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确庵纪
5 years ago
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1 中南大学学报医学版! 2:20 和 )!)) 在非小细胞肺癌中的表达及其相关性李婷周建华邓征浩傅春燕蒋海鹰高振芹王金胜任宏政王鹏中南大学湘雅医学院病理学系长沙长治医学院山西长治摘要目的探讨成纤维细胞生长因子 0 *))1 *()0 2:20 和骨桥蛋白 )!))0-7& 在非小细胞肺癌 )0(! ((!&' 组织中的表达及其相关性方法应用免疫组织化学 7 法分析例 &' 组织及例正常肺组织中 2:20 和 -7& 蛋白的表达水平采用 4$0 74 和.!! 印迹检测 2:20 对人肺腺癌细胞株 % 中 -7& 4&% 及蛋白表达水平的影响结果 &' 组织中 2:20 和 -7& 的阳性率分别为 # < 和 < 显著高于正常肺组织 < 和 (@ 2:20 和 -7& 的阳性表达与淋巴结转移临床分期密切相关均 (@ 与年龄性别和病理分型无明显相关均 (A 两者表达在 &' 中呈正相关 'B (@ 2:20 可以明显上调 % 细胞中 -7& 4&% 和蛋白的表达 (@ 结论 2:20 和 -7& 的高表达与 &' 的发生及侵袭转移有关 2:20 的促癌机制可能部分通过上调 -7& 的表达关键词 2:20 骨桥蛋白非小细胞肺癌中图分类号 44 文献标识码 % 文章编号 000 %;"" # 333! '9$ E,-C 6/&:E!) 2 C9%&:, :%-E!>.%&:C! 4/&,)!.%&:7! /&'*($% #$% ' '"% $" /$0$ $0, -62 $)+!!!!!) )**))1 *()0 2:20 )!)) -7& )0(! ((! &'!!!()!)!1!! 2:20-7& 9 ))(!(7!) 1! )!!(!!!0 ) )*2:20-7&!1 &' )!$!!*!()*2:20 ) -7&!!) 4&% )!!+! % (!1!! 4$074.!0! )$!3 $!)+!!!) )*2:20 # < -7& <! &'!1*(!! )! <!!(0 +! (@ $!!!) )*2:20-7&1()!!! )$&?!! )!! ("@ ))))(!!!)*&'0! ("A %)+!()!) 1*)!1!!!!!) )*2:20-7& &' 'B (@ $!!!) )*-7&)! 4&%10!! 2:20 % (!3!$!)+!!!) )*2:20-7&!! )!!0 收稿日期 " "# 作者简介李婷硕士助教主要从事肿瘤的基础研究通讯作者! 周建华 /0)() 基金项目 "!# 湖南省自然科学基金 # $1) 1)!!, &(!(!2) )74 #

2 2:20 和 )!)) 在非小细胞肺癌中的表达及其相关性李婷等 +) )*&'2:20 ))!!! +) )*&'!!)!!) )*-7&!!) ( )*))1 *()0 )!)) )0(! ((! 0 肺癌是世界范围内常见的恶性肿瘤其中 # < 以上的肺癌组织学类型是非小细胞肺癌 )0(! ((! &' 目前尽管诊断治疗水平不断提高但由于术后复发转移浸润等因素使得肺癌患者预后仍然较差因此寻找检测肺癌转移的指标已成为近年来的研究热点研究表明成纤维细胞生长因子 0 *) )1 *()0 2:20 和骨桥蛋白 )!)) -7& 均与恶性肿瘤的侵袭和转移有关 0 但两者在肺癌中的相关性研究尚未见报道本研究采用免疫组织化学 7 法检测 2:20 和 -7& 在 &' 组织中的表达进一步应用 4$074 和.!! 印迹方法研究外源性 2:20 对人肺腺癌细胞株 % 细胞 -7& 表达的影响探讨它们与 &' 发生发展和临床病理学特征的关系以期为肿瘤预后评估提供重要依据 * + 材料与方法材料人肺腺癌细胞株 % 为湘雅医学院病理学系保存细胞株肺癌组织标本的选取采用完全随机法选用中南大学湘雅医院年月至 # 年月手术切除后经病理学证实且临床病理资料完整的 &' 标本例其中腺癌例鳞癌例术前均未接受过化疗和放疗男性例女性例年龄 = K 岁正常肺组织例非肺癌尸体解剖肺组织肺癌的临床分期标准采用年国际抗癌协会 9 制定的 $&? 临床分期标准分为 = 期所有标本经 < 甲醛固定常规石蜡包埋连续切片厚 H 干烤作,/ 染色和免疫组织化学染色免疫组织化学切片由位高年资病理医师采取双盲法进行病理诊断及染色结果判断试剂免疫组织化学试剂盒辣根过氧化物酶,74 标记的羊抗兔二抗和 6%8 试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司人源性重组 2:20 购自英国 7!)!( 公司兔源性 )!)) 多克隆抗体兔源性 0( 多克隆抗体为美国公司产品 4$074 试剂盒购自美国 2!! 公司方法免疫组织化学染色法采用免疫组织化学链霉素抗生物素蛋白 0 过氧化物酶 7 法步骤按试剂盒说明书操作用已知的阳性切片作为阳性对照用 78 代替一抗作为阴性对照结果判定 2:20 和 -7& 蛋白的表达以细胞膜和或细胞浆内出现明确的棕黄色颗粒为阳性细胞采用双盲法参照文献提出的方法稍加改进作半定量分析观察切片至少个高倍视野不少于个细胞各视野中阳性细胞的平均百分数作为该切片的阳性细胞百分比进行记分 = < 为分 < = < 为分 < = < 为分 < = < 为分 A< 为分染色强度以多数阳性细胞呈现的染色特征为标准记分细胞未着色为分染色呈淡黄色为分棕黄色为分棕褐色为分最后以阳性细胞的百分比和染色强度记分之和所得的总分进行结果判定 = 分为阴性 = 分为阳性细胞培养将 % 细胞接种于含 < 胎牛血清的 470?9 培养液中在含 < - 和 < 空气的饱和湿度培养箱 H 连续培养每 = 传代次将对数生长期细胞按 ' 密度接种于培养瓶待生长达到 < 融合时换成无血清培养液同步化之后分组进行实验对照组不加 2:20 继续用无血清培养液培养刺激组用含 ' 的 2:20 的培养液培养 % 细胞处理结束后用冷 78 洗涤次后裂解细胞并提取蛋白.!! 印迹收集蛋白质采用 8% 法进行蛋白质定量后取蛋白质样品经 < 6 0 聚丙烯酰胺凝胶电泳 6 07%:/ 分离转膜后用 < 牛血清白蛋白 8% 封闭依次加入一抗 -7& I 0( I H 冰箱孵育过夜加入二抗 I 在 H 温箱孵育用 /' 显

3 中南大学学报医学版! 影结果经扫描后采用图像处理软件 9!$)) 9$ 测量蛋白质表达的相对灰度值以 0 ( 作内对照分别计算各组总蛋白的相对表达量 4$074 按 $49) 说明书提取细胞总 4&% 紫外分光光度法测定样品的纯度和浓度 4$074 操作按说明书进行引物均由上海生工生物技术有限公司合成 ( 上游引物 J0%$$%:%%:0 %:%%$$$%0 J 下游引物 J0::%%%:$$0 $:%$%$%%$%0 J 扩增产物大小为 0( 上游引物 J0$$$:::%$::%:$$0 J 下游引物 J0::%:%%$:%$$$:%$$$0 J 扩增产物大小为 -7& 和内对照 0( 的 74 反应条件为第一步 H 变性第步 H 变性 H 退火 H 延伸个循环最后 H 再延伸每个样本取 '(74 产物和 '0( 74 产物至同一加样孔 < 琼脂糖凝胶电泳后紫外光分析仪上观察照像并采用图像处理软件 9!0 $)) 9$ 测量灰度值计算 ( 4&% 的相关表达量统计学处理采用 7 统计软件实验数据以均数 K 标准差,K" 表示对两组实验数据采用独立样本的检验多个样本阳性率采用检验相关性分析采用! 秩相关分析法 (@ 为差异有统计学意义实验均重复遍 / + 结 + 果 2:20 和 -7& 在 &' 组织中的表达 2:20 和 -7& 蛋白的阳性信号主要定位于癌细胞胞浆和胞膜图 2:20 和 -7& 在肺癌组织的阳性表达率分别为 # < 和 < 显著高于正常肺组织的阳性表达率 < 和 < (@ 表表 *+0 组织中 ""/ 和 - 的表达,*+%;""/ -0 2:20-7& 组别阳性 < ( 阳性 < ( 肺癌组织正常肺组织图 *+""/ 和 - 在正常肺组织和肺癌组织中的表达法 4 %2:20 在正常肺组织中呈阴性表达 82:20 在肺鳞癌组织中呈阳性表达 2:20 在肺腺癌组织中呈阳性表达 6-7& 在正常肺组织中呈阴性表达 /-7& 在肺鳞癌组织中呈阳性表达 2-7& 在肺腺癌组织中呈阳性表达 "*+%;""/ -0! #33!! 4%&!+!!!) )*2:20 )! 87)+!!!) )*2:20 >)(()! 7)+!!!) )* 2:20!)(()! 6 &!+!!!) )*-7& )! / 7)+!!!) )*-7& >)(()! 2 7)+!!!) )*-7&!)(()!

4 2:20 和 )!)) 在非小细胞肺癌中的表达及其相关性李婷等 2:20 和 -7& 在 &' 组织中的表达与临床病理学参数的关系 2:20 和 -7& 在有淋巴结转移组的阳性表达率显著高于无淋巴结转移组临床分期中晚期 = 的阳性表达率显著高于临床分期的早期 = (@ 2:20 和 -7& 的表达均与 &' 患者的病理分型年龄性别无关 (A 表表 /+0 组织中 ""/ 和 - 的表达与临床病理学参数的关系,/+$3);""/ ! 组别年龄岁 A 性别男女病理分型鳞癌腺癌临床分期 = = 淋巴结转移无有 # # 2:20 阳性 < ( # # # # # # -7& 阳性 < ( # # 2:20 和 -7& 蛋白在 &' 组织中表达的相关性分析例 &' 中 2:20 与 -7& 同时阳性表达者例 2:20 阳性而 -7& 阴性者例 2:20 阴性而 -7& 阳性者例二者均阴性者例 2:20 与 -7& 表达呈正相关 'B 表表 +0 组织中 ""/ 与 - 表达的相关性分析,+3);""/ -0-7& 2:20 总数 ' ( 阴性阳性阴性阳性总数外源性 2:20 对 % 细胞中 -7& 表达的影响 % 细胞在未受 2:20 处理时对照组 ( 4&% 有一定的基础表达经 2:20 ' 处理后 4$074 结果显示刺激组与对照组比较 ( 4&% 表达增加图 % 细胞在未受 2:20 处理时对照组 -7& 的蛋白有一定的基础表达经 2:20 ' 处理后刺激组与对照组比较 -7& 的蛋白表达增加 (@ 图 '$% &$% $%!"# 图 /+$,$ 示 ""/ 作用 84= 细胞后 #$ 表达明显增高??! 对照组 2:20 ' 刺激组与对照组比较 (@ "/+$,$) ; #$)!!3 84= 3 )""/8 #0??! ))) 2:20 '!!))! 1!())) (@

5 # 中南大学学报医学版! 图 + 印迹示 ""/ 作用 84= 细胞后 - 蛋白表达明显增高对照组 2:20 ' 刺激组与对照组比较 (@ "+3) ;-)!!3 84= 3 )""/ )0 )) 2:20 '!! ))! 1!())) (@ + 讨 ++ 论 ;;14 基因定位于人类染色体的 > 基因全长 # 含有个外显子和个内含子其主要形式是分子质量为 # 6 的 2:20 蛋白目前的研究发现 2:20 在多种不同肿瘤组织及其患者血浆中表达升高 2:20 通过促进肿瘤血管生成和细胞增殖抑制肿瘤细胞凋亡等多种途径促进肿瘤的发生发展 0# 本研究结果显示 2:20 在 &' 组织中的表达明显高于正常肺组织 2:20 的表达水平与 &' 的侵袭转移临床分期密切相关与于敏等的报道基本一致提示检测 2:20 有助于判断 &' 的进展及预测肿瘤转移潜能 ( 基因定位于 > 是一个独立编码基因由个外显子和个内含子组成 -7& 广泛分布于多种组织和细胞具有多种生物学功能近年的研究发现 -7& 蛋白在人类许多肿瘤中高表达并与肿瘤细胞的生长侵袭转移密切相关 % 等在体外将转染野生型 ( 基因的乳腺癌细胞种植于裸鼠后发现其淋巴管浸润淋巴结转移及肺转移明显增加 9 等的研究发现内源性和外源性的 -7& 皆可增强人的结肠癌细胞的运动性和侵袭性并可降低细胞间的黏附能力从而促进肿瘤的进展和转移本研究结果显示 -7& 在 &' 组织中的阳性表达显著高于正常肺组织 -7& 的表达与患者的临床分期和淋巴结转移呈正相关与, 等的报道基本一致提示 -7& 蛋白的高表达可能使肿瘤细胞获得较强的转移能力 2:20 和 -7& 在 &' 侵袭和转移过程中的作用是否存在相关性国内外尚未见报道本研究结果显示两者的表达在 &' 中呈正相关提示两者在肺癌的发生发展中可能起协同作用两者的联合检测可作为判断肺癌侵袭转移的重要指标为进一步证实 2:20 和 -7& 在 &' 中的关系笔者以最常见的人肺腺癌细胞株 % 细胞为研究对象给予人重组 2:20 处理使用 4$074 和.!! 印迹方法检测 ( 4&% 及 -7& 蛋白表达水平的变化结果发现经 2:20 处理后 % 细胞中 -7& 的蛋白和 40 &% 表达水平升高这进一步验证了 2:20 和 -7& 之间具有相关性 '! 等研究发现 2:20 可以上调鼠主动脉内皮中 -7& 的表达从而引起新生血管形成因此笔者推测 2:20 促进肿瘤血管生成的机制部分是通过 -7& 的上调实现而本研究结果提示 2:20 的促 &' 发生及侵袭转移的作用亦可能部分通过增加 -7& 的表达来实现 2:20 和 -7& 的高表达促进了 &' 的侵袭与转移其中 2:20 的促癌机制可能部分与上调 -7& 的表达有关参考文献 C!%? $. /!(!( C % (!C 0 2) 6 6? + 8!!? 7!6 %)!! & )+!!!) ( *))1 *()!!!(! ++!!)* 2!)0 (! C 8C(! 0

6 2:20 和 )!)) 在非小细胞肺癌中的表达及其相关性李婷等.7D 3)7-!))!) )!0 C (!?!4!+ # 0 #?) 24!+)!9!)! *)0 ' (! C! 0 2% 4)1 8!!*!!')0! *)0 )10 ))(*((!)*)!((*)0 )1 *() 2:2!!)!1! ((! C 7)4!7( # 0-08? $!C7 C)! C2))1 *()0 C 9C8)(!!8) 0 郭科军张颐成纤维细胞生长因子在宫颈癌中的表达及对细胞增殖影响的研究 C 中国实用妇科与产科杂志 # 0 :- 3! E,%&: D$!)*2:2!!) (!+(((!!*!() (!)*!) C 0!!C))*7((:!()) -!( # 0 # 肖德胜曹慧秋邓征浩等 2:20 对小细胞肺癌细胞株 &9, ++ 表达及 ( 亚细胞定位的影响 C 中南大学学报医学版 # # 0 9%- 6!! %-,> 6/&: E!)!/*!( )*2:20 ) ++ (!)() )*( 0 (! ((!(!&90, C C! ) +?! ( # # 0 于敏李姝玉于湛等肝素酶和碱性成纤维细胞生长因子与非小细胞肺癌转移和预后的关系 C 中华病理学杂志 0 D? '9 D E!(*((!)*!! (*))1 *()!!) 0 )0(! ((! C C7) 0 4 4!% 24)!)*)!)) ))0!) C 8C(! # 0 # # % % ' :!)!4! %!4)!)*!0! )! )!)) (!)*!((! C % C7) ?(? D! $C-!))!!!* ()()) ()) ((!!+!)0! )!) C /?! 0, E ' 6-+!!!) )*)!)) )(! 1 )!!+!!)! )0(! ((! C (!4! 0 '!6 6! /7!,!-!)) /0 *))1 *()0 ()0 )!! C C9 ) # 0 本文编辑郭征

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