610 在美国和大部分欧洲国家, 结直肠癌是第 3 位常见的恶性肿瘤, 与肿瘤相关的死亡原因排第 2 位, 在这些病人中, 大约有 20% 的病人在获得临床诊断时已发生转移 [1] 西妥昔单抗靶向表皮生长因子受体 (epidermalgrowthfactorreceptor,egfr), 抑制细胞的

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1 中国病理生理杂志 ChineseJournalofPathophysiology 2014,30(4): [ 文章编号 ] (2014) 上 / 下调 mir 21 对结肠癌细胞的生物学作用 及对西妥昔单抗药物敏感性的影响 巩波 1,2, 李东风 3, 谢子钧 2, 段伊帆 2 2, 李子俊 ( 1 南方医科大学, 广东广州 ; 广东省人民医院, 广东省医学科学院 2 消化科, 3 医学研究中心, 广东广州 ) [ 摘要 ] 目的 : 探讨 mir 21 在结肠癌细胞中的生物学功能及对 EGFR 单抗西妥昔敏感性的影响 方法 : 通过慢病毒载体的构建及包装生成上调 / 下调 mir 21 的慢病毒 LV mir 21 和 LV anti mir 21 并感染人结肠癌 RKO 细胞, 采用 qrt PCR MTT 非锚定依赖性细胞生长 流式细胞术 CCK 8 等技术检测上调 / 下调 mir 21 后细胞的 mir 21 表达水平 细胞增殖 克隆形成能力 细胞凋亡能力及对西妥昔单抗药物敏感性的变化 结果 :LV mir 21 与 LV anti mir 21 慢病毒的滴度分别为 TU/L 和 TU/L, 将病毒颗粒分别感染人结肠癌 RKO 细胞, 观察绿色荧光, 感染效率在 80% 以上 LV mir 21 组的 mir 21 表达水平 细胞增殖能力和克隆形成能力均高于 LV anti mir 21 组, 差异有统计学意义 (P<0.05) 而 LV anti mir 21 组的细胞早期凋亡率及西妥昔单抗对细胞的抑制率均高于 LV mir 21 组 (P<0.05) 结论:miR 21 可促进结肠肿瘤细胞的增殖 下调 mir 21 可以增加结肠癌细胞对靶向治疗药物西妥昔单抗的敏感性 [ 关键词 ] 结肠肿瘤 ;mir 21; 西妥昔 [ 中图分类号 ] R363 [ 文献标志码 ] A doi: /j.isn Up/down regulationofmir 21changesbiologicalfunctionofcoloncan cercelsandsensitivitytocetuximab GONGBo 1,2,LIDong feng 3,XIEZi jun 2,DUANYi fan 2,LIZi jun 2 ( 1 SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China; 2 DepartmentofGastroenterology, 3 MedicalResearchCenter, GuangdongAcademyofMedicalSciences,GuangdongGeneralHospital,Guangzhou510080,China.E mail:zijunli2005@ aliyun.com) [ABSTRACT] AIM:ToexploretheefectsofmiR 21onbiologicalbehaviorofcoloncancercelsandtheirsensi tivitytoepidermalgrowthfactorreceptormonoclonalantibodycetuximab.methods:lentiviralvectorswereconstructed togenerateup anddown regulationsofmir 21lentiviruses(LV mir 21andLV anti mir 21,respectively),andthecor respondingnegativecontrolviruses(lv mir 21NCandLV anti mir 21NC,respectively)werealsoconstructed.Thevi ruseswereusedtoinfecthumancoloncancerrkocels.thechangesofthemir 21expresionlevel,thecelprolifera tion,thecolony formingability,thecelapoptosisandthesensitivityofthecelstocetuximabweredetectedbyreal time PCR,MTTasay,softagarcolonyasay,flowcytometryandCCK 8asay.RESULTS:ThelentivirustitersofLV mir 21,LV mir 2NC,LV anti mir 21andLV anti mir 21NCwere TU/L, TU/L, TU/L and TU/L,respectively.Theinfectioneficiencywasover80% bytheobservationofgreenfluorescence.the mir 21expresionlevel,thecelproliferation,andthecolony formingabilityinlv mir 21groupweresignificantlyhigher thanthoseinlv anti mir 21group.TheearlyapoptoticrateandtheinhibitoryrateofcetuximabforthecelsinLV anti mir 21groupwerehigherthanthoseinLV mir 21group.CONCLUSION:miR 21promotestheproliferationofcolon cancercels.down regulationofmir 21enhancesthesensitivityofthecoloncancercelstothetargetedtherapydrug cetuximab. [KEYWORDS] Colonneoplasms;miR 21;Cetuximab [ 收稿日期 ] [ 修回日期 ] [ 基金项目 ] 国家自然科学基金资助项目 (No ); 广东省科技计划 (No ); 广州市科技计划 (No. 11C ) 通讯作者 Tel: ;E mail:zijunli2005@aliyun.com

2 610 在美国和大部分欧洲国家, 结直肠癌是第 3 位常见的恶性肿瘤, 与肿瘤相关的死亡原因排第 2 位, 在这些病人中, 大约有 20% 的病人在获得临床诊断时已发生转移 [1] 西妥昔单抗靶向表皮生长因子受体 (epidermalgrowthfactorreceptor,egfr), 抑制细胞的生长 增殖和转移, 已被美国 FDA 批准用于 KRAS 野生型结直肠癌的治疗 [2] 但是并非所有 KRAS 野生型结直肠癌都能从西妥昔单抗治疗中获益, 据报道在占结直肠癌 60% ~70% 的 KRAS 野生型中, 只有其中 60% 获得治疗反应, 余下 40% KRAS 野生型结直肠癌治疗无效或耐药 [3] 而迄今研究表明 mir 21 在人体 31 种肿瘤中表达异常, 也是最常见的异常 microrna 之一, 是一种致癌性 microrna, 在多种肿瘤的发生和发展中起着重要的作用 本实验通过体外实验上调 / 下调 mir 21, 探讨其对人结肠癌细胞 RKO 的增殖 克隆形成能力及对西妥昔单抗敏感性的影响, 为下一步体内实验和临床研究提供依据 材料和方法 1 细胞人结肠癌细胞株 RKO( 购自中国科学院上海细胞研究所 ) 使用 MEM Alpha 培养基 (LifeTechnolo gies) 加 10% 胎牛血清 (LifeTechnologies),5% CO 2 37 培养 2 方法 2.1 慢病毒载体的构建根据人 mir 21 的基因序列, 制备上调 / 下调 mir 21 双链 DNAOligo, 设计包含目的基因序列和酶切位点的互补序列,LV mir 21 上游引物 5 CGGCCGCGACTCTAGTTATCAAATCCT GCCTGACTG 3, 下游引物 5 ATAAGCTTGATATCG TCCTCCCTCCATACTGCTG 3 ;LV anti mir 21 上游引物 5 CCGGTCAACATCAGTCTGATAAGCTATTTTTG 3, 下游引物 5 AATTCAAAAATAGCTTATCAGACTGAT GTTGA 3 将引物退火形成带黏性末端的双链 DNA, 利用 T4DNA ligase 分别连接到 GV217 和 GV159 载体上, 转化感受态细菌, 挑选转化的菌落, 用菌落 PCR 进行鉴定和测序 2.2 慢病毒载体的包装取生长状态良好的 293T 细胞消化重悬后按 1 5 比例传至 poly (D lysine) (PDL) 包被的 10cm 皿中, 加完全培养基 37 5% CO 2 细胞培养箱中继续培养约 24h, 细胞密度达 50% ~70% 时即可用于转染 取 1.5mL/dishOpti MEM 表达质粒 6μg/dish 包装质粒 PackagingMix6 μg/dish, 混匀, 室温下温育 5min; 取 1.5mL/dish Opti MEM 和 POLOdeli verer TM 3000Transfectionrea gent24μl/dish, 轻轻混匀, 室温下温育 5min 将两者混合, 室温下孵育 20min 将 DNA 与 POLOdeliv erer TM 3000Transfectionreagent 的复合液均匀地滴加在 293T 细胞的培养液中混匀, 于 37 5% CO 2 细胞培养箱中培养,48h 后荧光显微镜观察转染效率, 收集 293T 细胞上清液,4 暂存 ; 细胞更换新鲜完全培养基后继续培养至 72h, 收集病毒上清, 与第 1 次收集的混合, 于 r/min 离心 10min, 用 0 45μm 醋酸纤维素膜的滤器过滤于 Beckman SW28 离心管中, 每管装 36mL 病毒, r/ min 离心 2h, 弃上清, 每管用 130μL 预冷的 PBS 溶解沉淀, 每管 100μL 分装,-80 保存 2.3 慢病毒滴度测定测定前 1d, 取测定滴度所需的 293T 细胞, 每孔加 100μL, 个细胞接种到 96 孔板, 根据病毒的预期滴度, 准备 7~10 个无菌的 EP 管, 在每个管中加入 90μL 的无血清培养基, 将待测定的病毒原液 10μL 加入到第 1 个管中, 混匀后, 取 10μL 加入到第 2 个管中, 继续相同的操作直到最后 1 管 选取所需的细胞孔, 吸去 90μL 培养基, 丢弃, 加入 90μL 稀释好的病毒溶液, 放入培养箱培养,24h 后, 加入完全培养基 100μL 4d 后, 观察荧光表达情况 病毒滴度 = 阳性细胞数 计量孔稀释倍数 / 接种病毒体积 2.4 细胞感染取生长状态良好的 RKO 细胞, 胰酶消化后用全培养基重悬细胞, 每孔 个细胞接种到 6 孔板,37 5% CO 2 细胞培养箱中继续培养约 24h 取 6 孔板中的一孔细胞进行消化, 计数细胞, 根据 MOI 和细胞数量计算所需要的病毒量稀释到培养基中 ; 吸去旧培养基, 加入含病毒液的培养基, 同时设置阴性对照空载体组和空白对照组,12h 后换液, 继续培养 72h 后在荧光显微镜下观察荧光表达情况, 初步估计慢病毒感染效率 2.5 qrt PCR 检测 mir 21 的表达收集上调 / 下调 mir 21 阴性对照及空白对照的 RKO 细胞, 采用 Trizol 法提取细胞总 RNA 并测定总 RNA 的浓度及纯度 根据逆转录试剂盒 ReverTraAceqPCRRTKit (Toyobo) 合成 cdna, 反应条件为 37 15min,98 5min,4 终止 取逆转录产物作为模板, 用 Re altimepcrmastermix(sybr Green) 试剂盒 (Toyo bo) 进行 qrt PCR 检测, 以 U6 为内参照, 反应条件为 95 30s, 然后 95 10s,60 20s,72 30 s,45 个循环, 每个样品设置 4 个复孔 采用 Lightcy cle 罗式荧光定量 PCR 仪进行检测 采用 2 -ΔΔCt 法对数据进行分析

3 6 6 细胞增殖实验 取 对 数 生 长 期 的 上 调 下调 避光反应 5 5 h内流式细胞术检测 阴性对照及空白对照的 RKO细胞 胰酶消 9 西妥昔单抗敏感性检测 取对数生长期的上 4 化 细胞计数后按照每孔 个细胞接种到 96孔 调 下调 阴性对照及空白对照的 RKO细胞 板 每组设置 6个复孔 与实验孔平行设不加细胞只 胰酶消化 细胞计数后按照每孔 4 个细胞接种 加培养液的空白对照孔 分别接种 4块板 于培养后 到 96孔板 4h后 加入 3m L的西妥昔单抗 4h 4 8h 7h和 96h分别加入 MTT溶液 5 L 不同细胞设 3复孔 继续培养 4h后 弃培养液 每 μl w 37 继续孵育 4h 终止培养 小心吸弃 孔加入 μl无血清培养基及 μlcck 8 继续 孔内培养上清液 每孔加入 5μLDMSO 振荡 培养 每 3 在波长 45m测定吸光度 A值 直 使结 晶 物 充 分 溶 解 于 4 9m 波 长 处 测 定 A 至未加药孔的 A值为 时为最佳时间 细 值 胞抑制率 实验孔 A值 空白孔 A值 未加药孔 7 克隆形成实验 配置 和 7 无菌低熔 A值 空白孔 A值 点琼脂液体 4 维持 使之保持溶解状态 按 3 统计学处理 混合 琼脂糖和 完全培养基 按每孔取 ml 使用 S PSS 3 软件分析 数据以均数 ±标准 混合液注入 6孔板中 待冷却凝固 备用 收集对数 差 m ±SD 表示 采用单因素方差分析或重复测 生长期的上调 下调 阴性对照及空白对照的 量资料的方差分析比较转染不同慢病毒的细 胞 间 7 RKO细胞 制成 L的细胞悬液 按 比例 的表达 细胞增殖能力 克隆形成能力 细胞 7 琼脂和 完全培养基在无菌试管中混合 将 5为差异有统 凋亡 药物敏感性等的差异 以 P 3 后 取 ml混合液 ml单细胞悬液 w 充分混匀 注入已铺有底层琼脂的培养 板中 在室温放置 使细胞琼脂悬液凝固 将 计学意义 结 果 6孔板置于 CO 培养箱中 37 进行培养 培养 重组慢病毒的包装与转染 d 观察细胞克隆形成情况并计数 将构建好的慢病毒干扰质粒转染到 93T细胞 8 凋亡实验 胰酶消化上调 下调 阴性 中 包装产生重组慢病毒颗粒 通过观察绿色荧光 对照及空白对照的 RKO细胞 分别收集 5 可见 9 以上的细胞带有绿色荧光 见图 收集 5 细胞 在 5μLb d b 中 加 入 5μL7 浓缩病毒颗粒后测定 LV 与 LV AAD染液 混匀 收集细胞中加入上述 7 AAD染液 的滴度分别为 3 TU L和 TU L 混匀 室温避光反应 5 5 再加入 45μLb d 将病毒颗粒分别感染人结肠癌 RKO细胞 观察绿色 b 混匀后加入 μla x V PE混匀 室温 荧光 感染效率在 8 以上 见图 F 9 3T dw h h v p d A B LV C D LV A C v w B D p h v w 图 慢病毒干扰质粒感染的 9 3T细胞

4 6 F 3 Ex p d RKO 5v LV M ±S D 4 P LV NC P 5v LV LV NC 图 3 转染不同慢病毒的 RKO细胞的 表达水平 强 在第 天 3天 和 4天 LV 组 LV 组和空白组之间细胞增殖能力有明显差异 P 见图 4 F RKO dw hd v v A A LV B B LV NC C C LV D D LV NC A B C D v w A B C D p h v w 图 不同慢病毒转染的 RKO细胞 qrt PCR检测结肠癌细胞 RKO 转染慢病毒干 扰载体后 的表达 转染 LV LV 相应阴性对照 载体和空白组的 相对表达量分别为 9 4 5± 5 6 55± 3 7± ± 9和 ± 其中 LV 组的表达量高于其阴性对 F 4 P RKO w hd m M ±S D 6 P v LV 图 4 转染不同慢病毒的 RKO细胞的增殖能力 照组及空白组 差异有统计学意义 P 5 LV 组的 表 达 量 低 于 其 阴 性 对 照 组 及 空 白 组 差异有统计学意义 P 5 而阴性对照组与 5 见 空白组的 表 达 量 之 间 无 明 显 差 异 P 图 3 3 MTT检测人结肠癌细胞转染不同慢病毒后细胞 增殖能力的变化 MTT实验结果表 明 转 染 LV 后 随 着时间的增长 细胞的增殖能力明显降低 转染 LV 后 随着时间的增长 细胞的增殖能力明显增 4 转染不同慢病毒后克隆形成能力的变化 LV 组的细胞克隆形成能力明显高于其 组 P 阴性 对 照 组 空 白 组 和 LV 而 LV 组的细胞克隆形成能力低 于其阴性对照组和空白组 P 见图 5 5 转染不同慢病毒后细胞凋亡的变化 LV 组的 早 期 凋 亡 率 明 显 高 于 LV 组 P 见图 6 这说明下调 可以促进细胞的凋亡

5 613 Figure5. Colony formingabilityoftherko celswithdiferent treatments.mean±sd.n=3. P<0.01vsLV mir 21. 图 5 转染不同慢病毒的 RKO 细胞的克隆形成能力 Figure6.TheearlyapoptoticrateoftheRKOcelswithdiferent treatments.mean±sd.n=3. P<0.01vsLV anti mir 21. 图 6 转染不同慢病毒的 RKO 细胞的早期凋亡 6 下调 mir 21 可增强肿瘤细胞对靶向治疗药物西妥昔单抗的敏感性在 300mg/L 西妥昔单抗作用下,LV anti mir 21 组的细胞抑制率高于 LV mir 21 组, 差异有统计学意义 (P<0.05), 见图 7 讨论 MicroRNA 是一类内源性非编码小分子单链 RNA, 能够调控 mrna 的表达或翻译, 在生物体的发育 增殖 分化及凋亡等方面发挥重要的生理作用 [4] 近年来, 越来越多的研究表明, 许多 micro RNA 可作为原癌基因或者抑癌基因, 在肿瘤的发生和发展中扮演着重要的角色 目前发现, 食管癌 胃 Figure7.Theinhibitoryrateofcetuximab(300mg/L)onthe RKOcelswithdiferenttreatments.Mean±SD.n=3. P<0.05vsLV anti mir 21. 图 7 转染不同慢病毒的 RKO 细胞对西妥昔单抗的敏感性 癌 肝癌 胰腺癌 胆管癌 结直肠癌等肿瘤中 mir 21 的水平明显上调 mir 21 在众多肿瘤中呈现出癌基因样的作用, 在肿瘤的发生发展 增殖 凋亡 侵袭 转移等多种生物学行为中发挥着重要的作用 在结 [5] 肠癌的研究中,Scheter 等检测了 84 例结肠癌组织及其癌旁正常组织的 microrna 表达谱, 发现有 37 个 microrna 表达存在差异, 其中 mir 21 在癌组织中表达显著上调, 证实 mir 21 与结肠癌的发生密切相关 也有研究发现 mir 21 在乳腺癌组织中表达显著上调, 其表达上调水平与乳腺癌临床分期 淋巴结转移及预后相关 [6] 许多研究表明,microRNA 具有调节下游靶基因表达的作用 在大多肿瘤中高表达的 mir 21 很可能是通过调节增殖 凋亡相关基因 [7] 的表达而发挥促进肿瘤发生发展的作用 Park 等 研究发现, 低浓度的 mir 21 反义引物的核苷酸显著抑制胰腺癌细胞株的增殖, 抑制 mir 21 表达可使胰腺癌细胞株 HS766T 的凋亡增加 3~6 倍 我们的研究表明下调 mir 21 能够明显抑制结肠癌细胞对增殖及克隆形成能力等 此外,miR 21 在肿瘤药物的耐药性方面也有重要作用 [8] 目前研究认为 mir 21 调控肿瘤细胞对多种药物敏感性的机制主要与 mir 21 参与调控细 [9] 胞周期 抑制细胞凋亡有关 最初由 Meng 等关于 microrna 与化疗药物敏感性的研究发现, 抑制 mir 21 的表达能够增加胆管癌细胞对吉西他滨的敏感性 深入研究机制, 还发现 mir 21 通过激活 PTEN 依赖的 PI3K 信号通路从而调节吉西他滨介导的细胞凋亡, 说明 mir 21 在调节肿瘤细胞化疗敏感性方 [7] 面有重要作用 Park 等也发现反义 mir 21 能够

6 614 增强吉西他滨的敏感性 我们通过上调 / 下调人结肠癌细胞 RKO 的 mir 21 表达水平, 分析了 mir 21 对 RKO 细胞增殖 凋亡 克隆形成能力及对西妥昔单抗敏感性的影响, 发现下调 mir 21 能够抑制肿瘤细胞的增殖及克隆, 增加肿瘤细胞对西妥昔单抗药物的敏感性 这些结果表明 mir 21 的高表达可作为结直肠癌的分子标记物, 下调 mir 21 的表达, 在结直肠癌等肿瘤治疗中有应用前景, 值得深入研究和验证 [ 参考文献 ] [1] LamasMJ,DuranG,GalardoE.Anti EGFRtherapyin first linecolorectalcancer[j].expertrevanticancert her,2011,11(10): [2] AdelsteinBA,DobbinsTA,HarisCA,etal.Asystem aticreviewandmeta analysisofkrasstatusasthedeter minantofresponsetoanti EGFRantibodiesandtheimpact ofpartnerchemotherapyinmetastaticcolorectalcancer [J].EurJCancer,2011,47(9): [3] García SáenzJA,SastreJ,Díaz RubioGarcíaE.Biomar kersandanti EGFR therapiesforkraswild typemeta staticcolorectalcancer[j].clintransloncol,2009,11 (11): [4] FujitaS,ItoT,MizutaniT,etal.miR 21geneexpres siontriggeredbyap 1issustainedthroughadouble nega tivefeedbackmechanism[j].jmolbiol,2008,378(3): [5] ScheterAJ,LeungSY,Sohn J,etal.MicroRNAex presionprofilesasociatedwithprognosisandtherapeutic outcomeincolonadenocarcinoma[j].jama,2008,299 (4): [6] 颜黎栩, 黄马燕, 吴秋良, 等.miR 21 表达异常与乳腺癌临床病理特征及预后的关系 [J]. 中国病理生理杂志,2009,25(4): [7] ParkJK,LeeEJ,EsauC,etal.Antisenseinhibitionof microrna 21or 221arestscelcycle,inducesapopto sis,andsensitizestheefectsofgemcitabineinpancreatic adenocarcinoma[j]. Pancreas,2009,38(7):e190 e199. [8] MengF,HensonR,LangM,etal.Involvementofhuman micro RNAingrowthandresponsetochemotherapyinhu mancholangiocarcinomacellines[j].gastroenterology, 2006,130(7): [9] MengF,HensonR,Wehbe JanekH,etal.MicroRNA 21regulatesexpresionofthePTENtumorsuppresorgene inhuman hepatocelularcancer[j]. Gastroenterology, 2007,133(2):

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