免疫学2019第2期

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宠舒穆禄
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1 132 论著 [ 文章编号 ] (2019) ;[DOI] /j.cnki.immunol.j 姜黄素联合 5- 氟尿嘧啶下调 YAP 表达诱导人结肠癌细胞自噬朱敬, 吴佳莹, 黄映辉 * [ 摘要 ] 目的研究姜黄素与 5-FU 联用对人结肠癌细胞自噬及对 YAP 的影响方法姜黄素 5-FU 单独应用及两者联用作用于人结肠癌 HCT116 细胞和过表达 YAP 的结肠癌稳定 HCT116 细胞系 24 h,mtt 法检测细胞增殖情况,Western blot 检测自噬标志物 LC3-Ⅱ 的变化, 并检测癌基因 YAP 表达变化结果 MTT 法检测结果显示,2 种药物联合应用后, 肿瘤细胞的增殖抑制率明显高于单用药组 (P<0.01) 姜黄素组 5-FU 组和药物联用组 HCT116 细胞的 YAP 蛋白表达水平下降,LC3-Ⅱ 蛋白的表达水平增高结论姜黄素和 5-FU 联用会下调 YAP 的表达, 并诱导结肠癌细胞自噬的表达,YAP 或许能成为结肠癌治疗的一个新的靶点 [ 关键词 ] 姜黄素 ;5-FU; 结肠癌 ; 自噬 ;YAP [ 中图分类号 ] R735.3 [ 文献标识码 ] A Curcumin and 5-FU induce autophagy of human colon cancer cells via inhibiting yes-associated protein expression ZHU Jing 1, WU Jiaying 2, HUANG Yinghui 1, * 1. College of Life Science and Bioengineering, Beijing University of Technology, Beijing100124, China; 2. Institute of Basic Medical Sciences, Hubei University of Medicine, Shiyan , China *Corresponding Author: HUANG Yinghui, yhuang@bjut.edu.cn [Abstract] This study was designed to analyze the effects of curcumin and 5-FU on the autophagy and YAP of colon cancer cells. The inhibitory effects of curcumin and / or 5-FU on colon cancer cell line HCT116 were investigated using MTT methods; the changes of LC3-Ⅱ and YAP expression after the treatment was also evaluated by Western blotting. Data showed that proliferation of HCT116 cells was significantly inhibited by curcumin and 5- FU in combination. In addition, the expression level of YAP protein was reduced after the use of the two agents in combination, and the level expression of LC3-Ⅱ protein was increased after the same treatment. Our results suggest that curcumin and 5-FU in combination can down-regulate YAP expression, which may has great promise for treatment of colon cancer and might be a potential diagnostic marker for colon cancer. [Key words] Curcumin; 5-FU; Colon cancer cells; Autophagy; YAP 癌症是人类致死的第二大原因结肠癌是最常见的癌症之一, 其在男性和女性肿瘤发生率中分别位于第三和第二名, 同时在青少年中的发病率也呈 [1] 逐年上升的趋势目前, 结肠癌的治疗主要是手术切除, 辅助化疗和放射治疗但是对病人进行放基金项目 : 国家自然科学基金 ( ); 北京市科技攻关计划 (Z ) 作者单位 :100022, 北京工业大学生命科学与生物工程学院 ( 朱敬, 黄映辉 ); 十堰, 湖北医药学院基础医学院 ( 吴佳莹 ) * 通信作者 : 黄映辉, yhuang@bjut.edu.cn [2] 射治疗和化疗对于结肠癌有明显的副作用, 严重影响患者的生活质量, 因此, 寻找副作用少的有效药物是当务之急的工作研究发现 Hippo 信号通路在维持器官大小和促 [3] 进肿瘤发展中起着重要的作用 YAP 是 Hippo 信号 [4] 通路的关键下游效应子, 由 Sudol 等首次发现, 并提示它的高表达水平和异常活跃可能具有致癌的潜能 YAP 能促进细胞增殖和抑制细胞凋亡, 导致细胞失去接触抑制并促进恶性细胞的转化姜黄素是一种天然的酚类抗氧化剂, 有很多药理作用, 如抗氧

133 化剂, 抗炎, 抗肿瘤, 抗老年痴呆症性质, 并用于风湿 [5] 病和其他疾病的治疗美国国家癌症研究所已将姜黄素列为第三代抗癌药物 5- 氟尿嘧啶 (fluorouracil, 5-FU) 是常见的抗嘧啶类药物, 目前在肿瘤临床上的应用非常广泛自噬是一种细胞的自我修复和自我更新的生物学过程, 会引起细胞死亡, 是不同于凋亡的一种细胞程序性死亡形式自噬在抗肿瘤代谢平衡

2 133 化剂, 抗炎, 抗肿瘤, 抗老年痴呆症性质, 并用于风湿 [5] 病和其他疾病的治疗美国国家癌症研究所已将姜黄素列为第三代抗癌药物 5- 氟尿嘧啶 (fluorouracil, 5-FU) 是常见的抗嘧啶类药物, 目前在肿瘤临床上的应用非常广泛自噬是一种细胞的自我修复和自我更新的生物学过程, 会引起细胞死亡, 是不同于凋亡的一种细胞程序性死亡形式自噬在抗肿瘤代谢平衡抵抗微生物等方面发挥其作用本文旨在研究姜黄素与 5-FU 联用对结肠癌细胞中 YAP 基因以及自噬的影响 1 材料与方法 1.1 实验材料人结肠癌 HCT116 细胞购于美国 ATCC; 胎牛血清 McCoy 5A 培养液 Puromycino 为上海联硕宝为生物科技有限公司产品 ; 姜黄素购自美国 Sigma 公司 ; 鼠抗人 GAPDH 抗体 LC3 抗体 YAP 抗体, 美国 CST 1.2 细胞培养在含有 10% 胎牛血清的 McCoy 5A 培养基中培养 HCT116 细胞, 将细胞在 37 恒温含有 5% CO 2 的培养箱中进行孵育 1.3 细胞增殖实验 (MTT 法 ) 细胞培养在 96 孔板中, 将细胞数调整至个 / 孔设置空白对照组 5-FU 组 (10 μg/ml) 姜黄素组 (10 μmol/l) 姜黄素 (10 μmol/l) 联合 5-FU 组 (10 μg/ml), 每组 5 个复孔, 每孔体积为 150 μl, 在 5%CO 2,37 培养箱中孵育 24 h 时吸去原培养液, 在每孔中加入 200 μl MTT 溶液,2 h 后终止培养吸去 MTT 溶液, 每孔加入 150 μl DMSO 用酶标仪在 490 nm 处测定每孔的吸光光度值, 实验重复 3 次 1.4 稳定细胞系的建立分别用慢病毒包装的 YAP 表达载体和对照载体 (GenePharma, 上海 ) 建立过表达细胞系和对照细胞系的 YAP 目标细胞在 48 h 内感染慢病毒, 用 puromycin 筛选 3 周 1.5 Western blot 检测取对数生长期的 HCT116 细胞和过表达 YAP 的 HCT116 细胞系, 分别分成空白对照组 5-FU 组 (10 μg/ml) 姜黄素组 (10 μmol/l) 姜黄素 (10 μmol/l) 联合 5-FU 组 (10 μg/ml) 这 4 组细胞在 37,5% CO 2 培养箱中培养 24 h 后, 用 RIPA 裂解液 (50 mmol/l Tris,pH 8.0,150 mmol/l NaCl,0.5% deoxycholate,0.1% SDS,1 mmol/l sodium vanadate, 1 mmol/l PMSF) 提取可溶性蛋白每个电泳泳道加入不同蛋白样品 25 μg, 经 10% 聚丙烯酰胺凝胶 SDS- PAGE 电泳电泳后, 将蛋白转移至 PVDF 膜上, 用 5% 脱脂牛奶的 TBST 封闭 1 h, 加入不同的一抗 4 孵育过夜,TBST 洗涤 3 次 ; 二抗孵育 1.5 h 最后在膜上加上超敏化学发光剂, 通过凝胶成像系统成像 1.6 统计学分析所有统计数据采用 SPSS 19.0 软件进行分析 P<0.05 为差异有统计学意义所有实验重复 3 次 2 结果 2.1 姜黄素与 5-FU 对结肠癌 HCT116 细胞增殖的影响先筛查出各药物 24 h 的 IC 50 值作为联合用药浓度,5-FU 姜黄素的 IC 50 值分别为 12 μg/ml 10 μmol/l MTT 检测结果显示, 与对照组相比, 各用药组均能抑制结肠癌 HCT116 细胞的增殖 (P<0.01, 图 1), 其中姜黄素联合 5-FU 组的细胞抑制率最高, 与其他 2 个用药组相比, 差异有统计学意义 (P<0.01), 姜黄素能促进 5-FU 对细胞的增殖抑制作用图 1 姜黄素 5-FU 姜黄素与 5-FU 联用对 HCT116 细胞的生长抑制作用 Fig 1 Inhibitory effects of curcumin and/or 5-FU on HCT116 cell proliferation 2.2 姜黄素与 5-FU 对结肠癌 HCT116 细胞自噬的影响不同药物作用于人结肠癌 HCT116 细胞 24 h 后, 用 Western blot 检测蛋白表达与对照组相比, 各用药组的 LC3-Ⅱ 表达量显著升高 (P<0.01, 图 2), 其中姜黄素联合 5-FU 组的细胞的 LC3-Ⅱ 表达量最高, 与其他 2 个用药组相比, 差异有统计学意义 (P< 0.01), 姜黄素能促进 5-FU 对细胞自噬的诱导

01, 图 3), 其中姜黄素联合 5-FU 组的细胞的 YAP 表达量下降最为明显 (P<0.

3 134 a 增殖抑制作用图 2 Western blot 检测 LC3-II 蛋白表达量的变化 Fig 2 The expression of LC3-II detected by Western blotting 2.3 姜黄素与 5-FU 对结肠癌 HCT116 细胞 YAP 表达的影响 Yes 相关蛋白 (YAP) 是 Hippo 信号通路的重要的核心转录共激活因子和癌基因, 与人类肿瘤的发生密切相关 Western blot 法检测结果显示, 各用药组作用于结肠癌 HCT116 细胞 24 h 后, 与对照组相比, 各用药组细胞 YAP 表达显著下降 (P<0.01, 图 3), 其中姜黄素联合 5-FU 组的细胞的 YAP 表达量下降最为明显 (P<0.01) a 图 4 姜黄素 5-FU 姜黄素与 5-FU 联用对过表达 YAP 的 HCT116 细胞的生长抑制作用 Fig 4 Inhibitory effects of curcumin and/or 5-FU on the growth of HCT116 cells overexpressing YAP 2.5 姜黄素对与 5-FU 对过表达 YAP 的结肠癌 HCT116 细胞自噬的影响 Western blot 法检测结果显示, 药物作用于过表达 YAP 的结肠癌 HCT116 细胞 24h 后, 与对照组相比, 各用药组的 LC3-Ⅱ 表达量显著升高 (P<0.01, 图 5), 其中姜黄素联合 5-FU 组的细胞的 LC3-Ⅱ 表达量最高, 与其他 2 个用药组相比, 差异有统计学意义 (P<0.01), 姜黄素能促进 5-FU 对细胞自噬的诱导图 3 Western blot 检测 YAP 蛋白表达量的变化 Fig 3 The expression of YAP detected by Western blotting 2.4 姜黄素与 5-FU 对过表达 YAP 的结肠癌 HCT116 细胞增殖的影响 MTT 检测结果显示, 与对照组相比, 各用药组均能抑制过表达 YAP 的结肠癌 HCT116 细胞的增殖 (P<0.01, 图 4), 其中姜黄素联合 5-FU 组的细胞抑制率最高, 与其他 2 个用药组相比, 差异有统计学意义 (P<0.01), 姜黄素能促进 5-FU 对细胞的 *P<0.01, vs Control; #P<0.01, vs GFP-Control. 图 5 Western blot 检测对照组和过表达 YAP 的细胞系中联用 5-FU 和姜黄素后 LC3-II 蛋白表达量的变化 Fig 5 Western blotting for the expression of LC3-II in HCT116 cells overexpressing YAP 2.6 姜黄素与 5-FU 对过表达 YAP 的结肠癌 HCT116 细胞 YAP 表达的影响 Western blot 法检测结果显

4 135 示, 药物作用于过表达 YAP 的结肠癌 HCT116 细胞 24 h 后, 与对照组相比, 各用药组细胞 YAP 表达显著下降 (P<0.01, 图 6), 其中姜黄素联合 5-FU 组的细胞的 YAP 表达量下降最为明显 (P<0.01) *P<0.01, vs Control; #P<0.01, vs GFP-Control. 图 6 Western blot 检测对照组和过表达 YAP 的细胞系中联用 5-FU 和姜黄素后 YAP 蛋白表达量的变化 Fig 6 Western blotting for the expression of YAP in HCT116 cells overexpressing YAP 3 讨论继坏死和凋亡后, 人们又发现了第 3 种细胞的死亡形式 : 自噬自噬是一种保守的细胞防御机制和 [6] 程序性细胞死亡, 是细胞质组分在应激条件下的溶酶体降解过程当细胞受到损伤衰老以及失去相应功能时, 细胞就会发生自噬, 降解这些细胞, 为其他细胞提供能量在自噬发生的过程中,LC3-Ⅱ [7] 在自噬体的形成中起着非常重要的作用我们目前的研究表明, 姜黄素和 5-FU 联用可以改变 LC3-Ⅱ 的表达来激活自噬, 我们还发现, 姜黄素和 5-FU 联用处理的 HCT116 细胞可以通过上调 YAP 逆转自噬 1995 年, 当果蝇 WTS 突变引起果蝇眼睛和翅膀 [8] 的过度生长表型时, 描述了 Hippo 信号通路 YAP 是 Hippo 信号通路在哺乳动物和敲除小鼠中的主要下游效应物 YAP 还可以抑制 mst1/2 或其他上游信 [9] 号缺失导致的过度增殖 YAP 活性的降低与自噬 [10] 和细胞的分化有关在某些实体肿瘤细胞中, 核 [11] 内 YAP 的激活是肿瘤发生的必要条件因此, YAP 已成为癌症治疗的新靶点据报道, 姜黄素能抑制多种肿瘤细胞的生长, 并能有效预防由于化学因素和放射诱导产生的胃 [12] [13] [14] [15] 癌结直肠癌胰腺癌膀胱癌细胞等肿瘤形成近年来, 人们对姜黄素的抗凋亡作用研究比较广泛但姜黄素能否引起肿瘤细胞的自噬也是研究人员很感兴趣的课题研究表明姜黄素能诱导 [16] [17] K562 细胞和脑胶质瘤细胞的自噬姜黄素通过 [14] 下调胰腺癌细胞中的 YAP 并抑制细胞生长也有 [18] 研究证明姜黄素可以与 TfR 联用抑制胶质瘤增殖值得注意的是, 与其他细胞毒性药物相比, 姜黄素毒性最小, 在人体临床试验中是安全的因此, 姜黄素与 5-FU 联用可以抑制 YAP 并激活自噬, 为结肠癌患者的治疗提供了一种很有前途的治疗策略此外, 还需要进一步研究确定姜黄素与 5-FU 联用通过抑制 YAP 和激活结肠癌细胞自噬信号通路发挥抗癌作用的具体机制本文中, 我们要研究在结肠癌细胞中 YAP 是否为姜黄素和 5-FU 联用的靶点即姜黄素和 5-FU 联用是否影响 YAP 的表达我们发现姜黄素和 5-FU 联用会抑制结肠癌细胞增殖并诱导细胞自噬并且在姜黄素和 5-FU 联用后,YAP 蛋白的表达是降低的此外, 我们发现, 当 YAP 被过度表达时, 细胞的自噬被抑制, 但当姜黄素与 5-FU 联用降低 YAP 表达的同时, 自噬又被激活我们的研究表明在结肠癌的治疗中, 姜黄素和 5-FU 联用可能因为它们抑制 YAP 表达和诱导自噬而成为一种潜在并有效的治疗方法并且认为 YAP 可能是治疗结肠癌病的一种潜在的抗癌方法, 可能是结肠癌的一种潜在的诊断标志物参考文献 [1] Torre LA, Siegel RL, Ward EM, et al. Global Cancer Incidence and Mortality Ratesand Trends-An Update. Cancer epidemiology, biomarkers & prevention: a publication of the American Association for Cancer Research, cosponsored by the American Society of Preventive[J]. Oncology, 2016, 25(1): [2] Carvalho C, Glynne Jones R. Challenges behind proving efficacy of adjuvant chemotherapy after preoperative chemoradiation for rectal cancer[j]. Oncology, 2017, 18(6):

5 [3] Wang SP, Wang LH. Disease implication of hyper-hippo signalling[j]. Open Biol, 2016, 6(10): [4] Sudol M. Yes-associated protein (YAP65) is a proline-rich phosphoprotein that binds to the SH3 domain of the Yes proto-oncogene product[j]. Oncogene, 1994, 9(8): [5] Hewlings SJ, Kalman DS. Curcumin: a review of its' effects on human health[j]. Foods, 2017, 6(10): 92. [6] Petherick KJ, Williams AC, Lane JD, et al. Autolysosomal beta-catenin degradation regulates Wnt-autophagy-p62 crosstalk[j]. EMBO J, 2013, 32(13): [7] Justice RW, Zilian O, Woods DF, et al. The Drosophila tumor suppressor gene warts encodes a homolog of human myotonic dystrophy kinase and is required for the control of cell shape and proliferation[j]. Genes Dev, 1995, 9(5): [8] Xu T, Wang W, Zhang S, et al. Identifying tumor suppressors in genetic mosaics: the Drosophila lats gene encodes a putative protein kinase[j]. Development, 1995, 121(4): [9] Zhou D, Zhang Y, Wu H, et al. Mst1 and Mst2 protein kinases restrain intestinal stem cell proliferation and colonic tumorigenesis by inhibition of Yes-associated protein (YAP) overabundance[j]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2011, 108(49): [10] Liu Z, Zeng W, Wang S, et al. A potential role for the Hippo pathway protein, YAP, in controlling proliferation, cell cycle progression, and autophagy in BCPAP and KI thyroid papillary carcinoma cells[j]. Am J Transl Res, 2017, 9(7): [11] Moroishi T, Hansen CG, Guan KL. The emerging roles of YAP and TAZ in cancer[j]. Nat Rev Cancer, 2015, 15(2): [12] Huang F, Yao Y, Wu J, et al. Curcumin inhibits gastric cancer-derived mesenchymal stem cells mediated angiogenesis by regulating NF-kappaB/VEGF signaling[j]. Am J Transl Res, 2017, 9(12): [13] Jalili Nik M, Soltani A, Moussavi S, et al. Current status and future prospective of curcumin as a potential therapeutic agent in the treatment of colorectal cancer[j]. J Cell Physiol, 2018, 233(9): [14] Zhou X, Su J, Feng S, et al. Antitumor activity of curcumin is involved in down-regulation of YAP/ TAZ expression in pancreatic cancer cells[j]. Oncotarget, 2016, 7(48): [15] Gao Y, Shi Q, Xu S, et al. Curcumin promotes KLF5 proteasome degradation through downregulating YAP/ TAZ in bladder cancer cells[j]. Int J Mol Sci, 2014, 15(9): [16] Jia YL, Li J, Qin ZH, et al. Autophagic and apoptotic mechanisms of curcumin-induced death in K562 cells[j]. J Asian Nat Prod Res, 2009, 11(11): [17] Zhuang W, Long L, Zheng B, et al. Curcumin promotes differentiation of glioma-initiating cells by inducing autophagy[j]. Cancer Sci, 2012, 103(4): [18] 文雪. 姜黄素联合抗 TfR 抗体体外抗胶质瘤效应研究 [J]. 免疫学杂志, 2016, 32(4): ( 收稿日期 : ; 修回日期 : ) ( 编辑李海鸥 )

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环球中医药 2016 年 5 月第 9 卷第 5 期摇 Global Traditional Chinese Medicine, May 2016,Vol 郾 9, No 郾 5 摇 557 两种电针对脊髓损伤 14 天后大鼠运动功能神经元及 MEK2 p 鄄 ERK1 表达的影响论著宋良玉摇吕威摇景泉凯摇莫雨