1144 中南大学学报 ( 医学版 ), 2016, 41(11) The ORR and pcr in HER2 negative or positive patients were 47.4% and 20.3% or 32.7% and 16.3%,

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湾颢康
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1 中南大学学报 ( 医学版 ) J Cent South Univ (Med Sci) 2016, 41(11) DOI: /j.issn 乳腺癌组织中 HER2 和 Topo IIα 的表达及其临床意义帅萍 ( 赣南医学院病理学教研室, 江西赣州 ) [ 摘要 ] 目的 : 检测人类表皮生长因子受体 (human epidermal growth factor 2,HER2) 和 Topo IIα 在乳腺癌组织中的表达情况, 并分析二者的表达对蒽环类药物新辅助化学治疗 ( 化疗 ) 的临床意义方法 : 采用荧光原位杂交 (fluorescence in situ hybridization,fish) 和免疫组织化学 ( 免疫组化 ) 方法对 189 例临床资料完整的浸润性乳腺癌组织样本进行 HER2 和 Topo IIα 基因和蛋白表达检测, 并对乳腺癌患者接受 TAC 新辅助化疗后的客观有效率 (objective response rate,orr) 和病理完全缓解率 (pathological complete rate,pcr) 进行统计和分析结果 : 在 189 例乳腺癌患者组织中, 经免疫组化检测的 HER2 蛋白表达 46 例 (24.3%)3+,Topo IIα 蛋白表达 55 例 (29.1%) 3+;FISH 检测,HER2 蛋白表达阳性 49 例 (25.9%),Topo IIα 蛋白表达阳性 94 例 (49.0%) HER2 阴性患者 ORR 为 47.4%,pCR 为 20.3%; 阳性患者 ORR 为 32.7%,pCR 为 16.3%, 两者差异均有统计学意义 ( 均 P<0.05) Topo IIα 阳性患者 ORR 为 69.1%,pCR 为 36%; 阴性患者 ORR 为 28.4%,pCR 为 2.2%, 两者差异均有统计学意义 ( 均 P<0.05) 结论:FISH 和免疫组化检查 HER2 和 Topo IIα 对于乳腺癌治疗具有重要指导意义, Topo IIα 基因扩增可以有效改善蒽环类药物辅助治疗效果 [ 关键词 ] 乳腺癌 ;HER2;Topo IIα; 荧光原位杂交技术 ; 免疫组织化学 Expressions of HER2 and Topo IIα in breast cancer and its clinical significance SHUAI Ping (Department of Pathology, Gannan Medical College, Ganzhou Jiangxi , China) ABSTRACT Objective: To detect the expressions of human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) and Topo IIα in breast cancer, and to analyze the clinical significance of neoadjuvant chemotherapy for the anthracycline-based drugs. Methods: The HER2 and Topo IIα gene and protein expressions in cancer tissues from 189 patients with breast cancer were detected by fluorescence in situ hybridization (FISH) and immunohistochemistry (IHC). And the objective response rate (ORR) and pathological complete rate (pcr) were analyzed. Results: The HER2 protein expression in 46 patients (24.3%) and Topo IIα protein expression in 55 patients (29.1%) was 3+ by IHC or they were 49 (25.9%) and 94 (49.0%) by FISH, respectively. 收稿日期 (Date of reception): 第一作者 (First author): 帅萍, shuaiping11w@sina.com 通信作者 (Corresponding author): 帅萍, shuaiping11w@sina.com

2 1144 中南大学学报 ( 医学版 ), 2016, 41(11) The ORR and pcr in HER2 negative or positive patients were 47.4% and 20.3% or 32.7% and 16.3%, respectively, with significant differences (All P<0.05). The ORR and pcr in Topo IIα positive or negative patients were 69.1% and 36.0% or 28.4% and 2.2%, respectively, with significant differences (All P<0.05). Conclusion: FISH and IHC were consistent in the determination of HER2 expression whereas they were inconsistent in the determination of Topo IIα expression. The amplification of Topo IIα can effectively improve the effect of the adjuvant treatment effect of the anthracyclines. KEY WORDS breast carcinoma; HER2; Topo IIα; fluorescence in situ hybridization; immunohistochemistry 乳腺癌已经成为全球女性发病率最高的恶性肿瘤之一虽然近些年通过一系列的手术放射治疗 ( 放疗 ) 化学药物治疗 ( 化疗 ) 免疫治疗使得乳腺癌病死率显著降低, 但仍然需要临床诊断技术的更新, 为早期精准诊断和治疗提供有效的手段 [1] 乳腺癌预后评估往往受到多因素 ( 浸润的程度肿瘤大小血管和淋巴管受累情况 ) 的影响, 目前还缺乏有效指示患者预后的指标 [1-2] 原癌基因 (human epidermal growth factor receptor-2,her2) 是具有酪氨酸激酶活性的细胞表皮生长因子, 其与调节细胞的增殖分化和生长相关 [2] 目前发现, 乳腺浸润性癌患者中有 20%~30% 存在 HER2 基因过表达 [3-4] 乳腺癌患者 HER2 过表达或基因扩增, 则预后较差, 靶向药物注射用曲妥珠单抗对乳腺癌 HER2 基因扩增患者有很好的疗效 DNA 拓扑异构酶 IIα(topoisomerase IIα, Topo IIα) 是一种 DNA 拓扑异构酶的编码基因, 它和蒽环类药物等多种抗肿瘤药物的药物敏感性相关, 对于评估乳腺癌接受蒽环类化疗的疗效具有重要作用 [5] 本研究旨在通过对手术切除的乳腺浸润性导管癌组织中 HER2 和 Topo IIα 蛋白和基因的表达分析, 为乳腺癌诊断预后判断临床用药提供指导 1 材料与方法 1.1 材料乳腺癌组织样本选择 2010 年 4 月至 2012 年 8 月期间于赣南医学院第一附属医院就诊的乳腺浸润性导管癌术后石蜡包埋组织 189 例患者均为女性, 年龄中位数 48.2(24~85) 岁, 其中有淋巴结转移者 74 例, 无淋巴结转移者 115 例所有纳入患者接受基本的病理诊断, 包括雌激素受体 (estrogen receptor,er) 和孕激素受体 (progesterone receptor, PR) 表达量的测定 ; 患者术前均未进行放化疗内分泌等治疗 ; 记录患者的肿瘤部位分化程度 TNM 分级淋巴结转移 ER 及 PR 等资料检测后患者均接受新辅助化疗方案 TAC 方案 ( 多西他赛 + 吡柔比星 + 环磷酰胺 ) 试剂免疫组织化学 ( 免疫组化 ) 兔抗人 HER2 多克隆抗体购于武汉博士德生物工程有限公司,DAB( 二氨基联苯胺 ) 试剂盒购于北京中山金桥生物技术有限公司, 免疫组化鼠抗人 Topo IIα 单克隆抗体购于北京中杉生物技术公司,Topo IIα 基因扩增试剂盒购于北京金菩嘉医疗科技有限公司 1.2 方法 HER2 和 Topo IIα 蛋白表达水平和基因扩增分析所有标本用 10% 的福尔马林溶液固定和石蜡包埋, 并连续切片 4 μm 厚免疫组化检测按照说明书操作, 所有样本切片脱蜡, 并以高温修复, 一抗 37 孵育 60 min, 并加入聚合物 A 孵育 20 min 后, 加入 Topo IIα 单抗 ( 鼠抗人 ) 或者 HER2 多克隆抗体聚合液于 37 孵育 30 min,dab 显色后使用苏木精复染荧光原位杂交 (FISH) 法 : 检测方法按照试剂盒说明书操作, 将石蜡切片脱蜡并置于 95 预处理液 10 min, 于蛋白酶 K 水浴锅中 37 孵育消化 10 min, 使用 1% 多聚甲醛固定 8 min; 滴加 10 μl 探针混合液后放入杂交仪中, 于 80 变性 5 min,37 杂交过夜 ; 加 120 U 4',6- 二脒基 -2- 苯基吲哚 (4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI) 显色, 并避光放置行显微镜检查阳性判读染色后, 由 3 位以上病理医师在没有患者的临床和病理数据时对免疫组织化学 (immuno-histochemistry, IHC) 结果进行评定, 阳性细胞数 ( 癌细胞呈现完整的强着色 ) > 30% 为阳性 (3+),IHC2+(>10% 的肿瘤细胞呈现弱至中度完整的胞膜染色或 30% 的肿瘤细胞呈现强的完整的胞膜着色 ) 为可疑,IHC+/ 为阴性 ( 肿瘤细胞有微弱的不完整的胞膜染色或无着色 ) FISH 检测为在 100 倍油镜下观察癌细胞核的杂交信号 HER2 或 Topo IIα 基因扩增及缺失检测的判读标准 :HER2/17 号染色体 (HER2/CEP17) 信号比 >2.0 或 HER2/CEP17 信号比 <2.0, 但平均 HER2 拷贝数 / 细胞 6.0 时也为 HER2 阳性, 判为基因扩增阳性 ;HER2/ CEP17 比值 <2.0 且平均 HER2 拷贝数 / 细胞 <6.0, 但拷贝

3 乳腺癌组织中 HER2 和 Topo IIα 的表达及其临床意义帅萍 1145 数 / 细胞 >4.0 时判读为可疑, 需进一步做 FISH 进行判断 ; 需要增加计数肿瘤细胞 100 个或重新做 FISH 实验来判断最终结果 ;FISH 检测 HER2/CEP17 比值 <2.0 且平均 HER2 拷贝数 / 细胞 <0.4 时, 判读为 FISH 阴性 [5] 新辅助治疗所有入组患者治疗期间接受 TAC 方案化疗 21 d 为 1 个周期, 共 4 个周期, 术后重复 2 周期孕激素受体超标患者在接受 4 个周期化疗后还需行手术治疗时, 术后可继续使用 TAC 方案进行治疗中位随诊时间 32(12~36) 个月分别计算其客观有效率 (objective response rate,orr) 和病理完全缓解率 (pathological complete rate,pcr), 并对数据进行统计学处理 1.3 统计学处理所有临床和实验数据采用统计学软件 SPSS 19.0 进行处理组间计数资料比较采用卡方检验,P<0.05 为差异有统计学意义组间一致性使用 Kappa 检验, 取值在 0~1 之间 Kappa 0.75, 两者一致性较好 ; 0.4 Kappa<0.75, 两者一致性一般 ;Kappa<0.4, 两者一致性较差 2 结果 2.1 HER2 在乳腺癌患者组织中的表达 189 例乳腺癌患者组织中经免疫组化检测的 HER2 蛋白表达 ( 表 1): 46 例 (24.3%)3+; 78 例 (41.3%)2+;44 例 (23.3%)1+;21 例 (11.1%) FISH 检测阳性为 49 例 (25.9%), 阴性为 140 例 (74.1%) 免疫组化检测 HER2 蛋白表达 3+ 者经 FISH 检测的吻合率为 97.8%(45/46);2+ 者 FISH 检测的吻合率 3.84%(3/78); 1+ 者 FISH 检测的吻合率 97.7%(1/44); 阴性者 FISH 检测的吻合率 100%(21/21) 免疫组化和 FISH 两种方法在检测 HER2 蛋白表达阳性率上 (24.3% vs 25.9%) 一致性较好 (Kappa 0.75) 表 1 HER2 基因在乳腺癌患者组织中表达分析 Table 1 Expression of HER2 gene in breast cancer tissue 免疫组化 FISH 检测结果 /[ 例 (%)] 检测结果阳性阴性合计 /[ 例 (%)] 3+ 45(97.8) 1(2.2) 46(24.3) 2+ 3(3.84) 75(96.1) 78(41.3) 1+ 1(2.27) 43(97.7) 44(23.3) 0(0) 21(100) 21(11.1) 合计 49(25.9) 140(74.1) Topo IIα 在乳腺癌组织中的表达 189 例乳腺癌患者组织中经免疫组化检测的 Topo IIα 蛋白表达 ( 表 2):55 例 (29.1)%)3+,39 例 (20.6%)2+,47 例 (24.9%)1+,48 例 (25.4%) FISH 检测阳性 94 例 (49.7%), 阴性 95 例 (50.3%) 免疫组化和 FISH 两种方法在检测 Topo IIα 蛋白表达阳性率上 (29% vs 49%) 一致性较差 (Kappa<0.4),+/ 检测率两种方法的吻合率相对较高 (Kappa 0.75) 2.3 Topo IIα 与 HER2 基因扩增与新辅助化疗预后的关系在所有入组患者中,HER2 阴性患者 ORR 为 47.1%,HER2 阳性患者为 32.7% HER2 阴性患者 pcr 为 20%, 阳性患者为 16.3% 阳性患者和阴性患者 ORR 和 pcr 比较差异均有统计学意义 (P<0.05; 图 1, 表 3) 表 2 Topo IIα 基因在乳腺癌患者组织中表达分析 Table 2 Expression of Topo IIα gene in breast cancer tissue 免疫组化 FISH 检测结果 /[ 例 (%)] 合计 / 检测结果阳性阴性 [ 例 (%)] 3+ 43(78) 12(22) 55(29.1) 2+ 16(42) 23(58) 39(20.6) 1+ 24(51) 23(49) 47(24.9) 11(24) 37(76) 48(25.4) 合计 94(49) 95(51) 189 图 1 HER2 基因扩增 ( 100) Figure 1 Amplification of HER2 ( 100) A: Negative HER2; B: Positive HER2 A B

4 1146 中南大学学报 ( 医学版 ), 2016, 41(11) 在所有入组患者中,Topo IIα 基因扩增阳性患者 ORR 为 69.1%, 阴性患者为 28.4% Topo IIα 基因扩增阳性患者 pcr 为 36%, 阴性患者为 2.2% 阳性患者和阴性患者 ORR 和 pcr 比较, 差异均有统计学意义 ( 均 P<0.05; 表 3, 图 2) 表 3 影响 HER2 和 Topo IIα 基因扩增对新辅助化疗方案疗效的 Table 3 Effect of gene amplification of HER2 and Topo IIα on the neoadjuvant chemotherapy regimens 基因表达 n ORR/[ 例 (%)] pcr/[ 例 (%)] HER2 阳性 49 16(32.7)* 8(16.3)* 阴性 (47.1) 28(20.0) Topo IIα 阳性 94 65(69.1)* 34(36.0)* 阴性 95 27(28.4) 2(2.2) 与阴性组比较,*P<0.05 A B 图 2 FISH 检测 Topo IIα 基因扩增 ( 100) Figure 2 Amplification of Topo IIα by FISH ( 100) A: Negative Topo IIα; B: Positive Topo IIα 3 讨论我国已成为乳腺癌发病率增长最快的国家之一, 发病年龄也逐渐呈年轻化的趋势, 乳腺癌已严重威胁女性身心健康和生活质量 [1] HER2 基因扩增或蛋白过表达与乳腺癌的不良预后密切相关, 并且可以作为注射用曲妥珠单抗靶向药物疗效的评估手段, 因此准确检测乳腺癌患者的 HER2 基因或蛋白的表达状况对于乳腺癌治疗具有重要指导意义 Topo IIα 属于 DNA 拓扑异构酶, 是一种 DNA 复制过程中的关键酶 [4-6] [7-8] 研究表明 Topo IIα 表达降低将严重影响蒽环类药物化疗的敏感性,Topo IIα 阳性表达者使用蒽环类药物的效率是 Topo IIα 阴性表达者的倍因此,Topo IIα 的表达对乳腺癌患者化疗药物的选择及预后具有重要的指导价值,Topo IIα 基因扩增的患者应用蒽环类药物辅助治疗, 可以有效改善药物的疗效 HER2 蛋白免疫组化检测因为价格低廉, 操作简单, 目前已经在临床病理科广泛采用但是免疫组化结果的准确率较低, 而 FISH 由于使用探针, 显著提高了结果的特异性和稳定性, 目前已越来越多地用于检测 HER2 基因本组资料显示 : 在 189 例乳腺癌患者组织中, HER2 经免疫组化检测 3+ 阳性率和经 FISH 检测阳性率 [9-11] 的 Kappa 检验一致性较高, 这与国内外很多报道一致而 Topo IIα 经免疫组化检测 3+ 阳性率和经 FISH 检测阳性率分别为 29% 和 49%, 两种检测方法经 Kappa 检验不存在一致性这说明采用 FISH 法检测 Topo IIα 基因扩增和免疫组化蛋白检测相关性不大, 这与国 [8-11] 内的研究结论相符合乳腺癌患者 HER2 基因扩增阳性的患者除接受靶向药物曲妥珠单抗治疗疗效显著外, 也能在接受含有蒽环类化疗药物新辅助化疗时获益 [12-13] [8-11] 越来越多的研究发现 Topo IIα 和 HER2 在多种肿瘤中表达模式一致或相似, 这可能预示着两种基因参与了肿瘤的发生本研究显示 HER2 基因扩增阳性患者的 ORR 和 pcr 明显低于阴性患者戴旭 [4] 等发现 Topo IIα 蛋白表达为阳性的患者, 接受蒽环类药物治疗时可能获得更好的化疗效果, 而 Topo IIα 基因扩增与患者辅助化疗的疗效之间的关系并无足够的证据, 需进一步研究基因层面上 Topo IIα 的作用机制本研究分析了 Topo IIα 基因扩增和辅助化疗的

5 乳腺癌组织中 HER2 和 Topo IIα 的表达及其临床意义帅萍 1147 关系, 结果显示 :Topo IIα 基因扩增阳性患者 ORR 为 69.1%, 阴性患者为 28.4% Topo IIα 基因扩增阳性患者 pcr 为 36.0%, 阴性患者为 2.2%, 阳性患者和阴性患者 ORR 和 pcr 均具有明显差异, 提示 Topo IIα 基因表达 HER2 基因表达与乳腺癌预后均具有一定的相关性, 这与多项研究结论一致 [11-13] 因此对 HER2 基因扩增和 Topo IIα 基因扩增的检测, 有助于乳腺癌患者新辅助化疗的疗效预测参考文献 [1] 张伟, 彭大云, 陈晓东, 等. 乳腺癌 HER2 基因荧光原位杂交与显色原位杂交检测对比研究 [ J]. 华南国防医学杂志, 2011, 25(1): ZHANG Wei, PENG Dayun, CHEN Xiaodong, et al. Comparison of fluorescent in situ hybridization and chromogenic in situ hybridization in detection of breast cancer HER2 gene[ J]. Military Medical Journal of South China, 2011, 25(1): [2] 魏志敏, 户燕姣, 赵洁, 等. 乳腺癌 HER2 检测技术的临床应用 [ J]. 中国现代医生, 2012, 50(3): WEI Zhimin, HU Yanjiao, ZHAO Jie, et al. The methods of detection for HER2/neu-oncogene in breast cancer and its clinical significance[ J]. China Modern Doctor, 2012, 50(3): [3] Tokiniwa H, Horiguchi J, Takata D, et al. Topoisomerase II alpha expression and the Ki-67 labeling index correlate with prognostic factors in estrogen receptor-positive and human epidermal growth factor type-2-negative breast cancer[ J]. Breast Cancer, 2012, 19(4): [4] 戴旭, 唐利立. Topo IIα 和 TUBB3 检测在乳腺癌新辅助化疗方案选择中的意义 [ J]. 中国普通外科杂志, 2013, 22(11): DAI Xu, TANG Lili. Significe of Topo IIα and TUBB3 determination in neoadjuvant chemotherapy regimen selection for breast cancer[ J]. Chinese Journal of General Surgery, 2013, 22(11): [5] 乳腺癌 HER2 检测指南 (2014 版 ) 编写组. 乳腺癌 HER2 检测指南 (2014 版 )[ J]. 中华病理学杂志, 2014, 43(4): The drafring group for Guide for the Detection of HER2 in Breast Cancer (2014 Edition). Guide for the detection of HER2 in breast cancer (2014 Edition)[ J]. Chinese Journal of Pathology, 2014, 43(4): [6] Slamon D, Eiermann W, Robert N, et al. Adjuvant trastuzumab in HER2-positive breast cancer[ J]. New Engl J Med, 2011, 365(14): [7] 肖海风, 于国华, 刘淑真, 等. Topo IIα 在乳腺癌中的表达与蒽环类药物敏感性的分析 [ J]. 中国医药科学, 2013, 3(18): XIAO Haifeng, YU Guohua, LIU Shuzhen, et al. Analysis between expression of topoisomerase IIα and sensitivity of epirubicin in patients with breast cancer[ J]. China Medicine and Pharmacy, 2013, 3(18): [8] 郑宇辉, 杨映红, 邱小文. 乳腺癌 HER2 基因 IHC 与 FISH 检测方法的比较及其与临床病理的关系 [ J]. 福建医科大学学报, 2013, 47(5): ZHENG Yuhui, YANG Yinghong, QIU Xiaowen. Comparison of immunohistochemistry and fluorescence in situ hybridization in detecting HER2 gene of breast cancer and its relationship with clinical pathology[ J]. Journal of Fujian Medical University, 2013, 47(5): [9] 朱萌, 张宁. FISH 和 IHC 法检测乳腺癌 HER2 基因一致性及其临床意义 [ J]. 宁夏医科大学学报, 2013, 35(9): ZHU Meng, ZHANG Ning. Consistency of HER2 gene detection in breast cancer using FISH and IHC methods and its clinical significance[ J]. Journal of Ningxia Medicial University, 2013, 35(9): [10] Press MF, Sauter G, Buyse M, et al. Alteration of topoisomerase II alpha gene in human breast cancer: Association with responsiveness to anthracycline-based chemotherapy[ J]. J Clin Oncol, 2011, 29(7): [11] Kodack DP, Chung E, Yamashita H, et al. Combined targeting of HER2 and VEGFR2 for effective treatment of HER2-amplified breast cancer brain metastases[ J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2012, 109(45): E3119-E3127. [12] 汤小江, 周瑜辉, 张伟, 等. TOP2A 基因表达与乳腺癌 HER2 通路的相关性 [ J]. 西安交通大学学报 : 医学版, 2015, 36(4): TANG Xiaojiang, ZHOU Yuhui, ZHANG Wei, et al. Correlation between expression of TOP2A and HER2 signaling pathway in breast cancer[ J]. Journal of Xi an Jiaotong University. Medical Sciences, 2015, 36(4): [13] Schneeweiss A, Chia S, Hickish T, et al. Pertuzumab plus trastuzumab in combination with standard neoadjuvant anthracycline-containing and anthracycline-free chemotherapy regimens in patients with HER2-positive early breast cancer: a randomized phase II cardiac safety study (TRYPHAENA)[ J]. Ann Oncol, 2013, 24(9): ( 本文编辑陈丽文 ) 本文引用 : 帅萍. 乳腺癌组织中 HER2 和 Topo IIα 的表达及其临床意义 [ J]. 中南大学学报 : 医学版, 2016, 41(11): DOI: /j.issn Cite this article as: SHUAI Ping. Expressions of HER2 and Topo IIα in breast cancer and its clinical significance[ J]. Journal of Central South University. Medical Science, 2016, 41(11): DOI: / j.issn

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864 现代药物与临床 Drugs & Clinic 第 31 卷第 6 期 2016 年 6 月 of apoptosis related factors, decrease the incidence of adverse reactions, which is of great 现代药物与临床 Drugs & Clinic 第 31 卷第 6 期 2016 年 6 月 863 曲妥珠单抗联合多西紫杉醇治疗 Her-2 阳性乳腺癌的临床研究 * 周永安, 刘训碧黄石市中心医院 ( 普爱院区 ) 乳腺肿瘤外科, 湖北黄石 435000 摘要 : 目的探析注射用曲