第 4 期汪晶莹, 等. 上调双特异性磷酸酶 2 表达对胶质瘤细胞增殖凋亡及 STAT3 信号通路的影响 297 胶质瘤是人脑最常见的原发性肿瘤之一, 根据 WHO 分型分为 Ⅰ Ⅳ 型 [1] 目前胶质瘤的治疗仍以手术联合放疗化疗的综合治疗为主, 但对于恶性程度较高的胶质瘤治疗效果仍然欠佳,

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1 第 27 卷第 4 期 2017 年 7 月江苏大学学报 ( 医学版 ) JournalofJiangsuUniversity(MedicineEdition) Vol.27 No.4 Jul.2017 上调双特异性磷酸酶 2 表达对胶质瘤细胞增殖凋亡及 STAT3 信号通路的影响汪晶莹, 陈华标 ( 江苏大学医学院, 江苏镇江 ) [ 摘要 ] 目的 : 探讨双特异性磷酸酶 2(DUSP2) 基因对胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响及其可能的机制方法 : 构建 DUSP2 过表达慢病毒载体, 筛选出 DUSP2 稳定过表达的胶质瘤细胞株, 空载慢病毒转染并筛选后的胶质瘤细胞作为对照采用 CCK8 细胞毒性实验和克隆形成实验检测上调 DUSP2 表达后胶质瘤细胞增殖能力的变化 ; 蛋白质印迹法检测 DUSP2 STAT3 p STAT3(Tyr705/Ser727) bcl 2 p53 等蛋白表达水平结果 : 慢病毒载体感染细胞并筛选后, 荧光显微镜下观察显示荧光表达效率在 90% 以上蛋白质印迹结果显示 DUSP2 稳定过表达的胶质瘤细胞 ( 实验组 ) 中 DUSP2 表达较对照组明显上调 CCK8 细胞毒性实验结果表明, 实验组细胞活力较对照组明显下降 ; 克隆形成实验结果显示, 实验组细胞克隆形成数明显少于对照组蛋白质印迹结果表明, 实验组细胞中 p STAT3(Tyr705/Ser727) 及 bcl 2 表达显著下调,p53 表达上调结论 : 上调 DUSP2 的表达可显著抑制胶质瘤细胞的增殖, 并促进其凋亡, 其机制可能与 DUSP2 抑制了 STAT3(Tyr705/Ser727) 信号通路的磷酸化水平有关 [ 关键词 ] 双特异性磷酸酶 2; 信号传导与转录激活因子 3; 神经胶质瘤 [ 中图分类号 ] R739.4 [ 文献标志码 ] A [ 文章编号 ] (2017) DOI: /j.isn y [ 引用格式 ] 汪晶莹, 陈华标. 上调双特异性磷酸酶 2 表达对胶质瘤细胞增殖凋亡及 STAT3 信号通路的影响 [J]. 江苏大学学报 ( 医学版 ),2017,27(4): Efectofup regulatingdusp2onproliferationandapoptosisand STAT3signalingpathwayinthegliomacels WANGJing ying,chenhua biao (SchoolofMedicine,JiangsuUniversity,ZhenjiangJiangsu212013,China) [Abstract] Objective:Toinvestigatetheefectofdual specificityphosphatase 2(DUSP2)onthepro liferationandapoptosisinthegliomacelsanditsmechanisms.methods:thepuromycin screened DUSP2 overexpresiongliomacellinewasconstructedbythedusp2 overexpresionlentivirusvector, thentheabilityofproliferationwastestedbycck8andthecelcloneformationasays;theproteinex presionofdusp2,stat3,p STAT3(Tyr705/Ser727),bcl 2andp53weretestedbythewesternblot tinganalysis.results:afterthegliomacelswasinfectedbythelentivirusvectorandscreenedbythe puromycin,fluorescenceexpresioneficiencywasover90% underfluorescencemicroscope.thewestern blotinganalysisrevealedthatthedusp2 sexpresionofoverexpresiongroup(experimentalgroup)was markedlyincreasedcomparedwithcontrolgroup.thecck8experimentshowedthatthecelviabilityof experimentalgroupwassignificantlydecreasedthanthatofthecontrolgroup.thecelcloneformation testshowedthatthecelclonesoftheexperimentalgroupwereobviouslyfewerthanthatofthecontrol group.thep STAT3(Tyr705/Ser727),bcl 2weredownregulatedandp53wasupregulatedintheex perimentalgroup.conclusion:theover expresionofdusp2ingliomacelscaneficientlyinhibitglio ma sproliferationandpromoteitsapoptosisthroughthestat3(tyr705/ser727)signalingpathway. [Keywords] dual specificityphosphatase 2;signaltransducerandactivatoroftranscription3;glioma [ 作者简介 ] 汪晶莹 (1992 ), 女, 硕士研究生 ; 陈华标 ( 通讯作者 ), 教授, 博士, 硕士生导师,E mail:chenghuabiao@hotmail.com

2 第 4 期汪晶莹, 等. 上调双特异性磷酸酶 2 表达对胶质瘤细胞增殖凋亡及 STAT3 信号通路的影响 297 胶质瘤是人脑最常见的原发性肿瘤之一, 根据 WHO 分型分为 Ⅰ Ⅳ 型 [1] 目前胶质瘤的治疗仍以手术联合放疗化疗的综合治疗为主, 但对于恶性程度较高的胶质瘤治疗效果仍然欠佳, 如最常见的恶性星形细胞瘤, 单纯手术治疗 2 年生存率 50% 左右, 中位生存期 20~28 个月 [2] 目前对于胶质瘤的精准治疗变得十分热门, 找到一种安全有效的基因治疗方法显得尤为迫切双特异性磷酸酶 (DUSP) 属于酪氨酸特异性磷酸酶家族, 参与生物体内多种基本的生理活动 [3], 如生长调控信号转导等, 同时也与肿瘤的发生发展密切相关目前已发现的 DUSP 成员达 30 余种, 其中 DUSP2( 原名 PAC 1) 已被证实在多种肿瘤中表达明显下调, 如前列腺癌肺癌白血病及胶质瘤等, 且 DUSP2 可以通过多种信号通路调控肿瘤的发生发展 [4] 信号转导与转录激活因子 (signaltransducerand activatoroftranscription,stat) 蛋白家族是一组可以被不同的细胞因子受体激活的相关蛋白, 在细胞信号转导的过程中充当载体, 在这些 STAT 蛋白当中, STAT3 与肿瘤的关系最为密切, 如头颈部癌乳腺癌多发性骨髓瘤等恶性肿瘤有文献报道 [5], 在自身免疫性疾病中,DUSP2 可调控 STAT3 的转录活性, 但两者在胶质瘤中的关系目前尚未明确为此, 本实验构建了 DUSP2 过表达的慢病毒载体, 并筛选出了 DUSP2 过表达稳定转染 U87 细胞株, 从而探讨上调 DUSP2 对胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响及可能的机制 1 材料与方法 1.1 材料 U87 胶质瘤细胞系 ( 中国科学院上海细胞研究所 );DUSP2 OE 质粒及 LV control( 对照组 ) LV DUSP2 OE( 实验组 ) 慢病毒液 ( 上海吉凯基因化学技术有限公司 );CCK 8 检测试剂盒 SDS PAGE 凝胶配制试剂盒 ( 上海碧云天生物技术有限公司 ); DUSP2 p53 蛋白抗体 ( 美国 Abcam 公司 );bcl 2 p STAT3(Tyr705/Ser727) STAT3 β 肌动蛋白 ( 美国 CST 公司 ); 羊抗兔羊抗鼠二抗 ECL 发光剂 ( 美国 Milipore 公司 ); 嘌呤霉素 ( 美国 Sigma 公司 ); 胎牛血清 DMEM( 美国 Gibco 公司 ); 双抗 ( 美国 Hyclone 公司 ); 荧光显微镜 ( 日本奥林巴斯公司 ) 1.2 方法分组实验组 :DUSP2 稳定过表达的胶质瘤 U87 细胞, 对照组 : 空载慢病毒转染并筛选后的胶质瘤 U87 细胞, 两组细胞均带有 GFP 标签, 荧光显微镜下可表达绿色荧光细胞培养 U87 细胞为贴壁生长, 经人脑胶质母细胞瘤单克隆成系, 按 WHO2007 年分级标准为 Ⅳ 级采用 DMEM 完全培养基 (10% 胎牛血清 + 1% 双抗 ) 置于培养箱 (37 5%CO 2 饱和湿度 ) 孵育 DUSP2 过表达稳定转染细胞株的构建将病毒液 (LV control LV DUSP2 OE) 分别加入已预先铺好 U87 细胞的 6 孔板内,48h 后换液, 荧光显微镜下观察荧光表达效率, 换成含有 4μg/mL 嘌呤霉素的培养液, 培养 36h, 观察细胞状态, 逐渐降低药物浓度, 最终维持在 2μg/mL, 荧光显微镜下观察荧光表达效率 1.3 CCK8 细胞毒性实验分别计数实验组和对照组细胞数, 按每孔 500 个细胞接种于 96 孔板, 分别培养 h 后, 向培养板中每孔加入 10μLCCK8 液, 孵育 1h 后使用 Biotek 酶标仪检测各样本的光密度 (D) 值细胞活力 (%)=( 各样本 D 值 / 对照组 48h 时 D 值 ) 100% 每组 3 个复孔 1.4 克隆形成实验两组细胞经胰酶消化, 充分吹打混匀, 常规培养液重悬, 制备成单细胞悬液, 细胞终浓度约为 30 个 / ml 每组 3 个复孔每孔加入约 200 个细胞, 并适当振动以使细胞均匀分散置入恒温培养箱中, 每 3 天换培养液 1 次, 连续培养 14d 后, 以低聚甲醛固定细胞, 加入结晶紫染色,PBS 清洗 3 遍, 常温干燥 1.5 蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白及 STAT3 磷酸化水平提取实验组和对照组两组细胞 ( 约个 ) 总蛋白, 配制 10% 的分离胶和 5% 的浓缩胶, 然后将蛋白加入蛋白孔进行电泳电泳结束后, 转膜和封闭, 一抗 (DUSP2 β 肌动蛋白 bcl 2 p53 STAT3 p STAT3) 孵育过夜 (4 ) 洗膜, 二抗孵育 1.5h 后显色重复实验 3 次 Gel pro 软件分析条带灰度值, bcl 2 p53 蛋白的相对表达量为 bcl 2 或 p53 蛋白与 β 肌动蛋白的比值,STAT3 磷酸化水平为 p STAT3 (Tyr705/Ser727) 与总 STAT3 的比值上述实验步骤重复 2 次 1.6 统计学方法应用 SPSS13.0 软件进行统计, 计量资料以均数 ± 标准差表示, 两组采用成组资料 t 检验,P< 0.05 为差异有统计学意义

3 江苏大学学报医学版２９８第２７卷显少于对照组图５２结果１ＤＵＳＰ２过表达慢病毒载体及稳定转染胶质瘤细胞系的鉴定ＤＵＳＰ２过表达质粒酶切电泳见图１包装成慢病毒感染细胞并经嘌呤霉素筛选后荧光显微镜下观察发现荧光表达效率在９以上图２ａＰ５与对照组比较图４ＤＵＳＰ２过表达对Ｕ８７细胞活力的影响Ｍ１ｋｂ标准参照物１载体酶切产物２未酶切载体图１ＤＵＳＰ２过表达质粒酶切电泳图图５ＤＵＳＰ２过表达对Ｕ８７细胞克隆形成能力的影响３ＤＵＳＰ２过表达促进胶质瘤Ｕ８７细胞的凋亡蛋白质印迹实验检测凋亡相关蛋白水平结果５３明显上调抗凋亡蛋显示实验组细胞凋亡蛋白ｐ白ｂｃｌ２明显下调图６图２慢病毒感染细胞并筛选后的荧光表达效率１蛋白质印迹实验显示实验组胶质瘤Ｕ８７细胞中ＤＵＳＰ２蛋白表达较对照组明显上调图３从而进一步证实实验组ＤＵＳＰ２过表达稳定转染细胞系构建成功图３蛋白质印迹验证实验组ＤＵＳＰ２蛋白的表达２ＤＵＳＰ２过表达抑制胶质瘤Ｕ８７细胞的增殖ＣＣＫ８细胞毒性实验结果图４表明实验组细胞相较于对照组增殖能力受到明显抑制Ｐ５克隆形成实验证实实验组克隆形成数明图６ＤＵＳＰ２过表达对凋亡相关蛋白的影响４ＤＵＳＰ２过表达抑制ＳＴＡＴ３Ｔｙｒ７５Ｓｅｒ７２７的磷酸化水平蛋白质印迹检测结果显示实验组ＳＴＡＴ３的磷酸化水平较对照组显著降低图７

4 第 4 期汪晶莹, 等. 上调双特异性磷酸酶 2 表达对胶质瘤细胞增殖凋亡及 STAT3 信号通路的影响 299 图 7 过表达 DUSP2 对 STAT3 磷酸化水平的影响 3 讨论近十年来关于肿瘤基因疗法的研究已逐渐深入, 对于人颅内最常见的神经胶质瘤亦不例外高级别神经胶质瘤因其极强的增殖和侵袭能力, 具有较高的病死率和复发率, 术后通过放化疗等手段可显著延长生存期, 因而临床上胶质瘤的治疗仍以手术联合放化疗为主胶质瘤的发生发展是一个极其复杂的过程, 涉及多种因素及信号通路的参与 [6] DUSP2 是酪氨酸磷酸酶家族成员之一 [7], 起初发现其广泛表达于淋巴组织, 参与免疫调节等生理过程 [8] 近年来的研究发现,DUSP2 与多种肿瘤的发生发展密切相关, 如卵巢癌 [9] 黑色素瘤 [10] 白血 [11] [12] 病等, 其中也包括神经胶质瘤 Karakashev 等研究认为,DUSP2 表达水平与肿瘤的恶性程度呈负相关, 恶性程度越高的胶质瘤, 其转录活性受到明显抑制其机制可能与肿瘤乏氧环境激活缺氧诱导因子 1(HIF 1) 有关,HIF 1 通过抑制 DUSP2 的转录活性, 进而调控其表达水平 [13] 本实验结果显示, 过表达 DUSP2 基因的慢病毒载体转染胶质瘤细胞后, DUSP2 蛋白表达水平明显上调,CCK8 细胞毒性及克隆形成实验显示,DUSP2 过表达后胶质瘤细胞的活力显著下降, 且形成的克隆数亦明显少于对照组, 说明上调 DUSP2 的表达可有效抑制胶质瘤细胞的增殖能力此外, 蛋白质印迹实验表明, 实验组的抗凋亡蛋白 bcl 2 明显下调, 凋亡蛋白 p53 显著上调, 说明 DUSP2 过表达可促进胶质瘤细胞的凋亡这一结果进一步验证了 DUSP2 基因很可能是胶质瘤的抑癌基因之一, 在肿瘤的增殖分化侵袭过程中起到关键性的作用 STAT3 在细胞内起着重要的信号转导作用 [14], 细胞因子与表面受体结合后, 经过一系列过程使得 STAT3 分子 C 末端的酪氨酸残基 (Y705) 发生磷酸化, 然后通过其 SH2 结构域形成二聚体, 并转移到胞核诱导靶基因的转录大量研究证实 [15],STAT3 在细胞恶变过程中起关键性作用 STAT3 的持续活化可促使细胞变异并延长肿瘤细胞的生存周期 [16] 其机制可能与 STAT3 编码 bcl 2 抗凋亡基因细胞周期蛋白 D1 以及促血管生成因子 VEGF 有关 [17-18] 此外,STAT3 还可通过与 c Jun 相互作用抑制 Fas 的表达, 从而抑制肿瘤细胞的凋亡 [19] 本实验中, 上调 DUSP2 的表达后胶质瘤细胞 STAT3 的磷酸化水平明显降低, 进一步证实了 DUSP2 与 STAT3 在恶性胶质瘤中的调控关系, 但具体的调控机制仍需深入研究综上所述,DUSP2 在神经胶质瘤的发生发展中具有关键性的作用, 对该基因转录翻译过程的调控研究, 有望为神经胶质瘤患者寻找到一种新的基因靶向治疗策略 [ 参考文献 ] [1] BratDJ,ScheithauerBW,FulerGN,etal.Newlycod ifiedglialneoplasmsofthe2007whoclasificationof TumoursoftheCentralNervousSystem:angiocentric glioma,pilomyxoidastrocytomaandpituicytoma[j]. BrainPathol,2007,17(3): [2] SiegelRL, MilerKD, JemalA. CancerStatistics, 2017[J].CACancerJClin,2017,67(1):7-30. [3] CauntCJ, Keyse SM. Dual specificity MAP kinase phosphatases(mkps):shapingtheoutcomeofmapki nasesignaling[j].febsj,2013,280(2): [4] GrifinAC,KernMJ,KirkwoodKL.MKP 1isesential forcanonicalvitamind inducedsignalingthroughnucle arimportandregulatesranklexpresionandfunction [J].MolEndocrinol,2012,26(10): [5] LuD,LiuL,JiX,etal.ThephosphataseDUSP2con trolstheactivityofthetranscriptionactivatorstat3and regulatesth17diferentiation[j].natimmunol,2015, 16(12): [6] EderK,KalmanB.Molecularheterogeneityofglioblas tomaanditsclinicalrelevance[j].patholoncolres, 2014,20(4): [7] YiH,MortonCC,WeremowiczS,etal.Genomicor ganizationandchromosomallocalizationofthedusp2 gene,encodingamapkinasephosphatase,tohuman

5 300 江苏大学学报 ( 医学版 ) 第 27 卷 2p11.2-q11[J].Genomics,1995,28(1): [8] RohanPJ,DavisP,MoskalukCA,etal.PAC 1:ami togen inducednuclearproteintyrosinephosphatase[j]. Science,1993,259(5102): [9] Givant HorwitzV,DavidsonB,GoderstadJM,etal. ThePAC 1dualspecificityphosphatasepredictspoor outcomeinserousovariancarcinoma[j].gynecolon col,2004,93(2): [10] ZamanS,WangR,GandhiV.Targetingexecutioner procaspase 3withtheprocaspase activatingcompound B PAC 1inducesapoptosisinmultiplemyelomacels [J].ExpHematol,2015,43(11): e3. [11] KothapaliR,YoderSJ,KusmartsevaI,etal.Charac terizationofavariantofpac 1inlargegranularlympho cyteleukemia[j].proteinexprpurif,2003,32(1): [12] KarakashevSV,ReginatoMJ.Hypoxia/HIF1αinduces lapatinib resistance in ERBB2 positive breastcancer celsviaregulationofdusp2[j].oncotarget,2015,6 (4): [13] LinSC,ChienCW,LeeJC,etal.Suppresionofdual specificityphosphatase 2byhypoxiaincreaseschemore sistanceandmalignancyinhumancancercels[j].j ClinInvest,2011,121(5): [14] HiranoT,IshiharaK,HibiM.RolesofSTAT3inme diatingthecelgrowth,diferentiationandsurvivalsig nalsrelayedthroughtheil 6familyofcytokinereceptors [J].Oncogene,2000,19(21): [15] YangXW,LiL,HouGJ,etal.STAT3overexpresion promotesmetastasisinintrahepaticcholangiocarcinoma andcorelatesnegativelywithsurgicaloutcome[j].on cotarget,2017,8(5): [16] HanTJ,ChoBJ,ChoiEJ,etal.InhibitionofSTAT3 enhancestheradiosensitizingefectoftemozolomidein glioblastomacelsinvitroandinvivo[j].jneurooncol, 2016,130(1): [17] BrombergJ.Statproteinsandoncogenesis[J].JClin Invest,2002,109(9): [18] XueC,XieJ,ZhaoD,etal.TheJAK/STAT3signal lingpathwayregulatedangiogenesisinanendothelial cel/adipose derived stromalcelco culture, 3D gel model[j].celprolif,2017,50(1).doi: / cpr [19] IvanovVN,BhoumikA,KrasilnikovM,etal.Coopera tionbetweenstat3andc junsuppresesfastranscrip tion[j].molcel,2001,7(3): [ 收稿日期 ] [ 编辑 ] 何承志 ( 上接第 295 页 ) [26] DaiC,WangF,WangX,etal.Arthroscopicsingle bun dleanteriorcruciateligamentreconstructionwithsix strandhamstringtendon alograftversusbone patelar tendon bonealograft[j].kneesurgsportstraumatol Arthrosc,2016,24(9): [27] ConteEJ,HyatAE,GatCJJr,etal.Hamstringauto graftsizecanbepredictedandisapotentialriskfactor foranteriorcruciateligamentreconstructionfailure[j]. Arthroscopy,2014,30(7): [28] MoreyVM,NagHL,ChowdhuryB,etal.Aprospective comparativestudyofclinicalandfunctionaloutcomesbe tweenanatomicdoublebundleandsinglebundleham stringgraftsforarthroscopicanteriorcruciateligamentre construction[j].intjsurg,2015,21: [29] MartinsCAQ,KropfEJ,ShenW,etal.Theconceptof anatomicanteriorcruciateligamentreconstruction[j]. OperTechnSportMed,2008,16(3): [30] vaneckcf,martinsca,vyassm,etal.femoralin tercondylarnotchshapeanddimensionsinacl injured patients[j]. KneeSurgSportsTraumatolArthrosc, 2010,18(9): [ 收稿日期 ] [ 编辑 ] 刘星星

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽