建用中抽试剂盒抽取质粒 PLJM1-11β-HSD1-GFP 及空载对照质粒 PLJM.1, 保证 OD 值 1.8~1.9, 浓度在 1000μg/ml 以上 转染前 24 h 将处于对数生长期的 293T 细胞铺 6cm 培养皿, ~ 个 / 皿 转染体系如下 : 质粒 PLJM1-11β-HSD1-GFP( 或空载对照质粒 PLJM. 1)4μg, 包装质粒 PVSVG 2μg,delta μg, 与 Lipofectamine μl 混合共同孵育形成复合物, 然后转染 293T 细胞 转染后 24 h 换液 3ml, 并用荧光显微镜观察拍照 转染后 48 和 72 h 收集包装产生的病毒上清, 经 0.45μm 滤膜过滤后加入 polybrene(millipore), 使终浓度为 10μg/ml 感染前 24 h 将 3T3-L1 细胞接种至 6cm 培养皿, 使感染前细胞密度为 10%~20% 24 h 后弃去培养液, 用上述病毒上清 3ml 感染靶细胞,37 培养 6h 后换液加入 3ml 完全培养液 DMEM 感染 48 h 后观察荧光表达情况 根据荧光效率挑单克隆筛选稳定转染株, 并进行冷冻保存 Western blot 检测分别提取正常 3T3-L1 细胞 高表达 11β-HSD1 的 3T3-L1 及转入空载质粒的 3T3-L1 细胞的总蛋白质, 用考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度, 制备 14.7% 分离胶和 5% 浓缩胶, 60 V 稳压电泳 ; 半干转膜, 封闭, 按 Western blot 检测试剂盒说明书进行操作 一抗为 11β-HSD1 多克隆抗体 ( 抗体浓度为 1 200), 二抗为羊抗兔 IgG- 辣根过氧化物酶,( 抗体浓度为 1 800), 用免疫印迹增强化学发光法分别检测 3 组细胞株的 11β- HSD1 蛋白表达水平 实验所得的 Western blot 条带经 Photoshop 软件处理, 在 andscan 分析软件中测得各自总度值, 采用自身 β-actin 灰度值校正并进行定量分析 实验数据输入 Excel 数据库用 Excel 软件进行作图 1.3 统计学方法采用 SPSS 14.0 统计学软件对本研究中的数据进行分析和处理, 计量资料应用均数 ± 标准差 (x±s) 表示, 采用配对检验, <0.05 为差异有统计学意义 2 结果 2.1 小鼠 11β-HSD1 ORF 片段扩增及载体克隆 以小鼠肝脏 cdn 为模板, 用正向引物和反向 引物进行 PCR 扩增, 得到小鼠 11β-HSD1 ORF 片 段, 目的片段为 881 bp( 见图 1) 2.2 PLJM1-11β-HSD1-GFP 重组载体的鉴定 以正向引物与反向引物进行 PCR 扩增, 用 Promega PCR 纯化试剂盒进行纯化, 酶切产物 ( 见图 2) 行切胶纯化, 将纯化后产物连接至 PLJM1-NRG1- GFP 载体 随机选取 5 个阳性克隆, 行 PCR 鉴定 ( 见 图 3), 获取的阳性克隆经碱裂解法提取质粒 DN 测序 ( 见图 4), 测序结果经序列比对分析确认无任 何突变 插入等异常, 慢病毒载体 PLJM1-11β-HSD1- GFP 构建成功 ( 见图 5) 2.3 慢病毒载体转染 293T 细胞 慢病毒载体 PLJM1-11β-HSD1-GFP 转染 293T Marker 2000 bp 1000 bp 750 bp 500 bp 250 bp 100 bp 图 1 小鼠 11β- 1 基因 ORF 扩增片段 Marker 2000 bp 1000 bp 750 bp 500 bp 250 bp 100 bp 图 2 小鼠 11β- 1 基因 PCR 酶切产物 水 Marker 2000 bp 1000 bp 750 bp 500 bp 250 bp 100 bp 图 3 小鼠 11β- 1 基因 ORF 片段单克隆 PCR 结果 14

4 辛婧 等 小鼠 11β- 第 16 期 1 基因真核表达载体的构建及应用 细胞 24 h 后荧光显微镜拍照见图 6 绿色荧光效率 48 h 后荧光显微镜拍照结果见图 7 90%以上 2.5 3T3-L1 单克隆细胞株绿色荧光蛋白的表达 2.4 收取病毒上清感染3T3-L1 细胞 根据荧光情况挑单克隆并筛选稳定感染细胞株 收取 293T 细胞 病 毒上 清感 染 3T3-L1 细 胞 3T3-L1 单克隆细胞株绿色荧光蛋白的表达见图 8 图 4 PLJM1-11β-HSD1-GFP 质粒测序图 图 5 PLJM1-11β-HSD1-GFP 质粒序列比对图 明视野下 暗视野下 明视野下 暗视野下 图 6 重组质粒转染 293T 细胞后绿色荧光蛋白的表达 图 7 重组质粒转染 3T3-L1 细胞后绿色荧光蛋白的表达 荧光显微镜 100 荧光显微镜

5 中国现代医学杂志 第 27 卷 2.6 PLJM1-11β-HSD1-GFP 质粒转染 3T3-L1 细胞蛋白水平验证 分别提取 3T3-L1 PLJM1-3T3-L1 及 PLJM1-11β HSD1-GFP-3T3-L1 细胞组蛋白进行 Western blot 检测, 结果提示 PLJM1-11βHSD1-GFP 质粒转染成 功,PLJM1-11β-HSD1-GFP-3T3-L1 组 11β-HSD1 蛋白表达水平明显升高, 见图 9 图 讨论 : 明视野下 ;: 暗视野下 3T3-L1 单克隆细胞株绿色荧光蛋白的表达 ( 荧光显微镜 100) :3 组细胞高表达 11β-HSD1 蛋白水平 ;: 以 11β-HSD/tubulin 相应灰度值行定量分析 覮与 1 和 2 比较, <0.05;1:3T3-L1 组 ;2: PLJM1-3T3-L1 组 ;3:PLJM1-11β-HSD1-3T3-L1 组 图 各组细胞 11β-HSD1 蛋白表达情况 11β-HSD1 作为一种微线粒体酶, 主要负责有 活性与无活性的糖皮质激素之间的互相转化, 通过 控制底物即糖皮质激素的利用率, 从而调控组织特 异性糖皮质激素受体的活性 [5-6] 11β-HSD 有 2 种 覮 11β-HSD1 同工酶 其中 11β-HSD2 是辅酶玉 (ND) 依赖性脱氢酶, 主要使活性的可的松变为无活性的氢化可的松 主要作用于盐皮质激素敏感的靶组织如肾脏, 结 [7] 肠, 唾液腺, 胎盘等 11β-HSD1 直到最近才被发现并认为是重要的生物酶, 是还原型辅酶域 (NDPH) 依赖性的还原酶, 与 11β-HSD2 作用相反, 主要负责将无活性的氢化可的松转化为有活性 [8] 的可的松 它广泛分布于各组织, 主要分布于肝脏 脂肪 性腺 脑 脉管系统等, 这些组织则以糖皮质激素受体占优势 研究表明,11β-HSD1 调节糖皮质激素受体与配体的结合, 参与了库欣综合征相似的疾病的发生发展, 如向心性肥胖 糖尿病 多囊卵巢 [9-10] 综合征以及痴呆 慢病毒 (Lentivirus) 载体是以人类免疫缺陷病毒 [11] -1(HIV-1) 为基础发展起来的基因治疗载体 携带有目的基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒及细胞系的辅助下, 经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒, 通过感染细胞或组织, 实现目的基因在宿主细 [12] 胞中得到长期而稳定的表达 经过改建后的慢病毒载体能够容纳约 10 kb 左右的外源基因, 因此大多数的 cdn 都能够被克隆入慢病毒载体 293T 细胞由 293 细胞派生, 属人肾上皮细胞系, 作为包装细胞, 在包装后产生了高滴度的病毒颗粒, 同时表达目的基因 本文利用慢病毒载体技术成功构建了带有 GFP 目的基因 HSD1 的慢病毒载体 PLJM1-HSD1-GFP, 同时建立了 3T3-L1 稳定感染细胞株 PLJM1-HSD1- GFP-3T3-L1, 为进一步研究 HSD1 的生物学功能奠定了必要的基础 参考文献 : [1] CHPMN K E, COUTINHO E, ZHNG Z, et al. Changing glucocorticoid action: 11β-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 in acute and chronic inflammation[j]. J Steroid iochem Mol iol, 2013, 137(100): [2] LIU J, KONG X, WNG L, et al. Essential roles of 11β-HSD1 in regulating brown adipocyte function [J]. J Mol Endocrinol, 2013, 50(1): [3] HONG S P, NM K Y, SHIN Y J, et al. Discovery of 11β-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 inhibitor [J]. iboorg Med Chem Lett, 2015, 25(17): [4] MORGN S, GTHERCOLE L L, SIMONET C, et al. Regulation of lipid metabolism by glucocorticoids and 11β-HSD1 in skeletal muscle[j]. Endocrinology, 2013, 154(7): [5] DUE S, SLM M Q, SU, et al. Glucocorticoid excess 16

6 第 16 期辛婧, 等 : 小鼠 11β- 1 基因真核表达载体的构建及应用 increases hepatic 11β- HSD-1 activity in humans:implications in steroid-induced diabetes[j]. Journal of Clinical Endocrinology Metabolism, 2015, 100(11): [6] PUL P, FREDIRK R, DVID E, et al. Saturated fatty acids in human visceral adipose tissue are associated with increased 11β-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 expression[j]. Lipids in health Disease, 2015, 14(1): 1-5. [7] KOH E H, KIM R, KIM H, et al. 11β-HSD1 reduces metabolic efficacy and adiponectin synthesis in hypertrophic adipocytes[j]. J Endocrinol, 2015, 225(3): [8] WOODS C, TOMLINSON J W. The dehydrogenase hypothesis[j]. dvances in Experimental Medicine and iology, 2015, 872: [9] LVERY G G, ZIELINSK E, GTHERCOLE L L, et al. Lack of significant metabolic abnormalities in mice with liver-specific disruption of 11β-hydroxysteroid dehydrogenase type 1[J]. Endocrinology, 2012, 153(7): [10] RHMS L, SEMJONOUS N M, GUEST P, et al. iomarkers of hypothalamic-pituitary-adrenal axis activity in mice lacking 11β-HSD1 and H6PDH [J]. J Endocrinol, 2012, 214(3): [11] WNG N, RJSEKRN N, HOU T, et al. Comparison of transduction efficiency among various lentiviruses containing GFP reporter in bone marrow hematopoietic stem cell transplantation[j]. Experimental Hematology, 2013, 41(11): [12] GENG X, DOITSH G, YNG Z, et al. Efficient delivery of lentiviral vectors into resting human CD4 Tcells[J]. Gene Therapy, 2014, 21(4): ( 张蕾编辑 ) 欢迎订阅 中国现代医学杂志 中国现代医学杂志 创刊于 1991 年, 是一本医学综合性学术期刊 由中华人民共和国教育部主管, 中南大学湘雅医院承办 创刊以来始终坚持以服务广大医药卫生科技人员 促进国内外医学学术交流和医学事业发展为宗旨, 密切关注世界医学发展的新趋势, 积极推广国内医药卫生领域的新技术 新成果, 及时交流广大医药卫生人员的医学科学理论和业务技术水平, 成为国内外医学学术交流的重要园地, 已进入国内外多个重要检索系统和大型数据库 如 : 中文核心期刊 ( 中文核心期刊要目总览 和 2014 版 ) 中国科技论文与引文数据库即中国科技论文统计源期刊 (CSTPCD) 俄罗斯文摘(J) 中国学术期刊综合评价数据库 中国期刊网全文数据库 (CNKI) 中文科技期刊数据库 中文生物医学期刊文献数据库(CMCC) 超星 域出版 及中国生物医学期刊光盘版等 中国现代医学杂志 辟有基础研究 论著 临床研究 论著 综述 新进展研究 论著 临床报道 学术报告 病例报告等栏目 主要刊登国内外临床医学 基础医学 预防医学以及医学相关学科的新理论 新技术 新成果, 以及医院医疗 教学 科研 管理最新信息 动态等内容 主要读者为广大医药卫生科技人员 中国现代医学杂志 为旬刊(2017 年 7 月开始 ), 国际标准开本 (4 幅面 ), 全刊为彩色印刷, 无线胶装 内芯采用 90 g 芬欧汇川雅光纸 ( mm), 封面采用 200 g 紫鑫特规双面铜版纸 ( mm) 印刷, 每个月 日出版 定价 35 元 / 册, 全年 840 元 公开发行, 国内统一刊号 :CN /R ; 国际标准刊号 :ISSN ; 国内邮发代号 : 欢迎新老用户向当地邮局( 所 ) 订阅, 漏订或需增订者也可直接与本刊发行部联系订阅 联系地址 : 湖南省长沙市湘雅路 87 号 中国现代医学杂志 发行部, 邮编 : 电话 : ; 传真 : ; xdyx99@126.com 唯一官网网址 : 中国现代医学杂志 编辑部 17

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