链球菌溶血素O的基因克隆、原核表达

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糠伊
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1 链球菌溶血素 O 的基因克隆原核表达及在胶乳增强透射比浊法测 ASO 试剂盒的开发应用摘要目的 : 以乙型溶血性链球菌 A 群菌株总 DNA 为模板, 通过 PCR 扩增得到链球菌溶血素 O (SLO) 基因片段, 与表达载体连接后转化大肠杆菌 BL21(DE3) 进行可溶性表达, 目的蛋白纯化后用于胶乳增强透射比浊法测 ASO 试剂盒的开发应用结果 :SDS-PAGE 分析表明 SLO 能够在大肠杆菌中进行可溶性表达, 纯化后的重组 SLO 蛋白纯度>95% Western Blot 检测显示重组 SLO 能与 ASO 高值血清有特异的免疫反应纯化后的重组 SLO 包被本公司生产的胶乳颗粒制成 ASO 胶乳增强透射比浊试剂盒, 并与市售同类试剂上 BeckmanAU480 自动生化分析仪做 41 份临床血清标本检测比对, 结果显示两者之间有良好的相关性结论 : 成功构建了稳定高效可溶性表达重组 SLO 蛋白的基因工程菌株, 工程菌表达的重组 SLO 能用于胶乳增强透射比浊法测 ASO 试剂盒的开发关键词 : 链球菌溶血素 O; 原核表达 ; 胶乳增强透射比浊 ;ASO 链球菌溶血素 O (SLO) 是由一种化脓性球菌分泌的蛋白, 它可刺激人体产生 SLO 抗体 (ASO) [1] SLO 属于 -SH 基激活的细菌性毒素之一, 对心脏有急性骤停作用 [2], 抗原性强,85%-95% 链球菌感染的患者, 感染后 2-3 周至病愈后数月甚至一年内均可检出 ASO, 临床上常测定 ASO 作为链球菌感染引起的扁桃体炎急性肾小球肾炎活动性风湿热风湿性心肌炎皮肤及软组织等的感染诊断和监控 [3,4] 因此 ASO 是临床检测的常规项目 ASO 体外诊断试剂盒的主要成分是 SLO 抗原, 利用基因工程技术构建稳定高效可溶性表达高活性 SLO 的工程菌便可以为试剂盒的研发大大节约成本本研究运用分子生物学技术克隆 SLO 蛋白的 DNA 编码序列, 采用大肠杆菌对其进行表达, 实现了 SLO 重组蛋白在大肠杆菌表达系统中的可溶性表达通过亲和层析和离子交换层析技术对重组蛋白进行纯化, 可得到纯度>95% 的目的蛋白, 然后将其用于胶乳增敏比浊法测定 ASO 试剂盒的开发, 并将自制试剂盒与市售试剂盒进行了初步的性能比对 1 实验材料 1.1 菌株质粒

2 溶血性链球菌为本实验室保存 ; 克隆载体 pmd-18t 购自 TaKara 公司, 表达载体 pet-gst 购自优宝生物 ; 克隆宿主 E.coli DH5ɑ 和表达宿主 E.coli BL21(DE3) 为本实验室保存 1.2 引物和测序引物合成与 DNA 测序由生工生物工程有限公司完成 1.3 主要酶和试剂 T4 DNA 连接酶,Taq DNA 聚合酶,DNA marker 及各种限制性内切酶购自 TaKaRa 公司质粒 DNA 小量抽提试剂盒和 PCR 纯化试剂盒购自生工生物工程 ( 上海 ) 有限公司氨苄青霉素和 IPTG 购自北京天根生化科技有限公司 1.4 培养基 LB 培养基 : 蛋白胨 10 g/l, 酵母膏 5 g/l, 氯化钠 10 g/l, 固体培养基含 15g/L 的琼脂, 固体和液体培养基在需要时加入氨苄青霉素至终浓度为 100ug/ml 2 实验方法 2.1 slo 基因片段引物设计根据 GenBank 查询的 slo 基因序列 (AB ), 截取基因片段设计引物, 并在 5 端分别引入 EcoR I 和 BamHI 酶切位点上游引物 P 1 :GAGCTCGGATCCTTGCTCCCAAAGAAATGCCA 下游引物 P 2 :GGGAGAGAATTCCTACTTATAAGTAATCGAACC ( 下划线部分为限制性内切酶位点识别序列 ) 2.2 链球菌总 DNA 提取链球菌总 DNA 提取方法参照文献 2.3 PCR 扩增 [5] PCR 反应体系 :10 PCR buffer 5μL,dNTP Mixture( 各 10mM) 2μL, 上游引物 (20μM) 1μL, 下游引物 (20μM)1μL, 链球菌总 DNA 50ng,Taq 酶 (5U/μL)1μL,ddH 2 O 补足 50μL 反应条件 : 预变性 94 3min,94 30s,55 30s,72 2min,30 个循环, 末次循环后继续 72 延伸 5min 扩增完毕后, 通过琼脂糖凝胶电泳观察扩增反应结果并纯化回收目的 DNA 片段 2.4 扩增产物 DNA 测序将目的基因片段与克隆质粒 pmd-18t 连接得到 pmd-18t-slo, 转化克隆宿主 E.coli DH5ɑ 阳性克隆送生工生物工程有限公司测序

3 2.5 重组质粒 pet-gst-slo 的构建及验证将测序结果正确的质粒用 EcoR I 和 BamHI 酶切, 回收目的片段, 目的片段与经相同双酶切处理的 pet-gst 质粒连接, 转化表达宿主 BL21(DE3) 阳性克隆经双酶切验证后用于融合蛋白的表达 2.6 融合蛋白的诱导表达接种 SLO 重组菌于 5ml 含 100μg/mL 氨苄青霉素的 LB 液体培养基中,37 220rpm 培养过夜培养至 OD 600 值达到 0.6 左右时, 加入终浓度为 1mmol/L 的 IPTG,30 220rpm 培养过夜, 离心收集菌体菌体经 PBS 缓冲液洗涤后重悬, 冰浴超声破碎细胞,13000rpm 4 离心 20min, 收集上清液, 得到蛋白粗提液 2.7 融合蛋白的纯化将蛋白初提液过 GST 亲和柱, 用含 10mM 谷胱甘肽的缓冲液洗脱并收集洗脱液 2.8 融合蛋白酶切和目的蛋白的纯化用凝血酶对纯化后的融合蛋白进行酶切, 然后将酶切液过 superdex-75 分筛柱, 收集第一洗脱峰 2.9 SDS-PAGE 检测用 SDS-PAGE 检测目的蛋白的表达情况和纯度以及初步确定其相对分子量, 具体的操作方法参考蛋白质技术手册 [6] 2.10 重组 SLO 蛋白的免疫印迹法 (Western blotting) 检测纯化后的蛋白经 SDS-PAGE 电泳分离后, 电转移至 PVDF 膜上, 在含 2% 的脱脂奶粉的封闭液中封闭非特异性结合位点, 加入 1:50 人 ASO 高值血清, 室温孵育 2h PBST 缓冲液洗涤 3 次, 用 1:20000 HRP 标记的羊抗人 IgG 多抗孵育 1h, 充分洗膜后用 ECL 法曝光, 胶片显影 2.11 重组 SLO 用于 ASO 胶乳增强透射比浊试剂盒的开发用本研究制备的重组 SLO 建立胶乳曾敏透射比浊法测定 ASO, 并对其分析性能与上海捷门生物科技合作公司的同类试剂盒进行比对和初步评价自建胶乳曾敏透射比浊法测 ASO 的分析参数方法 : 终点法, 主波长 :600nm, 反应温度 :37, 反应时间 :600s,R1 量 :200ul, R2 量 :50ul, 样本量 :3ul, 校准模式 :SPLINE 标准曲线的对比用自制试剂与比对试剂用相同的标准品做标准曲线, 标准品浓度为 : IU/mL

4 试剂 (ul) blank S1 S2 S3 S4 S5 PBS 样品 R 混匀,37 恒温 5min R 混匀,37 恒温孵育 20S, 空白调零, 测 600nm 吸光值 A1,5min 后测 600nm 吸光值 A2, A=A2-A1, 绘制标准曲线与临床试剂盒初步比对收集临床血清标本 41 份, 用自制试剂和市售试剂做检测比对试剂 (ul) Blank test PBS 3 - 样品 - 3 R 混匀,37 恒温 5min R 混匀,37 恒温孵育 20S, 空白调零, 测 600nm 吸光值 A1,5min 后测 600nm 吸光值 A2, A=A2-A1, 绘制标准曲线 3 结果 3.1 slo 基因的 PCR 扩增根据 2.1 所设计的引物, 以溶血性链球菌总 DNA 为模板, 按照 2.3 方法进行 SLO 基因片段的扩增, 在 0.8% 琼脂糖凝胶上对扩增产物进行电泳分析 ( 见图 1), 结果表明扩增的目的片段大小为 1500bp 左右, 与预期结果相符合

5 图 1 链球菌溶血素 O 基因 slo 的 PCR 扩增产物 Fig. 1 The PCR production of Streptococcus Streptolysin gene slo M:DNA marker; 1:PCR products of gene slo 3.2 扩增产物 DNA 测序扩增产物经测序与 NCBI 公布的序列比对表明, 扩增产物无碱基突变 SLO 基因全长为 1484 bp, 编码 494 个氨基酸 3.3 重组质粒 pet-gst-slo 的构建及验证用限制性内切酶 EcoR I 和 BamHI 双酶切 PCR 扩增得到的 SLO 基因片段和表达载体 pet-gst 质粒, 纯化处理后利用 T4 连接酶将二者连接起来, 构建重组质粒 pet-gst-slo 将重组质粒 pet-gst-slo 用限制性酶 EcoR I 和 BamHI 进行酶切后, 用 0.8% 琼脂糖凝胶进行电泳验证 ( 图 2) 结果表明重组质粒 pet-gst-slo 经限制性内切酶 EcoR I 和 BamHI 双切酶后, 呈现出两条不同大小的条带, 大小约为 1500bp, 与预期相符, 说明目的基因片段已与表达载体连接上

6 图 2 重组质粒 pet-gst-slo 的 EcoR I 和 BamHI 酶切验证 Fig.2 Recombinant plasmid pet-gst-slo digested with EcoRI 和 BamHI M:DNA marker; 1:The pet-gst-slo digestion by EcoRI/BamHI 3.4 表达产物的 SDS-PAGE 分析纯化以及 Western blot 检测分析表明, 重组表达质粒转化菌诱导表达了重组融合蛋白, 相对分子质量约为 86kDa, 大小与理论值相符, 为可溶性表达 ( 图 3(a)) 利用 GST 柱纯化后, 切掉标签蛋白 GST, 得到纯度较高的目的蛋白 ( 图 3(b)), 分子量约为 60kDa, 与理论值相符 Western blot 可检测到目的蛋白 ( 图 4) (a) (b) 图 3 SDS-PAGE 检测 pet-gst-slo 的表达和纯化 Fig.3 SDS-PAGE profile of expressed product and purified product (a):m:marker ;1:Products before induction;2:products after induction;3:the supernatant of BL21(DE3)-pET-GST-slo lysate after ultrasound;(b):m:marker;1:products after purification and concentration

图 4 Western blot 检测表达产物 Fig.4 Western blot of the expressed product 3.5 重组 SLO 用于 ASO 胶乳增强透射比浊试剂盒的开发 3.5.1 标准曲线的比对结果表 1 标准曲线数据表 Table 1 Data of standard curve S1 S2 S3 S4 S5 0.0 IU/ml 52.

7 图 4 Western blot 检测表达产物 Fig.4 Western blot of the expressed product 3.5 重组 SLO 用于 ASO 胶乳增强透射比浊试剂盒的开发标准曲线的比对结果表 1 标准曲线数据表 Table 1 Data of standard curve S1 S2 S3 S4 S5 0.0 IU/ml 52.5 IU/ml 105 IU/ml 210 IU/ml 420 IU/ml 比对试剂自研试剂 (a) (b) 图 5 比对试剂 (a) 与自研试剂 (b) 的标准曲线 Fig. 5 Standard curve of control reagent(a) and experimental reagent(b)

8 3.5.2 与临床试剂盒比对结果收集临床血清标本 41 份, 用自制试剂和市售试剂做检测比对, 结果显示两者之间有良好的相关性表 2 临床比对数据表 Table 2 Data of comparison clinical 标本号比对试剂检测值自研试剂检测值

9 图 5 比对试剂与自研试剂的对比曲线 Figure 5 Contrast curve of control reagent and experimental reagent

10 4 讨论链球菌溶血素 O( SLO) 是胆固醇结合细胞毒素 (cholesterol-bindingcytolysins) 大家族成员其 C- 端区域含有高度保守的伸展疏水氨基酸, 单一的半胱氨酸残基位于疏水区 SLO 的疏水 C- 端使分子具有两性特征,N 端 70 个残基 (1/8 的分子量 ) 可以被除去而不损害其有效作用, 因此 N 端区域对于孔道形成功能是多余的抗链球菌溶血素 O(ASO) 是 SLO 的特异性抗体,ASO 主要用于链球菌感染引起的扁桃体炎急性肾小球肾炎活动性风湿热风湿性心肌炎皮肤及软组织等的感染诊断和监控 SLO 是制备 ASO 试剂的主要原料, 制备 SLO 的方法有天然培养和重组表达两种天然培养是通过大规模培养乙型溶血性链球菌 A 群菌株, 获得其代谢产物后通过复杂的盐析技术离子交换层析技术和分子筛层析技术分进行纯化要获得高纯度的 SLO 难度很大, 该方法最大的优点是得到的 SLO 为天然结构, 但该法操作复杂危险和产量低原核表达系统是目前制备重组蛋白最广泛和经济的方法, 其优势在于表达基因明确, 在普通培养基中生长迅速, 易于大规模培养目的蛋白表达时可以和标签蛋白融合表达, 因此可以进行高效率的亲和纯化, 一步操作即可达到很高的纯度但原核表达有一个弊端, 大肠杆菌在大量表达外源蛋白时很容易形成包涵体, 即不溶性表达, 这样会对重组蛋白的使用造成很大的麻烦, 本研究通过大量的表达载体和表达菌株的筛选实验, 发现采用 pet-gst 质粒和 BL21(DE3) 组合时, 可以实现目的蛋白高效的可溶性表达, 且表达蛋白具有良好的免疫反应活性抗链球菌溶血素 O(ASO) 是临床检验的常规项目, 目前常用的检测方法有溶血抑制法胶乳凝集法酶联免疫法胶乳增强免疫透射比浊法和胶乳增强免疫散射比浊法胶乳增强免疫透射比浊法和胶乳增强免疫散射比浊法试剂比较稳定灵敏, 操作可自动化, 使用越来越广泛 [8] 胶乳增强免疫透射比浊法( PETIA )ASO 试剂盒采用了胶乳增强技术, 将 SLO 抗原结合在大小均一的胶乳离子上, 大大增加了试剂盒检测的灵敏度和稳定性因此本研究拟用自制重组 SLO 建立 PETIA 法测定 ASO, 并对其与上海捷门生物科技合作公司的 ASO 检测试剂盒进行初步对比评价经初步的方法学评价, 用自制试剂和市售试剂做 41 份临床血清标本检测比对, 结果显示两者之间有良好的相关性, 证明所建立的 ASO 试剂盒可以应用但是, 自制试剂盒要用于临床还需进一步优化 [7] 参考文献

11 [1] Halbert, S. P Streptolysin O, p In T. C. Montie, S. Dakis, and S. J. Ajl (ed.), Microbial toxins, vol. 3. Academic Press, Inc., New York, N.Y. [2] 陆得源主编 1 医学微生物学, 第三版. 北京人民卫生出版社,P [3] 冯树异, 程松高, 于修平. 医学微生物学 [M]. 北京, 北京医科大学, 中国协和医科大学联合出版社,1999, [4] 张淑琼, 王凡. 奥林巴斯 AU5400 检测血清抗链球菌溶血素 O 的测量范围评价. 检验医学与临床,2012, 11(7):929. [5] Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual[m]. 3nd Revised edition. New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001: [6] 汪家政, 范明. 蛋白质技术手册 [M]. 北京 : 科学出版社, 2000: [7] 陈希, 索占伟, 许剑琴等. 细菌溶血素的分类及代表性溶血素研究进展. 中国农学通报,2008,24(8)19. [8] 蒋新良. 免疫透射比浊法抗链球菌溶血素 O 试剂盒的评价. 检验医学,2005, 2(4):358.

12 The prokaryotic expression of Recombinant Streptolysin-O(SLO) and its application in particle enhanced turbidimetric immunoassay Kit of ASO SHEN Chao YANG Yan-hua XIAO Jia-min TENG Kun LIU Hong-ping (Guilin Immunetech Co Ltd,GIMT Guilin ,China) Abstract Objective: To obtain the Streptolysin-O(SLO) gene fragment by PCR amplification with the total DNA in group-a ß-hemolytic streptococcus strains as template, which is inserted into pet-gst vector, the recombinant plasmid was transformed into BL21(DE3) for soluble expression. The purified protein is for the development and application of particle enhanced turbidimetric immunossay Kit of ASO. Results: SDS-PAGE showed that SLO was soluble expressed in E.coli, and the purity of the purified recombinant SLO protein is greater than 95%. The results of Western blot assay indicated that the recombinant SLO can specific immune response with the high values of serum ASO. Purified recombinant SLO coated latex produced by our company is made of particle enhanced turbidimetric immunossay Kit of ASO, compared the results of the 41 clinical serum samples test with the similar reagent on sale by Beckman coulter AU480, the results showed a good correlation between the two. Conclusion: The recombinant expression engineering bacteria BL21(DE3)-pET-GST-slo was constructed and the purified SLO protein could be suitable for particle enhanced turbidimetric immunossay Kit of ASO. Key words Streptolysin-O prokaryotic expression particle enhanced turbidimetric immunoassay ASO

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