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1 生物技术进展 2016 年第 6 卷第 3 期 212 ~218 Current Biotechnology ISSN 研究论文 Articles 重组人干扰素 α2b 的制备研究梁果义 ꎬ 刘晓航北京双鹭药业股份有限公司 ꎬ 北京摘要 : 为了获得高活性高纯度的 rhifn α2bꎬ 对重组人干扰素 α2b 进行克隆表达 ꎬ 并深入研究了其纯化工艺 ꎮ 采用重叠延伸 PCR 法合成了编码 IFN α2b 的基因 ꎬ 用 DNA 重组技术构建了原核表达载体 pbv220 IFN α2bꎬ 获得了稳定的工程菌种 ꎮ 发酵产物通过破菌洗涤获得包涵体 ꎬ 再经过变性复性离子交换层析和凝胶过滤层析的纯化 ꎬ 得到 rhifn α2b 纯品 ꎬ 其比活可达 IU / mgꎮ 实验结果为进一步开展临床前研究和长效制剂奠定了基础 ꎮ 关键词 : 干扰素 α2bꎻ 制备 ꎻ 表达 ꎻ 纯品 DOI: / j.issn Study on the Preparation of Recombinant Human Interferon α2b LIANG Guo yiꎬ LIU Xiao hang Company Profile of Beijing SL Pharmꎬ Beijing ꎬ China Abstract:Recombinant human interferon α2b was prepared by cloningꎬ expressionꎬ purification for obtaining rhifn α2b with high activity and purity. Overlap extension PCR was performed to obtain the gene encoding for IFN α2b. A prokaryotic vector expressing rhifn α2b was constructed successfully. The expression vector pbv220 IFN α2b was transformed into E. coli strain DH5α. After fermentationꎬ the bacteria cells was collected and lysed. Finallyꎬ the rhifn α2b was purified by denaturationꎬ renaturationꎬ ion exchange chromatography and gel filtration chromatographyꎬ and its specific activity reached IU / mg. The results was expected to lay the foundation for preclinical research and long acting preparation. Key words:interferon α2bꎻ preparationꎻ expressingꎻ purify 干扰素是一类重要的细胞因子 ꎬ 具有普遍的生物学功能 ꎬ 可以抵抗病毒感染 ꎬ 影响细胞生长分化和调节生物机体免疫的功能 ꎮ 它在疾病的临床治疗上使用数年 ꎬ 在治疗病毒性感染癌症和多发性免疫疾病等方面都有广泛的应用 ꎮ 目前世界上包括中国在内的 50 多个国家已批准干扰素上市 ꎬ 治疗约 30 多种疾病 ꎬ 如慢性乙型肝炎 (CHB) SARS 病毒毛细胞白血病尖锐湿疣艾滋病患者的卡波济肉瘤慢性肉芽肿瘤病毒性红眼病病毒性角膜炎唇和生殖器疱疹水痘慢性 [1~ 4] 宫颈炎和巨细胞病毒病等 ꎮ 目前所报道过的干扰素按照细胞结构和来源可分为 α β γ 干扰素 3 个型别 ꎬ α 干扰素又称人白细胞干扰素 ꎬ 它是由 B 淋巴细胞和单核细胞产生的 ꎮ α 干扰素亚型至少有 23 种 ꎬ 成簇分布于人第 9 号染色体的 p22 区 ꎬ 总长度 1 ~ 2 kbꎬ 没有内含子 ꎮ 干扰素 α2b 是由 165 个氨基酸残基组成的单链多肽 [3] ꎬ 理论值分子量为 Daꎬ 含 4 个 Cys 残基 ꎬ 形成 2 个分子内二硫键 (Cys1 和 Cys98 Cys29 和 Cys138)ꎬ 其中 Cys29 和 Cys138 之间的二硫键对 IFN α2b 形成特定的立体结构和表现生物活性非常重要 [5ꎬ6] ꎮ IFNα2b 等电点在 ph 5 ~ 6 之间 ꎬ 在 ph 2.5 的溶液中稳定 ꎬ 在 0.1%SDS 溶液中稳定 ꎬ 对热亦稳定 ꎬ 对各种蛋白酶敏感 ꎮ 天然 α 干扰素无糖基化位点 ꎮ 目前已有 40 kda PEG 修饰的 IFN α2a ( Pegasys ) 和 12 kda PEG 修饰的 IFN α2b 收稿日期 : ꎻ 接受日期 : 作者简介 : 梁果义 ꎬ 副研究员 ꎬ 主要从事生物制品的研发 ꎮ Tel: ꎮ E mail:liangguoyi@ slpharm.com.cn

2 梁果义 ꎬ 等 : 重组人干扰素 α2b 的制备研究 213 (PegIntron Shering Plough) 应用于临床 ꎬ 这两类产品都能够延长 IFN α 在体内的半衰期 ꎮ 然而 ꎬPEG 修饰的 IFN α 在体外的抗病毒活性较之未经修饰的 IFN α 都有所降低 [7] ꎮ 修饰过的干扰素延长半衰期 ꎬ 改进药物治疗的有效性和耐受性 ꎮ 干扰素的制备是干扰素药物研发的一个难点 ꎮ 虽然包涵体复性过程繁琐收率低 ꎬ 但是表达量高成本低生产周期短 ꎬ 干扰素通常以大肠杆菌包涵体的形式表达 ꎮ 本研究通过基因工程方法拼接成功构建了原核表达载体 pbv220 IFN α2bꎬ 获得了工程菌种 ꎬ 改进了纯化方法 ꎬ 加入凝胶过滤层析 ꎬ 制备高纯度的样品 ꎬ 提高了生物活性 ꎬ 以期为进一步开展药学研究和长效制备提供依据 ꎮ 1 材料与方法 1.1 实验材料 DH5α 感受态细胞为全式金生物技术有限公司产品 ꎬ 质粒 pbv220 为本实验室保存 ꎬ DNA 片段由北京三博远志生物技术有限责任公司合成 ꎻ 核酸纯化试剂盒质粒提取试剂盒为 Omega 公司产品 ꎻ 低分子量核酸标记物 TaKaRa DL2000 dntp 各种限制性内切酶 T4 DNA 连接酶为 TaKaRa 公司产品 ꎻpfu DNA 聚合酶为 TianGen 公司产品 ꎻ 氨苄青霉素为石药集团产品 ꎻTris 为 Pro mega 公司产品 ꎻSDS 丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺为 Sigma 公司产品 ꎻ Tryptone Yeast extraction 为 OXIOD 公司产品 ꎻ 结晶紫为北京旭东化工厂产品 ꎻRPMI1640 为 GBICO 公司产品 ꎻ 其余为国产分析纯试剂 ꎮ Q Sepharose Fast Flow Sephacryl S 100 均为 GE 公司产品 ꎬ 其他溶液配方见表 1ꎮ 1.2 实验方法 IFN α2bdna 片段的合成 DNA 片段的设 [8] 计参考魏开坤等重组人干扰素 α2b 的基因序列 ꎬ 根据实验设计把 α2b 全基因分成 16 个片段 ꎬ 即 A1 ~ A16 个序列 ( 表 2)ꎬ 接着以顺序拼接成整条寡核苷酸 ꎬ 相临的片段之间均包含一部分重叠序列 ꎬ 并在 N 末端和 C 末端相应导入限制性内切酶 EcoRⅠ SalⅠ 的酶切位点 ꎮ 表 1 本研究所用到的溶液配方 Table 1 Solution formula used in this study. 溶液名称配方 LB 培养基胰蛋白胨 10 g / Lꎬ 酵母提取物 5 g / LꎬNaCl 10 g / LꎬpH 7.5 裂解缓冲液 20 mmol / L Tris HClꎬ4 mmol / L EDTAꎬpH 8.0 包涵体洗涤液 A 20 mmol / L Tris HClꎬ1 mol / L 尿素 ꎬ1% TritonX 100ꎬ0.15 mol / L NaClꎬ2 mmol / L EDTAꎬpH 8.0 包涵体洗涤液 B 20 mmol / L Tris HClꎬ2 mol / L 尿素 ꎬ1% TritonX 100ꎬ0.15 mol / L NaClꎬ 2 mmol / L EDTAꎬ ph 8.0 变性缓冲液 100 mmol / L Tris HClꎬ6 mol / L 盐酸胍 ꎬ0.15% β 巯基乙醇复性缓冲液 20 mmol / L Tris HClꎬ0.5 mol / L 甘氨酸 ꎬ0.15% PEG 6000ꎬ4 mmol / L EDTAꎬ ph 8.0 平衡缓冲液 A 10 mmol / L Tris HClꎬpH 8.0 洗脱缓冲液 A 10 mmol / L Tris HClꎬ0.2 mol / L NaClꎬpH 8.0 平衡缓冲液 B 20 mmol / L PBꎬ0.15 mol / L NaClꎬpH 7.0 利用重叠延伸 PCR 法进行 rhifn α2b 全基因合成 ꎮ 延伸 PCR 法扩增 IFN α2b 流程 :1 将片段 A1 ~ A4 A5 ~ A8 A9 ~ A12 A13 ~ A16 四四混合 ꎬ 配制 PCR 反应混合物进行 PCR 延伸 ꎮ 将 A1 ~ A4 A5 ~ A8 A9 ~ A12 A13 ~ A16 各组 PCR 产物标记为 B1 B2 B3 B4ꎮ 2 将 B1 B2 作为核心模板 ꎬA1 A8 作为两头的引物 ꎻ 将 B3 B4 作为核心模板 ꎬA9 A16 作为两头的引物 ꎻ 配制 PCR 反应混合物 ꎬ 进行 PCR 延伸 ꎮ 将 B1 B2 A1 A8 组和 B3 B4 A9 A16 组 PCR 产物标记为 C1 C2ꎮ 将 C1 C2 作为核心模板 ꎬA1 A16 作为两头的引物 ꎬ 配制 PCR 反应混合物 ꎬ 进行 PCR 循环 ꎮ 1% 琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 最终扩增产物 [9] ꎮ 表达质粒 pbv220 IFN α2b 的构建通过

3 214 生物技术进展 Current Biotechnology Table 2 表 2 α2b 基因片段序列 Sequence of α2b gene fragment. 序列名称 A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 A13 A14 A15 A16 序列 (5 3 ) 5 GAGGAATTCATGTGTGACCTGCCGCAGACCCACTC 3 5 GAGCCAGCAGCATCAGGGTACGACGAGAACCCAGAGAGTGGGTCTGCGGCAG 3 5 CCTGATGCTGCTGGCTCAGATGCGTCGTATCTCTCTGTTCTCTTGCCTGAAAG 3 5 CTCTTCCTGCGGGAAACCGAAGTCGTGACGGTCTTTCAGGCAAGAGAACAG 3 5 GGTTTCCCGCAGGAAGAGTTCGGTAACCAGTTCCAGAAAGCTGAAACCATCC 3 5 GAAGATCTGCTGGATCATTTCGTGCAGAACCGGGATGGTTTCAGCTTTCTG 3 5 AAATGATCCAGCAGATCTTCAACCTGTTCTCTACCAAAGACTCTTCTGCTGC 3 5 GGTGTAGAATTTGTCCAGCAGGGTTTCGTCCCAAGCAGCAGAAGAGTCTTTGG 3 5 GCTGGACAAATTCTACACCGAACTGTACCAGCAGTTGAACGACCTGGAAGC 3 5 GGTTTCGGTAACACCAACACCCTGGATAACGCAAGCTTCCAGGTCGTTCAAC 3 5 TGTTGGTGTTACCGAAACCCCGCTGATGAAAGAAGACTCTATCCTGGCTGTTC 3 5 CAGGTACAGGGTGATACGCTGGAAGTATTTACGAACAGCCAGGATAGAGTC 3 5 CGTATCACCCTGTACCTGAAAGAAAAGAAATACTCTCCGTGCGCTTGGGAAG 3 5 GAGAGAAAGAACGCATGATTTCAGCACGAACAACTTCCCAAGCGCACGGAG 3 5 AATCATGCGTTCTTTCTCTCTGTCTACCAACCTGCAGGAATCTCTGCGTTC 3 5 GACGTCGACTCATTCTTTAGAACGCAGAGATTCCTGC 3 琼脂糖凝胶电泳回收目的基因 IFN α2b 的 PCR 产物 ꎬ 与表达载体 pbv220 进行 EcoRⅠ 与 SalⅠ 双酶切 ꎬ 于 37 酶切 3 hꎬ 回收备用 ꎮ 目的片段经过内切酶 EcoRⅠ 与 SalⅠ 消化 ꎬ 将消化后的目的片段 IFN α2b 和同样酶切后载体 pbv220 的连接体系混合 ꎬ 产物于 4 孵育过夜 ꎮ 取部分连接体系热转化大肠杆菌 DH5α 感受态细胞 ꎮ 32 孵育 0.5 hꎬ 涂布于含相应抗性的 LB 平板 ꎬ 平板置于超净台晾干 ꎮ 32 培养箱过夜培养 ꎮ 挑取克隆 ꎬ 经过质粒小量制备后 ꎬ 进行 EcoRⅠ 与 SalⅠ 双酶切 ꎬ 于 37 酶切 3 hꎬ1% 琼脂糖凝胶电泳检测酶切反应产物 ꎮ 阳性菌落菌种保藏后测序 ꎮ 重组 pbv220 rhifn α2b 的表达验证将阳性菌落按照 1% 比例接种到含 50 μg / ml 氨苄青霉素的新鲜 LB 培养基中 ꎬ 于 32 ꎬ200 r / min 培养 3 hꎬ 升温至 42 ꎬ 继续培养 4 hꎮ 于 r / min 离心 5 minꎬ 收获菌体沉淀 ꎬ 向沉淀中加入 100 μl 水重悬 ꎬ 取 10 μl 加入 10 μl 2 Loading Buffer 沸水浴 5 minꎬ 取 10 μl 上样 ꎮ 把上述方法诱导表达后获得的菌体沉淀重悬 ꎬ 超声破碎 ꎬ r / min 离心 20 minꎬ 分别取上清沉淀 ꎬ15% SDS PAGE 电泳 ꎬ 观察目的蛋白在上清和沉淀中的表达情况 ꎮ 基因工程菌 pbv220 IFN α2b / DH5α 的发酵培养一级种子培养 : 将 150 ml 甘油保存菌接种于装有 100 ml LB 液体培养基 (Ampicillin 100 μg / ml) 的 250 ml 三角瓶中 ꎬ 于 32 ꎬ200 r / min 培养约 10 hꎮ 二级种子培养 : 以 120 μl / 200 ml 的接种量接种一级种子培养液于 10 个装有 200 ml LB 液体培养基 ( 含氨苄青霉素 100 μg / ml) 的 500 ml 三角瓶中 ꎬ 于 r / min 培养约 12 hꎮ 发酵 : 发酵罐工作容积 :20 Lꎻ 种子液接种量 : 10 %ꎬ 共 2 Lꎮ 按 10% 接种量将二级种子培养液接种到 30 L 发酵罐中进行培养 ꎬ 发酵体积为 20 LꎬpH 控制在 7.00± 0.05ꎬ 通过发酵控制系统自动补加 5 mol / L NaOH 调节 phꎮ 温度控制在 32 ꎬ 溶氧控制在 30% 以上 ꎬ 培养过程中可通过提高通气量和搅拌速度来提高溶氧量 ꎮ 发酵过程中定时取样检测细菌密度和培养基中的葡萄糖含量 ꎮ 培养菌株至 OD 600 约为 3.5 时 ꎬ 培养基中的葡萄糖几乎消耗完毕 ꎬ 以 2 ml / min 的流速滴加补料

4 梁果义 ꎬ 等 : 重组人干扰素 α2b 的制备研究 215 液 ꎬ 培养至 OD 600 约为 4 时 ꎬ 迅速升温至 42 ꎬ 热诱导表达 3 hꎬ 离心收集湿菌体 ꎮ [10] 重组蛋白 rhifn α2b 的分离纯化达后菌液的处理 : 按 200 g 发酵湿菌体加 4 L 起始缓冲液 ꎬ 均匀悬浮细菌后 ꎬ 进行超声破碎 ꎬ1 L / 次 ꎬ Wꎬ 超声 1 sꎬ 间隙 1 sꎬ40 minꎮ r / min 离心 20 minꎬ 收集包涵体沉淀 ꎮ 表将包涵体沉淀分别用包涵体洗涤液 A 包涵体洗涤液 B 起始缓冲液洗涤一次 ꎬ8 000 r / min 离心 20 minꎬ 收集包涵体 ꎮ 将包涵体沉淀用包涵体缓冲液溶解 (10 ml / g 包涵体沉淀 )ꎬ4 搅拌过夜 ꎬ8 000 r / min 离心 20 minꎬ 收集上清液 ꎬ 即为包涵体变性液 ꎮ 包涵体蛋白的复性 : 在缓慢磁力搅拌下 ꎬ 将包涵体变性液以 ( V / V) 加入到复性缓冲液中 ꎬ 完全加入后静置 4 hꎮ 复性蛋白的透析 : 将复性蛋白装入处理好的透析袋 ( 截留分子量为 14 kda)ꎬ 完全浸入 20 倍样品体积的 10 mmol / L Tris HClꎬ ph 8.0 透析液中透析 24 hꎮ 其间可更换 3 次透析液 ꎮ 透析完成后收集蛋白溶液 ꎬ8 000 r / min 离心 20 minꎬ 收集上清液备用 ꎮ Q Sepharose Fast Flow 离子交换层析 : 用平衡缓冲液 A 对层析柱进行平衡 ꎬ 使得流出液的电导 ph 和平衡缓冲液 A 一样 ꎬ 将透析离心后所获得的目的样品上样 ꎮ 用平衡缓冲液 A 淋洗 ꎬ 去除非特异性吸附的蛋白 ꎮ 用洗脱缓冲液 A 进行洗脱 ꎬ 流速为 0.5 ml / minꎮ 用 15% SDS PAGE 电泳对收集的样品进行检测 ꎮ 把收集的样品用超滤的方法进行浓缩处理 ꎬ 准备下一步纯化 ꎬ 选择截留分子量为 kda 的膜包 ꎮ Sephacryl S 100 凝胶过滤层析 : 用平衡缓冲液 B 对层析柱进行平衡 ꎬ 使得流出液的电导 ph 和平衡缓冲液 B 一样 ꎬ 将超滤浓缩后所获得的目的样品上样 ꎮ 用平衡缓冲液 B 进行洗脱 ꎬ 流速为 1 ml / minꎬ 分段收集 ꎮ 用 15% SDS PAGE 电泳对收集的样品进行检测 ꎮ 蛋白含量测定蛋白质含量测定使用 Lowry 法 ( 即 Folin 酚法 ) [11] ꎮ 精密称取牛血清白蛋白 ꎬ 用水溶解成不同的浓度作为标准蛋白质溶液 ꎬ 取一定量的样品适当稀释 ꎬ 测得样品吸光度 ꎮ 以标准品蛋白质浓度为横坐标 ꎬ 吸光度为纵坐标绘制标准曲线 ꎬ 将样品对应的吸光度代入直线回归方程 ꎬ 计算样品的蛋白质含量 ꎮ 体外生物活性测定采用细胞病变抑制法测定干扰素的体外生物学活性 [12] ꎮ 2 结果与分析 2.1 重叠延伸 PCR 法合成 IFN α2b cdna 经过三步重叠 PCRꎬ 最终检测结果见图 1ꎬ 可见 PCR 产物在 500 bp 左右出现了谱带 ꎮ 条带清晰 ꎬ 大小与设计相同 ꎬ 可用于后续构建实验 ꎮ 图 1 干扰素 α2b 的 PCR 扩增 Fig.1 PCR amplifications of IFN α2b. M: DL2000 Markerꎻ1: 重叠 PCR 扩增的 IFN α2b 2.2 提取质粒后进行双酶切对阳性重组子的验证挑取转化后平板中的克隆子 ꎬ 培养后利用质粒提取试剂盒提取质粒 ꎬ 用 EcoRⅠ 和 SalⅠ 酶切 ꎬ 在 500 bp 左右的位置 ꎬ 泳道 2 出现了谱带 ( 图 2)ꎬ 证明质粒中插入基因与目的基因大小相同 ꎬ 说明质粒构建成功 ꎮ 2.3 对阳性克隆重组子的诱导表达验证对阳性菌落进行测序 ꎬ 测序结果与设计相同 ꎮ 进行诱导表达验证 ꎬ 并进行 15% SDS PAGE 检测 ꎬ 结果见图 3ꎮ 与诱导前相比 ꎬ 诱导后蛋白表达明显 ꎬ 且与 α2b 标准品大小相同 ꎬ 证明菌种可表达 α2b 蛋白 ꎮ 分别取菌体沉淀超声破碎后的上清和沉淀进行 15% SDS PAGE 检测 ꎬ 结果证实其为包涵体表达 ꎮ 2.4 基因工程菌 pbv220 IFN α2b / DH5α 的发酵培养 3 批发酵的湿菌体进行 15% SDS PAGE 分析 ꎬ 电泳图谱见图 4ꎮ 可见蛋白表达明显 ꎬ 该菌种

２１６生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２.５２.５.１重组蛋白ｒｈｉｆｎ α２ｂ的分离纯化表达后菌液处理的电泳分析结果按实验１.２.５方法ꎬ菌种经发酵培养ꎬ菌体破碎ꎬ包涵体洗涤ꎬ各阶段进行１５ＳＤＳＰＡＧＥ分析ꎬ电泳图谱见图５ꎮ ｒｈｉｆｎ α２ｂ的分子量为１９.

Ｍ:ＤＬ１００ＰｌｕｓＤＮＡＭａｒｋｅｒꎻ１:ＥｃｏＲⅠ和ＳａｌⅠ酶切ｐｂｖ２２０ꎻ２: ＥｃｏＲⅠ和ＳａｌⅠ酶切ｐｂｖ２２０ＩＦＮ α２ｂ图５Ｆｉｇ.５ｒｈｉｆｎ α２ｂ包涵体的电泳检测Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｒｈｉｆｎ α２ｂｉｎｃｌｕｓｉｏｎｂｏｄｙ.

5 ２１６生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２.５２.５.１重组蛋白ｒｈｉｆｎ α２ｂ的分离纯化表达后菌液处理的电泳分析结果按实验１.２.５方法ꎬ菌种经发酵培养ꎬ菌体破碎ꎬ包涵体洗涤ꎬ各阶段进行１５ＳＤＳＰＡＧＥ分析ꎬ电泳图谱见图５ꎮ ｒｈｉｆｎ α２ｂ的分子量为１９.２ｋｄａꎬ在对照品２２ｋｄａ和１４ｋｄａ之间有一条明显的蛋白条带ꎬ即为ｒｈｉｆｎ α２ｂ的表达产物ꎮ 目的蛋白存在于离心沉淀中ꎬ破菌上清中没有ꎬ说明目的蛋白以包涵体形式表达ꎮ 图２Ｆｉｇ.２ｐｂｖ２２０ＩＦＮα２ｂ酶消化Ｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎｏｆｐｂｖ２２０ＩＦＮα２ｂ. Ｍ:ＤＬ１００ＰｌｕｓＤＮＡＭａｒｋｅｒꎻ１:ＥｃｏＲⅠ和ＳａｌⅠ酶切ｐｂｖ２２０ꎻ２: ＥｃｏＲⅠ和ＳａｌⅠ酶切ｐｂｖ２２０ＩＦＮ α２ｂ图５Ｆｉｇ.５ｒｈｉｆｎ α２ｂ包涵体的电泳检测Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｒｈｉｆｎ α２ｂｉｎｃｌｕｓｉｏｎｂｏｄｙ. Ｍ:低分子量蛋白Ｍａｒｋｅｒꎻ１:重组大肠杆菌的总蛋白ꎻ２:重组大肠杆菌的可溶性蛋白ꎻ３ ~ ５:经包涵体洗涤液Ａ ~ Ｃ冲洗后的重组大肠杆菌非可溶性蛋白２.５.２ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ离子交换层析及电将ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ离子交换层析洗泳分析结果图３ｐｂｖ２２０ｒｈｉｆｎ α２ｂ诱导表达Ｉｎｄｕｃｅｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｐｂｖ２２０ｒｈｉｆｎ α２ｂ. Ｆｉｇ.３脱收集的样品做１５ＳＤＳＰＡＧＥ检测ꎬ观察每一步层析的洗脱情况及其纯度ꎬ电泳结果见图６ꎮ １:未经诱导的ｐｂｖ２２０ＩＦＮ α２ｂꎻ２:热诱导的ｐｂｖ２２０ＩＦＮ α２ｂꎻ ３:标准蛋白ｒｈｉｆｎ α２ｂ图６ｒｈｉｆｎ α２ｂ离子交换层析的电泳检测Ｆｉｇ.６Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｒｈｉｆｎ α２ｂｏｎＩＥＣ. Ｍ: 低分子量蛋白Ｍａｒｋｅｒꎻ１: ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ峰值蛋白图４Ｆｉｇ.４ｒｈｉｆｎ α２ｂ表达的电泳检测Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｒｈｉｆｎ α２ｂｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｂｙ１５ＳＤＳＰＡＧＥ. ２.５.３结果ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ１００凝胶过滤层析及电泳分析按照ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ１００凝胶过滤层析的蛋白Ｍ:Ｍａｒｋｅｒꎻ１ ~ ３:３批发酵菌体的总蛋白出峰情况分段收集的样品进行１５ＳＤＳＰＡＧＥ检可用于发酵制备 α２ｂ蛋白ꎮ 电泳检测３批样品度ꎬ电泳图谱见图７ꎮ 分析ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ洗脱液蛋白条带ꎬ同目的蛋白的分子量一致ꎬ此发酵工艺杂蛋白ꎬ而且分子量大于目的蛋白ꎬ可以尝试凝胶中ꎬ在分子量２０ｋｄａ左右的位置都有明显的一条稳定ꎬ能够获得目的蛋白ꎮ 测ꎬ观察各个样品中蛋白条带的分布情况及其纯的电泳检测结果ꎬ除了目的蛋白条带还有２ ~ ３条过滤层析的方法进一步分离ꎮ 凝胶过滤层析分段

梁果义 ꎬ 等 : 重组人干扰素 α2b 的制备研究 217 收集 10 瓶 ꎬ 第 7 ~ 10 瓶没有杂蛋白 ꎬ 可以合并保存 ꎮ 2.5.

6 梁果义 ꎬ 等 : 重组人干扰素 α2b 的制备研究 217 收集 10 瓶 ꎬ 第 7 ~ 10 瓶没有杂蛋白 ꎬ 可以合并保存 ꎮ 蛋白质收率蛋白质粗提过程中 ꎬ 每取 200 g 湿菌体 ꎬ 获包涵体 50 gꎬ 包涵体变性液 500 mlꎬ 可分批复性 ꎮ 每 200 g 湿菌体可获 rhifn α2b 纯品 218 mgꎮ 蛋白质复性后各步蛋白含量活性等情况见表 3(3 批复性结果 )ꎮ 对比 3 批的实验结果 ꎬ 生物活性都达到了 IU / mgꎬ 目的蛋白活性稳定 ꎬ 回收率可达 4.0% 以上 ꎬ 此工艺可行 ꎬ 能够用于放大生产工艺的开发 ꎮ 图 7 rhifn α2b 凝胶层析的电泳检测 Fig.7 Detection of rhifn α2b on GFC by 15% SDS PAGE. 1~ 10: 分段收集的蛋白片段 Table 3 表 3 rhifn α2b 纯化结果 The results of purification for rhifn α2b. Lot 方法复性离子交换层析凝胶过滤层析总体积 (ml) 蛋白质含量 (mg / ml) 蛋白质 (mg) 活性 ( IU) 比活 ( 10 7 IU / mg) 蛋白产量 (%) 活性产量 (%) 纯化 (X fold) 讨论采用了重叠延伸 PCR 法成功合成了 rhifn α2b 基因 ꎬ 构建了表达质粒 pbv220 rhifn α2bꎬ 表达产物 rhifn α2b 在大肠杆菌 DH5α 中以包涵体的形式存在 ꎬ 蛋白表达量可占全菌蛋白的 23% ~ 32%ꎮ 发酵产物通过破菌包涵体抽提变性复性阴离子交换层析 Q Sepharose FF 以及凝胶过滤层析 Sephacryl S 100 的纯化方法 ꎬ 得到纯品 rhifn α2bꎬ 比活达到 IU / mgꎬ 每 200 g 湿菌体可获 rhifn α2b 纯品 218 mgꎮ 本实验在进行 PCR 时 ꎬ 将相邻片段两两互补延伸以后 ꎬ 再与相邻片段互补延伸 ꎬ 最后是两个大片段拼出全长基因 ꎬ 虽然步骤较多 ꎬ 但 PCR 效果较好 ꎬ 显示出良好的应用前景 ꎮ 包涵体是指通过基因工程技术 ꎬ 大肠杆菌表达的重组蛋白在细胞内凝集 ꎬ 形成没有活性的固体颗粒 ꎮ 本实验包涵体洗涤中 ꎬ 采用低浓度的尿素能溶解部分杂蛋白 ꎬTriton X 100 能溶解脂质和脂膜蛋白 ꎮ 有文献报道 ꎬ 在复性过程中 ꎬ 会出现大量的二聚体 ꎬ 可能是一级结构错配造成的 ꎬ 一般采用离子交换和疏水层析的方法纯化 [13] ꎮ 本实验重新优化了菌种 ꎬ 采用两步色谱法分离纯化 rhifn α2bꎬ 凝胶过滤层析替代疏水层析 ꎬ 生物活性大大提高 ꎮ 本研究合成了编码 IFN α2b 的基因 ꎬ 构建了表达载体 pbv220 IFN α2bꎬ 并在大肠杆菌 DH5α 内得到表达 ꎮ 同时建立了 rhifn α2b 大肠杆菌表达后的分离纯化工艺 ꎮ 发酵产物通过破菌经过裂解洗涤液去除杂质获得高纯度的包涵体 ꎬ 变复性 Q Sepharose FF 离子交换层析和凝胶过滤层析 Sephacryl S 100 进行纯化 ꎬ 得到 rhifn α2b 纯品 ꎬ 其比活可达 IU / mgꎮ 参考文献 [1] 侯云德. 干扰素及其临床应用 [M]. 江苏 : 江苏科学技术出版社 ꎬ 1981ꎬ 3.

7 218 生物技术进展 Current Biotechnology [2] 吴梧桐 ꎬ 丁锡申 ꎬ 刘晶晶. 基因工程药物 - 基础与临床 [M]. 北京 : 人民卫生出版社 ꎬ [3] 吴玉厚 ꎬ 吴冰洁 ꎬ 周国利 ꎬ 等. 干扰素研究进展 [J]. 生物学教学 ꎬ 2007ꎬ 32(7): 2-4. [4] 侯相山 ꎬ 王洪水. 干扰素研究进展 [ J]. 安徽农业科学 ꎬ 2007ꎬ 35(6): [5] 何成 ꎬ 朱运松. 干扰素的分子生物学研究进展 [J]. 国外医学 - 微生物学手册 ꎬ 1994ꎬ 17(4): ꎬ155. [6] Leigh J Wꎬ Paul P Tꎬ Mark R Wꎬ et al.. Zinc mediated dimer of human interferon α2b revealed by X ray crystallography Ra maswamy[ J]. Structureꎬ 1996ꎬ 4(12): [7] Bruno Rꎬ Sacchi Pꎬ Cima Sꎬ et al.. Comparison of peginterferon pharmacokinetic and pharmacodynamic profiles [J]. J. Viral. Hepat.ꎬ 2012ꎬ19 (1): [8] 魏开坤 ꎬ 马学军 ꎬ 张丽兰 ꎬ 等. 人 α2b 型干扰素的基因合成表达质粒构建及产物的制法 [ P ]. 中国 ꎬ ꎬ2001. [9] 萨姆布鲁克 Jꎬ 拉塞尔 D Wꎬ 著 ꎬ 黄培堂 ꎬ 译. 分子克隆实验指南 ( 第三版 )[M]. 北京 : 科学出版社 ꎬ2002ꎬ [10] 汪家政 ꎬ 范明. 蛋白质技术手册 [M]. 北京 : 科学出版社 ꎬ 2000ꎬ [11] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典 2010 版 ( 附录 34) [M]. 北京 : 中国医药科技出版社 ꎬ [12] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典 2010 版 ( 附录 71-72)[M]. 北京 : 中国医药科技出版社 ꎬ [13] 韩霭辰 ꎬ 王劲峰. 疏水相互作用层析分离重组人干扰素 a2b [J]. 微生物学免疫学进展 ꎬ2012ꎬ40(6):8-12.

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽