! 李 娟等 重组 -.#0/ 对表达不同 -. 变体的细胞系细胞活性的影响 # - 和 # - 亚型 无插入的为 -.2' '2 亚型 $ 此外 还有多个不同剪切的变体被发现与克隆 分子量从 到 " 不等 (#! -. 的不同剪接变体具有组织特异 & 性分布 可介导多种不同

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1 中国生物工程杂志! " 重组 对表达不同 变体的 细胞系细胞活性的影响 李 娟 余榕捷 王静静 黄 霖 刘晓飞 暨南大学生物工程研究所 广州 (! 摘要 垂体腺苷酸环化酶激活多肽 ) ' * + #, ) ) )* -..- 特异受体 -.' 型 / 端胞外域 简称 -.#0 / 具有调控 -. 活性的作用 为研究 -.#0/ 对表达不同 -. 变体的细胞系活性的影响 利用基因工程技术获得 端带有! 个 + 纯化标签的重组 -.#0/ 质谱检测 1 1#-. 0 电泳和 + ' 检测结果均显示成功表达和纯化目的蛋白 -.#0/ + ' 检测确定兔眼角膜基质细胞 人神经母细胞瘤细胞 1 #1 ( 人前列腺癌细胞 23 中分别表达一个或多个分子量不同的 -. 变体 重组 -.#0/ 作用株细胞 455 方法检测细胞活性 结果显示 -.#0/ 有效促进只表达一个小分子 -. 变体的兔眼角膜基质细胞的增殖 但显著抑制只表达一个大分子 -. 变体的人神经母细胞瘤细胞 1 #1 ( 的活性 对于表达种大小不一的 -. 变体的人前列腺癌细胞 23-.#0/ 对细胞的活性具有复杂的调控 显示 -.#0/ 对表达 -. 变体数量不同 类型不同的细胞具有不同的生物活性的作用 提示了 -. 变体可能具有较复杂的自我调控机制 关键词 重组 -.#0/ 胞外端 细胞系 生物活性中图分类号 6"% -..- ) ' * +, ) ) )* 是由脑垂体分泌的或目的组织自分泌和旁分泌的 具有重要生物学功能的神经多肽 是促胰液素 7 胰高血糖素 7 血管活性肠肽 38- 家族中的新成员 -..- 在进化过程及种属间具有高度的保守形式 鼠源 -..- 与人和兔的同源性达到 具有个受体 -. 作为 -..- 的特异受体 在种属的进化过程中保守性极高 人 鼠与兔的 -. 同源性达到 %%9 $ 3-. 和 3-. 是 -..- 和 38- 的共同受体 其中 -. 受体主要分布于中枢神经系统 周围神经系统以及睾丸 卵巢 呼吸道 肺 胰腺等非神经组织内等 ( 目前已证实由 -. 介导的收稿日期 # # 修回日期 #$# 国家自然科学基金 %& $$ 广东省科技攻关项目! 重点高校研究基金!%&!!%$& 资助项目 通讯作者 电子信箱 '! -..- 生物学功能有 神经递质 7 调质 保护神经细胞! 神经损伤修复 调节血管 & 促进激素分泌 调节内分泌平衡 " 调节性腺功能和生殖细胞的产生 % 参与消化活动 调节能量代谢平衡 %# 参与调节免疫系统 与学习和记忆有关 与某些心理感受有关 与动物的生物钟有关等 & 鉴于 -. 介导了 -..- 的多种生物学功能 因此 -. 成为具有研究意义的药用靶点 -. 基因包括 " 个外显子 不同的剪接可以形成不同的 -. 的变体 目前发现 在 / 端胞外域 :'+ ;' ' 0 可以有种剪接方式 没有缺失的 ' 型 / 缺失 "% % 个氨基酸的 +' 1 型和缺失 ( % # 个氨基酸的, ' +' 31 型 在胞内区 ' '' 8 则还可以有分别插入 # - 和 8-# - 盒 + 可产生

2 ! 李 娟等 重组 -.#0/ 对表达不同 -. 变体的细胞系细胞活性的影响 # - 和 # - 亚型 无插入的为 -.2' '2 亚型 $ 此外 还有多个不同剪切的变体被发现与克隆 分子量从 到 " 不等 (#! -. 的不同剪接变体具有组织特异 & 性分布 可介导多种不同的生物学功能 我们近期研究显示 -. ' 型 受体的 0 的胞外区 命名为 -.#0 / 具有促进特异表达 -./72 变体的 细胞增殖的活性 " 本研究旨在利用基因工程的原理和方法在获得重组 -.# 0 / 的基础上 探索 -.#0 / 对表达不同 -. 变体的细胞系的生物学作用 结果显示 -.# 0/ 对表达不同 -. 变体的细胞系的活性影响不一样 提示 -. 变体具有较复杂的自我活性调控机制 其 / 端胞外域 0 参与了其自我活性的调控 材料与方法 材 料 细菌菌株和质粒载体等 菌株 +' 02 (!! 和质粒 ) 均购自美国 / 0 * + /0 公司 菌株 ( 为本实验室保存 引物由 8,' 公司合成 酶及其它试剂 限制酶 5< 酶和 5$ /. 连接酶购自大连 5 2 公司 -2 - ': 0;' 和 - + * 4)' ) 购自 68. 0/ 公司 8-5 为 -' 产品 镍柱购自美国 0 公司 针对 -..- 受体 / 端胞外域! ( 个氨基酸的多克隆抗体一抗 2- 标记的二抗购自美国 1./5.2=> 公司 # 抗体 一抗 购自美国 1 公司 实验细胞 人神经母细胞瘤细胞 1 #1 ( 购自国家实验细胞资源共享平台 北京细胞中心 人前列腺癌细胞 23 细胞购自上海细胞中心 兔眼角质细胞由本实验室原代分离 -. /72# 细胞本实验室构建并保存 方 法 表达质粒的构建与鉴定 为获得 端连接! 个组氨酸纯化标签的重组蛋白 -.#0 / 以小鼠来源 -./72 变体基因为模板 ? 为 酶切位点 5. 为 酶切 位点 扩增编码 -.#0 / 基因 -2 反应产物通过 和 双酶切 克隆到质粒 ) 的 和 位点间 构建重组质粒 ) #-.#0 / 用 -2 对重组子进行初步鉴定 然后用基因测序验证阳性克隆 -.#0 / 的诱导表达 将重组质粒 ) #-.#0 / 转化到表达宿主菌 +' 02 (!! 构建表达工程菌 ) #-.#0 /# 02 (!! $ 7B8-5 诱导 -.#0 / 可溶性表达 收集菌体 超声破碎 离心收集上清 -.#0 / 的纯化和鉴定 采用 +5')?? ' * 预装柱对目的蛋白按操作手册进行纯化用 的结合缓冲液 7B 磷酸钠 ( 7B 氯化钠 7B 咪唑 ) & $ 平衡柱子 以 7 的速度破碎上清 用 的洗柱缓冲液 7B 磷酸钠 ( 7B 氯化钠 " 7B 咪唑 ) & $ 以 7 的流速洗去杂蛋白 用 的洗脱缓冲液 7B 磷酸钠 ( 7B 氯化钠 ( 7B 咪唑 ) & $ 以 7 的流速洗下目的蛋白 分管收集 每 为一管 $ C 透析过夜除去咪唑 9 的 1 1#-. 0 对目的蛋白的表达和目的蛋白的纯度进行鉴定 将目的蛋白冻干后送北京军事医学科学院进行激光飞行质谱检测 测定其分子量 + ' 检测目的蛋白的免疫源性 $ 不同细胞系 -. 变体的 + ' 检测 培养细胞获得 D! 个细胞 " 28-. 裂解液加 " -41? 7B 裂解 制成蛋白样 1 1#-. 0 电转至 -3? 膜上 E 的稀释度孵育 -..- 受体 / 端胞外域! ( 个氨基酸的多克隆抗体一抗 $ C 过夜 E 稀释孵育辣根过氧化酶 2- 标记的二抗 室温孵育 加入发光试剂暗室曝光 (455 检测不同细胞系的活性 收集对数期细胞 调整细胞悬液浓度 接种到 %! 孔板 使细胞的密度约 个细胞 7 孔 含 9?1 的!$ 培养基 (9 & C 培养至细胞密度到 (9!9 换成含 (9?1 的!$ 培养基 饥饿培养 加入梯度浓度的目的蛋白 每孔 每个浓度设置! 个复孔 (9 & C 培养 * 小心吸干孔内培养液 每孔加入 ( 455 溶液 ( 7 孵育 $ 终止反应 每孔加 普通异丙醇 & C 孵育 低速振荡 酶标仪使用波长 (& 测定各孔光吸收值 设置无细胞孔为对照孔! 统计学检验 所有数据采用 1-11 统计学

3 $ 中国生物工程杂志 3 /! 软件分析 进行 检验 数据用均数 标准差 表示 结 果 重组表达载体 的鉴定按 节扩增 -.#0 / 基因 大小为 ( ) 左右 构建重组表达质粒 ) #-.#0 / 用菌落 -2 的方法对重组质粒进行初步鉴定 再以 5& 启动子为测序引物 5&, '+ -' ' (@# #@ 进行测序鉴定 结果显示 -.#0/ 基因成功克隆到 ) 的 与 位点间 图 图 重组表达质粒 的测序鉴定!"#!$%$ &!'# #'$ & (!&)''!"#!$%$ &(!& 工程菌的检测及 的纯化与鉴定如图 所示 8-5 诱导 -.#0 / 可溶性表达 破碎上清过镍柱 大部分融合蛋白能被镍柱填料中的 / 捕获 洗柱后 洗脱液洗脱目的蛋白 目的蛋白主要存在于第 管中 (9 1 1#-. 0 电泳和 + ' 检测蛋白的免疫源性 图 的结果均显示成功纯化目的蛋白 -.#0 / 蛋白透析后冻干 冻干粉送北京军事医学科学院进行激光飞行质谱检测 分子量为! % 图 与理论值相符 图 重组 的激光飞行质谱鉴定图 )'!& 0 ) ''!% & (! & &!% (/$)$ 不同细胞系表达 变体的.!'!&$/ 结果对兔眼角膜基质细胞 人神经母细胞瘤细胞 1 # 1 ( 人前列腺癌细胞 23-. /72# 细胞的 -. 变体的表达进行 + ' 检测 结果显示 图 $ 不同的细胞系表达的 -. 变体的类型不同 兔眼角膜基质细胞表达的 -. 变体只有一种 大小在 图 蛋白表达与纯化 *+, - 电泳 ) 和.!'!&$/ 结果 /,-*+!!!% & 0 &!'') )$1.!'!&$/ / )$) '' #&!1 4 -' ' ' ' * ;' : '* * 8-5 :'$ C ' * ;' : ' 8-5 * -' ) : + $ ': * ;' : + ( /#/5. : '!/#/5. +& 0 * -.#0 / - ': * -.#0 / )' * * + * '+ * + *+! ( )) * /# ' ;' '* : + -. 左右 人神经母细胞瘤细胞 1 #1 ( 表达的 -. 变体也只有一种 但分子量在 " 左右 人前列腺癌细胞 23 表达的 -. 变体有种 分子量分别大约为 " & 和 $ -. /72# 细胞作为阳性对照特异性表达大小为 ( -./72 变体 重组 对兔眼角膜基质细胞的作用在兔眼角膜基质细胞加入梯度浓度的 -.#0 / 455 结果显示 所检测浓度范围的 -.#0 / 对兔眼角膜基质细胞均有明显的促进细胞增殖的

4 ! 李 娟等 重组 -.#0/ 对表达不同 -. 变体的细胞系细胞活性的影响 ( 图 不同细胞系.!'!&$/ 结果.!'!&$/ )$) '' 1!&!$ %! '. ' + +1 #1 ( 2 ' +' + )'+ ' 23 -.# + 作用 随着浓度的增加 促进增殖作用增强 7B 达到最大促进增殖作用 浓度超过 7B 时增殖作用有所减弱 图 ( 图 3 人神经母细胞瘤细胞 2 * 的 检测结果 3 )/ 2 * %! ')' (!)'#&!1/ ) ') 5 * ' )' + * * :' +; * ) * ;) ' +,+ ' 3 重组 蛋白对人前列腺癌细胞 4 的作用按照 & 节中的实验方法 在人前列腺癌细胞 23 中加入梯度浓度的 -.#0 /455 结果显示 所有检测浓度的 -.#0/ 均抑制 23 细胞的活性 但随着浓度增加 抑制作用先减弱 再增强 7B-.#0 / 显著抑制 23 细胞的活性 在 7B 浓度范围内 抑制增殖作用随浓度增加而减弱 7B 的抑制作用显著弱于 7B ( 7B-.#0 /,+ 7B-.#0/ 在大于 7B 浓度范围 抑制增殖作用随浓度增加而加强 图 & 图 * 兔眼角膜基质细胞的 检测结果 * )/ &)// % &$!) ' & () %! ' )'(!)'#&!1/ ) ') 5 * ' )' + * * :' +; * ) * ;) ' + (,+ ',+ ' * 重组 蛋白对人神经母细胞瘤细胞 2 * 的作用梯度浓度的 -.#0 / 作用人神经母细胞瘤细胞 1 #1 ( 455 结果显示 -.#0 / 对 1 # 1 ( 均具有显著抑制作用 随着 -.#0 / 浓度的增加抑制作用逐渐增加 7B 的抑制作用最强 图! 图 人前列腺癌细胞 4 的 检测结果 )/ 4 %! ')'(!)'#&!1/ ) ') 5 * ' )' + * * :' +; * ) * ;) ' +,+ ' ( 7B-.#0/,+ 7B-.#0/

5 ! 中国生物工程杂志 3 /! 讨 论 -. 是属于 蛋白偶联受体 家族 此类受体的显著特点是具有较长的 / 端用于配体的结合和激活! 我们近期的研究发现 -. 的 / 端胞外域不仅发挥 -. 配体识别和筛选中的重要作用 而且可以激活 -./72 变体 从而促进特定表达 -. /72 变体的 细胞的增殖 从序列分析发现 -.#0 / 的 / 端与 -..- 的 / 端具有高度的同源性 & 而 -..- 去掉前 ( 个氨基酸 1 8 可以形成 -. 受体的抑制剂 "#% 与 -..- 具有相似 / 端的 -.# 0/ 能够激活 -. 说明 -. 的 / 端参与了 -. 的活性调控 现在另一个 类 蛋白偶联受体分泌素受体 + ' ' )' 中也发现了相似的现象 为研究 -.#0/ 对表达不同 -. 变体的细胞的影响 首先利用基因工程的原理和技术 实现了 -. 的 / 端胞外域的高效制备 本研究利用目的蛋白 端的! 个 + 标签纯化 -.#0/ 我们已有实验显示 此重组 -.#0 / 可有效结合 -. 受体的配体 包括 -. 特异激动剂 4. 拮抗剂 4!( 及 38-! 利用这个系统可以实现 -. 的 / 端胞外域的大规模制备 不仅为后续细胞实验奠定基础 而且可以用于高通量筛选与 -. 受体结合的配体 由于 -..- 和 -. 的序列在进化过程中都存在高度的保守性 种属间保守性极高 人 鼠 兔三者间 -..- 同源性达 9-. 同源性达 %%9 #$ 因此本研究用鼠源的 -. 胞外域 -.#0 / 作用于兔和人的表达 -. 变体细胞 结果具有可参考性 本研究中涉及的兔眼角膜基质细胞 人神经母细胞瘤细胞 1 #1 ( 人前列腺癌细胞 23 都有不同的 -. 变体的表达谱 兔眼角膜基质细胞只表达一种在 左右的 -. 变体 人神经母细胞瘤细胞 1 # 1 ( 表达的 -. 变体也只有一种分子量在 " 左右 人前列腺癌细胞 23 表达的 -. 变体有种 分子量分别大约为 " & 和 $ 本研究发现 -.#0 / 对单独表达小分子 -. 变体 的兔眼角膜基质细胞具有显著促进其细胞活性的作用 而且随着 -.#0 / 浓度的增大促进作用逐渐增强 对于单独表达大分子 -. 变体 " 的人神经母细胞瘤细胞 1 #1 ( -.#0 / 具有显著抑制其细胞活性的作用 随着 -.#0 / 浓度的增大抑制作用逐渐增强 对于表达复杂变体 既有小分子也有大分子的人前列腺癌细胞 23 其作用较复杂 低浓度显著抑制 但随浓度增加 抑制减弱 超 7B 后 抑制增加 这些结果显示 -.# 0 对不同 -. 变体作用截然不同 这提示 -.# 0 可能通过多个途径发挥作用 这些调控途径可能有 由于 -.#0 / 可以与天然 -..- 结合 不排除 -.#0 / 通过调节细胞自分泌的自由的 -..- 浓度发挥调控细胞活性的作用 已有报道证实不同变体被激活后的信号途径不同 引起的细胞反应不同 例如在神经细胞中 激活 -. - 变体是促进细胞增殖 而激活 -. 1 变体则抑制细胞活性 这可能造成 -.#0/ 对表达不同变体的细胞作用相反的主要原因 -.#0 / 具有激活 -. 变体的功能 但其结合与激活不同变体 尤其在胞外域剪切不同所产生的变体 对效率不尽相同 如果多个变体同时存在 就可能发生在一定浓度范围内的效应叠加或效应抵消 $ 对于 蛋白偶联受体 -.#0/ 作为受体胞外域不仅参与受体与配体结合及受体激活 还可能参与受体二聚化 寡聚化及受体 内转等行为 影响受体的命运 以上可能的作用途径仍需进一步研究确定 本研究首次发现 -.#0 / 能够对表达不同 -. 变体的细胞的细胞活性产生不同的作用 而且不同浓度的 -.#0 / 对同一种细胞的细胞活性产生的作用也不同 提示了 -. 变体可能具有复杂的自我调控机制 而且其 / 端胞外域参与了 -. 的自我调控 参考文献 4..' ' :, " ' +* # ) ) ) )* + + * + ) ' + ) +2 + %"%!$ (!&#(&$.' '. - ' * +, ) ) )* -..- *+, ' * ' + +:' + ' 2 - ) %% & "(# - ' - +. ', +) /# ' ;' '* : ) ' * + #, ) ) )* -..- ' )' * + ' )'+, * ', ) +:-..-# & * -..-#" )+) )+, %%! &! $!# (

6 ! 李 娟等 重组 -.#0/ 对表达不同 -. 变体的细胞系细胞活性的影响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易天红 洪岸 谢珊珊 等 重组 4;* 的制备与鉴定 生物工程学报 " $ $%# (( ' : " $ $%# (( 4 ' 5 : +:-..- ' )' : ' 2 ' - )* +! &# (#(& B ' 4, )' # ) * ' )'+:'38-* -..-1' ' * +:, * )' - )* + & "%! #! %

7 " 中国生物工程杂志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