姜黄素通过调节 信号通路抑制结肠癌细胞上皮间质转化 陈海滔 徐 超 姚庆华 浙江中医药大学第二临床医学院 浙江杭州 浙江中医药大学第一临床医学院 浙江杭州 浙江省肿瘤医院浙江省中西医结合肿瘤重点实验室 浙江杭州 摘要 目的 探讨姜黄素对结肠癌细胞上皮间质转化! 的作用机制 方法 通过!" 检测姜黄素

姜黄素通过调节 信号通路抑制结肠癌细胞上皮间质转化 陈海滔 徐 超 姚庆华 浙江中医药大学第二临床医学院 浙江杭州 浙江中医药大学第一临床医学院 浙江杭州 浙江省肿瘤医院浙江省中西医结合肿瘤重点实验室 浙江杭州 摘要 目的 探讨姜黄素对结肠癌细胞上皮间质转化! 的作用机制 方法 通过!" 检测姜黄素对 #$!% 细胞活性的影响 运用 &' ($ 检测不同浓度姜黄素对 #$!% 细胞 相关基因!$)* 及! 相关基因 +,' 和 - 的表达情况 结果 姜黄素能明显抑制 #$!% 细胞的增殖活性 在,*, 和 *., 的 /$ 0 分别是 %1.%.1%*1 和.* 姜黄素能下调 #$!% 细胞内 和!$)* 的表达水平 同时显著性上调 +,' 及下调 - 表达水平 且呈剂量依赖性 信号通路活化剂能上调姜黄素处理后细胞内的 表达和下调 +,' 表达水平 结论 姜黄素通过抑制 信号通路 从而抑制肿瘤细胞上皮间质转化 主题词 姜黄素 信号通路 上皮间质转化中图分类号 文献标识码 文章编号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据 >;;$8 于 年公布的数据显示 在 基金项目 国家自然科学基金.%. 通讯作者 姚庆华 主任医师 博士 硕士生导师 浙江省肿瘤医院中西医结合科主任 浙江省杭州市半山东路 号 4,<='7 收稿日期 % 全球范围内 大肠癌居男性恶性肿瘤发病率第三位 女性恶性肿瘤发病率第二位 在我国 结肠癌的发病?* 率持续上升 研究证明结肠癌的发生发展是一个多阶段 多因素的过程 有效抑制结肠癌的转移发生

!"#$%&%'% 是临床面临的主要难题 目前发现肿瘤的侵袭转移与上皮间质转化 "$ () 密切相关 () 是指上皮细胞在特定的生理 * 和病理情况下向间质细胞转化的现象 在肿瘤生长的演变进程中 () 主要包括了细胞极性的变化 细胞骨架的重建 细胞间黏附的丧失以及肿瘤基 + 底膜和细胞外基质的破坏 从而获得高迁移 侵袭 抗凋亡及降解细胞外基质等间质表型特征,- " 信号通路异常激活在结肠癌发生中起着重要作用,-" 信号通路不仅能够上调 ). &/&/ 等转录因子的表达 而且 "-)0-10 还能促进 0" 和 ' 基因转录水平 诱导肿瘤细胞 () 姜黄素 " " 是从姜科植物根茎中提取的一种抗氧化剂多 & 酚 具有药理作用广泛且毒副作用小的优点 研究发现姜黄素对多种肿瘤的侵袭转移具有明显的抑 &&& 制效果 本研究通过使用姜黄素体外处理结肠癌 )&&+ 细胞 探讨姜黄素抑制结肠癌细胞上皮间质转化的具体作用机制 & 材料与方法 材料细胞株 结肠癌细胞系 )&&+ 来自浙江省胃肠病学重点实验室 药材 姜黄素 购自 /# 公司 姜黄素粉末用 (/! 溶解 配置成原溶液为 &-1 抗体 " 购自 " 公司 )02 3 购自 /) 公司 4"5 和 ' 购自 /# 公司 " 购自 6 公司, 信号通路活化剂 3,78 ++43 购自 7" 公司 4 " 上下游引物 购自 9:# 公司 * );77;);;;); ;)7)7;7;; 和 *;);;;)7));7);); 所需的相关仪器和设备由浙江大学邵逸夫实验室提供 实验方法 细胞培养人类 )+ 结肠癌细胞用含有 胎牛血清的 (9&+2 培养基在 和 *! 环境下培养 细胞存活率大于 每次传代用 * 胰蛋白酶 )7 消化 * 以 &2&+ 的比例传代 实验 所用细胞均处于对数生长期 & ()/ 实验先用胰酶消化 吹打成单细胞悬液 每孔接种 & 个细胞于 + 孔板中培养 平行孔每组 * 个 2 后使用 & 终浓度分别为 *-1 &-1-1 的姜黄素处理细胞 分别培养 &22 后弃培养液 加入 & 的 ()/ 液 继续培养 2 显色 最后用 2 波长读取各孔吸光度值 &, 检测蛋白用不同浓度姜黄素 &-1-1 处理细胞 2 提取各组细胞总蛋白 用姜黄素 &-1 处理, 信号通路活化剂处理 & 的 )&&+ 细胞 2 提取细胞总蛋白 67 检测试剂盒测定各组细胞的蛋白浓度 分别取总蛋白 &*# 上样 经 & 分离胶及 * 浓缩胶 //7; 凝胶电泳后湿转法转 '0 膜 加入特异性一抗 2 过夜 与二抗室温孵育 后 1 化学发光剂于暗室中曝光和显影 测定蛋白条带的光密度值 以表示蛋白的相对表达水平 实验重复 次 &2 检测 7 用不同浓度姜黄素 -1-1 处理细胞 2 提取各组细胞总 7 电泳鉴定其完整性 "7 7": 试剂盒逆转录总 7 得到 " 7 用 55! 稀释 逆转录条件 * * * 最后维持 2 再以 "7 以模板 与基因特异性引物 通过 扩增 " 扩增条件为 预变性 2 进入循环 2 * * * 2 个循环后 2 对解离曲线进行分析 确保只有单一产物被扩增 最终进行测定分析 实验重复 次 * 激活, 信号通略 检测 () 相关基因表达实验分为 组 即空白对照组, 活化剂 姜黄素组和姜黄素组, 活化剂 姜黄素组是先用, 信号通路活化剂 &-1 作用 )&&+ 细胞 & 再用姜黄素 &-1 处理该细胞 2 姜黄素组是直接用姜黄素 &-1 处理细胞 2 分别检测各组细胞内 " 和 "5 的表达水平 统计学处理采用 /// & 统计软件进行数据分析 计量资料以均数 标准差 表示 两组以上比较采用 +

单因素方差分析 组间比较采用 方法 为差异有统计学意义 结果 姜黄素对 结肠癌细胞的增殖活性的影响 用不同浓度姜黄素!"#$%!"#$%!"#$% 作用细胞 &'& 和 '& 细胞活性受到不同程度的抑制 且呈浓度依懒性 ()* 姜黄素对 细胞在 &'& 和 '& 的 + 分别是,!"#-%, ',!"#-% 和 '!"#-% 可见 姜黄素能明显抑制 细胞增殖活性的作用 姜黄素抑制./0-10*// 信号通路相关基因的表达 用不同浓度姜黄素!"#-%!"#-% 处理 细胞 '& 后 检测细胞内 10*// 和 ' 表达水平 运用.*0*)/ #"0 检测基因蛋白水平 ()* 结果发现与对照组, 相比 在低 高浓度姜黄素作用下细胞内 10*// 的相对表达量降低 分别为, 和 ' 同时 与对照组,, 相比 在低 高浓度姜黄素组中 ' 的相对表达也显著性下调 分别为 和, 差异有统计学意义 运用 2 检测基因! 表达水平 ()* 3 发现 10*//! 的相对表达水平在姜黄素组与对照组, 相比明显降低 分别为 和 差异有统计学意义 表明姜黄素能明显抑制 细胞内./0 信号通路的表达 姜黄素抑制 细胞内 45 相关基因的表达 用不同浓度姜黄素!"# - %!"# - % 处理 细胞 '& 后 检测细 10*// 10/ ()1(!/!"#-%!"#-% 胞内 416&*)/ 和 7!*/0/ 的蛋白表达水平 运用.*0*)/ #"0 检测基因蛋白水平 ()* 与对照组, 相比 在低 高浓度姜黄素组中细胞内 416&*)/ 的相对表达量分别为, 和 ', 7!*/0/ 在低 高浓度姜黄素组中的相对表达量分别为, 和 明显低于对照组,, 组间差异存在统计学意义 随着姜黄素浓度的增加 其表达水平改变越明显 表明姜黄素能抑制 细胞的上皮间质转化 激活./0 信号通路 逆转姜黄素对 45 相关基因的抑制作用 *#09* 90#0: "; 10*// /6 ' )"0*/ / : 6;;*)*/0 6"* "; 1()1(!/ 与空白对照组 相比./0 活化剂 8 姜 ()1(!/!"#-% *#09* 10*// *)*"/ / & '& '&!"#$ %#" #&! ''$ #"# ()1(!/!"#-% 310*//! / : 6;;*)*/0 6"* "; 1()1(!/ ())$! '"#$$ "$ $

!"#$%&%'% )"( '- " "- 3 3-3-!"# "# $% &' # #!% 黄素组 " 的相对表达量为 & 单纯姜黄素组的相对表达量为 + 此外 与空白对照组 相比 )"( 在 / 活化剂. 姜黄素组的相对表达为 + 在姜黄素组的相对表达为 &# 其各组差异有统计学意义 23 454 检测基因 -4 表达水平发现 与空白对照组 & 相比 " -4 相对表达量在 / 活化剂. 姜黄素组为 && 在姜黄素组的相对表达量为 且 / 活化剂. 姜黄素组与单用姜黄素组间差异有统计学意义 2&6# 78 表明 / 活化剂能逆转姜黄素对 / 信号通路和 )9 的影响 7 " )"( "./ " ( )"( *&&+,$ ""- ""-. / 0$ "1 () * 41 " *+ 讨论 +!,,# +!,# &' 3 & &3 3 3 研究发现 上皮间质转化 )9 是肿瘤演变进程中的重要生物学过程 通过 )9 肿瘤细胞逐渐由上皮细胞表型向转换间质表型转变 并获得增强的迁移和侵袭能力 该过程通常是由多种生长因子 如 :): 等 诱导活化 /;9 等信号转导途径的级联反应 进而通过一系列表观遗传调控反应事件 活化转录调控因子 ;;# 等 下调上皮标记物的表达 导致肿瘤起始细胞的抗凋亡和浸 润侵袭等能力增强 最终促进肿瘤发生发展 因此 / 信号通路作为 )9 的重要途径之一 不仅可以通过转导经典 / 途径来决定细胞的命运 也 可以与非经典 / 途径控制组织极性和细胞运动 研究证实 / 信号通路可通过经典和非经典的途径分别激活 99 家族的相关基因 而 99 又可以通过降解基底膜和细胞外基质 改变上皮细胞的微环境 使 )"( 表达下降 '- 表达上调 促进 )9 的进程 此外 / 信号通路还可通过诱发 : 内皮素 等多种因子促进肿瘤 )9 因此 通过调节 / 信号的活性 进而有效抑制肿瘤细胞 )9 介导的侵袭转移是目前临床上亟待解决的问题 在临床上 以姜黄素为主要成分的中药 如郁金 姜黄 广泛运用于抗肿瘤治疗 能减少肿瘤复发风险 延长患者的生存期./ 7" -4 *&&+,$ ""- ""-. / 0$ "1 3 ;- 等用一种胶囊式的标准的姜黄提取物 包含姜黄素 +3-# 治疗 例标准化疗的晚期结直肠癌患者 发现其耐受性较好 无剂量限制性毒性 同时能使诱导型 :) 降低 同时 在胰腺癌 皮肤 细胞淋巴瘤 多发性骨髓瘤 乳腺癌等肿瘤患者中均有一定的抗肿瘤作 用 此外 姜黄素已被证明能够抑制致癌物质的活化和血管生成 具有调节细胞存活和凋亡的作用

对肺癌 乳腺癌和前列腺癌均有抗侵袭和抗转移的 功效 研究还发现在骨肉瘤 非小细胞肺癌中姜黄素可通过抑制 信号通路从而抑制细胞侵袭 转移及生长 我们研究了姜黄素抗结肠癌细胞侵袭转移的具体机制 在当前研究中 我们发现姜黄素能显著性抑制 结肠癌细胞的增殖活性 同时 姜黄素通过下调 信号通路的关键基因 及下游转录因子! 的表达 抑制 信号通路 与此同时 姜黄素还能促进上皮标志物 "#$% 表达 减少间质标志物 & ' 的表达水平 抑制 结肠癌细胞 " 的进程 为明确姜黄素是否通过调节 信号通路从而影响结肠癌的 " 本实验还运用 通路活化剂处理 结肠癌细胞 发现 活化剂能逆转姜黄素对 信号通路以及 " 的影响 因此 基于以上实验表明姜黄素通过先抑制 信号通路 从而抑制肿瘤细胞上皮间质转化 起到抗肿瘤细胞侵袭转移的作用 本研究为姜黄素抑制结肠癌侵袭转移机制提供了新的思路 也为姜黄素作为潜在的结肠癌治疗手段提供了实验基础 参考文献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朱智杰 阮君山 李尧 等 - 信号通路诱导肿瘤细胞上皮间质转化的研究进展 1- 中国药理学通报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赵佳晖 姜永光 罗勇 - 信号通路在肿瘤 " 现象中的作用研究进展 1- 国际泌尿系统杂志 //<<:;/- / =$%' (,,# (,, @,- *$%'#6 ' # 8$%%.4#6 5 %, 4%4' A% 8. > $,%, % 1, % (. //:;<//- =$.$# =$4%# %>, ))- (, 5 4% 4' % $%86 1-4%% *%7, %// :;/0- $ C?1 +!,- 4%4' $ 7. 8%, 5% ' % 5 = 76.% %.., 7 >., 8$>6 # #$%. 34 "2(1-, ).6./0:;<0<<- @ ' 1*% =?*% 1,- 4%4'.488%... ' % # 8%, 5% 5 8) $8% ',,. $%4$ $ 7 5 $., 8$>6 1-, # (8/<:;<<- > *)$6 *) *,-!4, E# 4% 4',.. 8 '#4,%. 5 $ 7., 8$>61- "4% 1 # $'/ </-