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1 第 卷第 期 年 月 西安交通大学学报 医学版!"#$## %&'&!& 中医药研究 盐酸青藤碱诱导人肝癌细胞凋亡及其对 及 水平的影响 曹瑞琪 卢新兰 任牡丹 张 俊 卢桂芳 张 丹 赵 艳 闫红林 和水祥 西安医学院第一附属医院消化内科 陕西西安 西安交通大学第一附属医院消化内科 陕西西安 # 摘要 目的 观察盐酸青藤碱对人肝癌细胞 $%%&' 凋亡的影响 及其 ' ' 及 &() 水平的变化 探讨防治肝癌作用的可能机制 方法 体外培养人肝癌细胞 $%%&' 经不同浓度盐酸青藤碱作用后 采用 % 法检测细胞增殖 * "+,'&) 双标结合流式细胞术检测细胞的凋亡 $* 法检测培养液中 ' ' 的水平 -"."/ 01 技术检测盐酸青藤碱作用于人肝癌细胞后 &() 的表达水平 结果 盐酸青藤碱对人肝癌细胞的生长有明显的抑制作用 并呈剂量 时间依赖性 不同浓度组之间差异均有统计学意义 不同浓度 和 10 的盐酸青藤碱处理肝癌细胞 后 各组中凋亡细胞率分别为 # 实验组与对照组之间差异有统计学意义 同时发现 与阴性对照组比较 盐酸青藤碱作用组 $%%&' 细胞上清液中 ' ' 水平均明显下降 而 &() 的表达水平显著增加 结论 盐酸青藤碱可抑制人肝癌细胞 $%%&' 的细胞增殖 促进其凋亡 此作用可能与其抑制转录因子 &() 炎症因子如 '' 的表达 进而通过破坏肿瘤微环境作用有关 关键词 肝细胞肝癌 ' '&() 盐酸青藤碱 凋亡中图分类号 2 文献标志码 * #!!"#$%&"'%$!$&!"!"!&!''%&%& (())* &!'$!!&!+%!'!,!' $ &*3 2!+' '07 2 %!'7 89*:;! 5 :!+'7 89*: 7 89*3 7 * 91 '0+ 9$!+'+7 "7/"1:7./1""/10"+/.*+0+7" %"+70&10"" 6+7 "7/"1:7./1""/10"+/.*+0+7" ; "/.+6+7 #&+7 -.-()'*" +,-."# "#" /0 "#"###/$!!+)## / "#")/## "/#/&! 1""/ #/ "#"1###/$!!+##"& #"/ #$!!+ # ##"#" / "#"1 " 1 #/ %)*+.&,($ /" 1" "/()"'*)$!!+#1#"1/ "#"//(#/ "#"+,-.1"#" & $/"#""1/###/$!!+# 收稿日期 #)) 修回日期 #)) 基金项目 国家自然科学基金面上项目 '& 陕西省教育厅专项科研计划项目 '&# 陕西省社会发展科技攻关项目 '& $* $".#''$##*"+'&$#2#.#,"# 3/$.# '&#" $# 3/$##" ## 2#.#$.#'&$* 通讯作者 卢新兰 &,)/1#"#&#/ 任牡丹 &,)/&#/ 优先出版 111&#4&4#/"#&&2&&&&/))!"!

2 期 曹瑞琪 卢新兰 任牡丹 等 盐酸青藤碱诱导人肝癌细胞凋亡及其对 ' 及 &() 水平的影响 ##)"/)"" /"/"! &&/ 1 / "#""##&"//(#1 &&&#&&&"&&51#"#1/ "# &&#'*)"()1"#"/ ###/ $!!+ #&$/ "#" #" # # +,-. && $/ "#"" 1 /###/$!!+##"#&/ ""# ()'*" +,-.""/ /#/"# "#" "/ "#"##/$!!+#& /0 1. ###/ ()'*)+,-./ "#" 肝癌是一种炎症相关性疾病 在肿瘤微环境中存在着肿瘤细胞的自分泌和旁分泌途径 ' ' 作为重要的炎性细胞因子也可由肿瘤细胞自身分泌 作用于肿瘤细胞本身激活多条信号通路 包括 )<;*<$*%*)< 通路 调控肿瘤发生 生长 侵袭转移 肿瘤宿主反应等过程 青藤碱.+1"+"$ 是从中药青风藤中提取的单体生物碱 具有明显抗炎 抗免疫 镇痛 镇静 镇咳 降血压 促组胺释放 抗心律失常等药理作用 盐酸青藤碱是青藤碱的水溶性盐酸盐 目前研究发现 其在几种肿瘤细胞中显示出体外抗肿瘤的药理活性 包括白血病 滑膜肉瘤 前列腺癌 肺癌 宫颈癌和肝细胞癌 肿瘤微环境是指由肿瘤细胞 间质细胞 免疫细胞 炎性因子 趋化因子等构成的局部微环境 在肿瘤的发 生发展过程中具有重要的作用 为此 我们观察了盐酸青藤碱在诱导人肝癌细胞凋亡过程中炎症因子 ' 及转录因子 &() 表达的变化 探讨其防治肝癌的可能作用机制 材料与方法 实验材料与试剂 人肝癌细胞株 $%%&' 由西安交通大学第一附属医院临床分子实验中心陈威主任惠赠 盐酸青藤碱购自中国湖南正清药业公司 溶解于 %% 新鲜培养液中 含 胎牛血清 终浓度为 10= 冷藏备用 %% 培养基购自 :(&3 公司 胎牛血清为中国浙江杭州四季青公司产品 胰蛋白酶及 %$3 均购自 $+7 公司 兔抗人 &() 多抗购自 $77&/!> 公司 鼠抗人 '7+ 单抗 山羊抗兔 &() 二抗 山羊抗鼠 '7+ 二抗购自 *7 公司 * 细胞培养 人肝癌 $%%& 细胞的培养 人肝癌 $%%& 细胞在含 胎牛血清! 青霉素和 链霉素的 %% 培养液中 = 恒温 &3 密闭传代培养 ( 比色法检测细胞增殖 取对数生长期细胞 胰蛋白酶消化 用含 胎牛血清的 %% 制备细胞悬液? 个 接种于 # 孔板 每孔 生长 后 随机分 组 每组 复孔 在前期工作基础上 并结合预实验结果 加入盐酸青藤碱 使之终浓度分别为 10 阴性对照组 10 的培养液 分别作用 后 每孔加新配置的 的 % 贮存液 继续孵育 后 弃上清 每孔加 %$3 溶解细胞内结晶 酶标 波长测定吸光度 * 值 对照孔 * A 实验孔 * 对照孔 *? 流式细胞术检测细胞凋亡 收集经浓度为 10 盐酸青藤碱处理 后的细胞 用 胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液 /+ 离心 + 弃上清 用预冷的 )($ 重新悬浮细胞 并用血细胞计数板计数细胞 取? 细胞悬液 = 下 /+ 离心 + 后弃上清 加入 的? 结合缓冲液 再依次加入 的 * "+,'& 和 的 ) 轻轻吹打混匀制成单细胞悬液 需将正常对照组即 10 盐酸青藤碱处理的细胞分成 份 其中一份不加 * "+,'& 和 ) 进行染色 用于流式细胞术中的空白对照测定细胞基线 其中一份只加 * "+,'& 最后一份只加 ) 进行染色 室温下避光孵育 + 在 内使用流式细胞仪检测 分析凋亡细胞百分比 - 法检测 水平 取对数生长期 $%%&' 细胞 用胰酶消化收集 调整单细胞悬液密度为 # 个 按 孔? # 个细胞 接种于 # 孔细胞培养板 =&3 孵育 换含 血清的 %% 培养基加入各剂量组受试药 =&3 孵育 分别收取 上清 继续培养 再收集上清 采用 $* 法检测 酶标仪 + 内在 处读吸光度值!"!

3 西安交通大学学报 医学版 第 卷 1!!%'2 法检测 蛋白的表达 给药 后 )($ 洗 遍 加入 具有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的蛋白提取液 冰上裂解 + 用细胞刮刮下培养皿中细胞斜放于冰上裂解 + 刮取细胞后加到 离心管中 = /+ 离心 + 收集上清液 用 (&* 法测定蛋白浓度 取 蛋白进行 $$')*: 聚丙烯酰胺凝胶电泳, 电泳完毕后 剥离下完整胶 用半干转膜仪 * 电转 + 将蛋白转移到 ), 膜上 根据目的蛋白分子量的大小裁剪适当大小的条带膜 将膜用封闭液封闭 取出膜 加入适当体积的一抗稀释液 用 )($ 溶液以适当比例稀释 其中 7+'&() 单抗 B7+''7+ 单抗 B 杂交过夜 后用 )($ 洗膜 次 每次 + 然后加入适当体积的 合适种属的二抗稀释液 后取出膜 )($ 洗 次 每次 + 加入显色剂闭光显色 显色后凝胶成像系统照相并用密度分析软件对蛋白进行定量 ) 统计学处理 所有实验数据均用 表示 经 $)$$ 统计软件进行处理 多组间比较采用单因素方差分析 两两比较采用 $<' 检验 以 为差异有统计学意义 ** 盐酸青藤碱对 (())* 细胞凋亡的影响 &% 定量显示 10 盐酸青藤碱作用后 凋亡率分别为 # # 与对照组 比较 各处理组间差异具有统计学意义 均 即随浓度的增加 凋亡率逐渐升高 图 * 结 果 * 盐酸青藤碱对细胞生长的影响 盐酸青藤碱对肝癌细胞的增殖有明显的抑制作用 与阴性对照组 10 组 相比 10 组的盐酸青藤碱均可抑制人肝癌细胞 $%%&' 细胞的生长 且该抑制作用具有典型的浓度 ' 时间依赖性关系 其中以 10$ 作用 的抑制率最高 可达 图 图 * 盐酸青藤碱对 (())* 细胞凋亡的影响 + *11.+. "" 1.+1"+" /101/+" 1 $%%&"0. *(())* 细胞培养液中 的分泌水平的变化 '' 蛋白在阴性对照组中就有表达 经盐酸青藤碱作用后 '' 的蛋白表达与阴性对照组相比明显减少 或 图 盐酸青藤碱对人肝癌 (())* 细胞的生长增殖的抑制作用 +:/1'+++1/""1.+1"+"/101/+" 1 $%%&"0. 盐酸青藤碱呈剂量依赖性抑制 '' 的蛋白表达 表 * 盐酸青藤碱对 (())* 细胞中 的蛋白表达的影响 &() 蛋白在阴性对照组中就有表达 经盐酸青藤碱作用后 &() 的蛋白表达与阴性对照组相比明显下降 盐酸青藤碱呈剂量依赖性下调 &() 的蛋白表达 图!"!

4 期 曹瑞琪 卢新兰 任牡丹 等 盐酸青藤碱诱导人肝癌细胞凋亡及其对 ' 及 &() 水平的影响 表 盐酸青藤碱对 (())* 细胞作用 3" 生成的影响 7".1.+1"+"/101/+"1 "/1!+1 1'7'+ $%%&'"0. 组别 ' ' 阴性对照组 A ## 盐酸青藤碱组 10 ## 功效的传统中药青风藤中分离得到的生物碱单体 具有抗炎 抗免疫和抗风湿的药理活性 盐酸青藤碱.+1"+"/101/+" 是青藤碱的水溶性盐酸盐 临床用于治疗类风湿关节炎 疗效肯定 无明显毒副作用 研究发现 青藤碱不仅有抗炎等活性 还具有抗肿瘤活性 这些研究报道了青藤碱能在体外抑 # 制滑膜肉瘤 肺癌 宫颈癌 白血病 前列腺癌等肿瘤细胞的生长 在肝癌中 国内有研究初步报道了青藤碱在体外诱导人肝细胞癌 9": 细胞凋亡 的作用 本实验结果与上述报道结果相似 进一步证实了 $ 对人肝癌细胞 $%%&' 具有增殖抑制及凋亡诱导作用 肿瘤微环境是一个复杂的小生态环境 从细胞的恶性转变到肿瘤的生长 血管生成 免疫逃避以及侵袭转移这一系列过程中均影响肿瘤的进展 炎症微环境中的促炎因子和生长因子能活化 27. 信号通路 活化的 27. 蛋白激活 %*)< 激酶 如 )2< 进而激活转录因子 &() '($* 结合于 &36' 和 +3$ 基因启动子区 促使其基因表达 进而促使肿瘤发生 炎性细胞因子 ' ' 作为肿瘤微环境的构成组分可由免疫细胞分泌 也可由肿瘤细胞自身 图 不同浓度 作用后 蛋白表达的变化 +$+1"+"/101/+"'+!"7"1&() /1"+ "/" $%%&"0. 讨 论肝癌是一种十分常见的恶性消化道肿瘤 其病死率高 危害性大 已经位居世界肿瘤性疾病的第 位 且有逐年升高的趋势 中国是肝癌的高发区 其发病人数约占全世界总发病数的一半 而其死亡率也位居 世界之首 目前 治疗肝癌的首选方法是进行手术切除 但是 肝癌术后复发率相当高 年后复发率高达 左右 预后极差 严重影响肝癌患者的预后 因此 寻找和开发高效低毒的抗肝癌药物具有十分重要的意义 细胞增殖与凋亡是细胞的基本生物学现象 细胞凋亡是一种由基因控制的细胞主动死亡过程 在多细胞生物去除不需要的或异常的细胞中起着必要的作用 凋亡不仅在生物个体的生长发育 组织稳态 器官形成及衰老等生理过程中发挥重要作用 也参与多种疾病的发生与发展 如病原微生物感染 化学物质引起的组织损伤 肿瘤的发生发展等 青藤碱.+1"+" 是从有 祛风湿 通经络 分泌到肿瘤微环境中 通过自 旁分泌的途径作用于肿瘤细胞 而有报道发现细胞因子 ' 也参与肿 瘤发生 侵袭转移 肿瘤宿主反应等过程 研究表明干扰肝癌细胞 ' 表达能减轻小鼠移植瘤的肿 瘤负荷 与增强 < 细胞对肿瘤细胞的杀伤有关 因此 '' 作为肝癌重要的促进因素存在于肝癌微环境中 为此 我们进一步研究了盐酸青藤碱作用人肝癌细胞 $%%&' 凋亡过程中 ' ' 表达的变化 结果显示随着盐酸青藤碱剂量的增加 '' 的表达水平有减少的趋势 各组的表达均低于对照组 其中 10 盐酸青藤碱作用组与对照组比较差异有统计学意义 或 即盐酸青藤碱能够浓度依赖性的下调 '' 表达水平 提示盐酸青藤碱具有破坏肿瘤微环境的作用 &(). 主要包括 &()'& () 和 &()' 等 # 种蛋白 近年研究表明 & () 与骨 脂肪代谢 炎症反应 病毒感染等多种病理生理过程有关 并与 &36' 共同在感染 肝纤维化 及肿瘤发生中起重要作用 我们课题组前期研究发现 在人肝癌组织和 诱导的大鼠肝癌组织中 &() 较正常肝组织明显表达升高 而柴胡皂甙 可以通过抑制 &() 与 &36' 蛋白的表达!"!

5 西安交通大学学报 医学版 第 卷 ' 化学预防实验大鼠肝癌的形成 本实验证明盐酸青藤碱可以浓度依赖性降低人肝癌细胞 $%%&' 中 &() 蛋白的表达水平 结合盐酸青藤碱可以抑制人肝癌细胞中 &36' 蛋白表达的文献报道 我们推测盐酸青藤碱可能通过抑制 27. 信号通路 包括其下游转录因子 &() 进而抑制下游靶分子如 &36' 来调控炎症因子如 '' 的表达 进而通过破坏肿瘤微环境来诱导肝癌细胞凋亡 在肝癌细胞中 越来越多的研究认为 )< ;*<$*)%*)< 通路及 '( 可作为联系炎症与肿瘤的枢纽 在炎症介导肿瘤发生发展过程中具有重要作用 其下游基因包括 ' 等炎症因子 因此 在肝癌细胞中 $ 是否通过激活 )<;*< $*)%*)< 通路及 '( 来促进 ' 等炎症因子表达需要进一步研究 参考文献 60'$6' +0' 0702 '&4)# "#4 //" ##&7+#)& (,6'237++'336 $+,2%,((6!& //#/###/ 1 &6##)& 622,(-2*$,7,(2(&7##) #&+ +#+#)& (,.0 &,#/ ())#"/#/ &($####)#& '7806(80'7 &,#/ "/### '+)0#&!!"2 )#& # 秦峰 蔡辉 & 青藤碱与卡铂对宫颈癌 0 细胞增殖的协同抑制研究 & 现代中药研究与实践 #)#& 史海龙 崔亚亚 & 青藤碱对人肝癌细胞 07 增殖的抑制作用 & 中医临床研究 )& 张玉宇 王利波 赵钦 等 & 肿瘤微环境与肿瘤细胞放射敏感性关系的研究进展 & 吉林大学学报 医学版 #) & 刘艳艳 梁淑娟 王焕芹 等 & 肝癌细胞特异性 () 反义 2' 对小鼠移植肝癌的抑制 & 中国肿瘤生物治疗杂志 # )& 成军 & 转录因子 +,-. 的生物学功能 & 世界华人消化杂志 #)##& 梁熹 胡雅楠 和水祥 等 &+6) 与 +,-. 在人肝细胞肝癌中的表达及其临床意义 & 世界华人消化杂志 )& ( (0,$2,'!3&+/# 4)" "/)"#" ##) /++#" "##)&!!"2 #)#& 编辑 韩维栋 西安交通大学学报 医学版 品牌栏目推介 一 专家述评 专题研究 栏目本刊的 专家述评 栏目主要刊登国内外知名学者系统性 前瞻性的研究述评文章以及研究团队的系列研究成果 开设至今 已相继刊发了 # 多位专家的述评文章及 余个研究团队的专题报道 在学科内树立了良好的口碑 二 中医药研究栏目中医药是我国的国粹 本刊的 中医药研究 栏目主要报道中医药基础及临床研究的最新成果 结合中医药研究在国内外的影响情况 今后将逐步加强中医医理及中医实践内容 本栏目在 家西医院校学报中独具特色!"!

7 北京大学学报 医学版 # +94* 4 ' % 论著!! "# $ #% %"&!%'!! $ "( )& * $ +,-.)/ ) 01 " * ). " 2")3 )01 ( /" 433% /1 " 0 "51 " -.)/$ 6',)") 4.))%) 0

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