1658 水产学报 40 卷表达, 并对重组 IGF-I-pS 蛋白进行了生物学活性分析, 以期为深入解析 IGF-I 在哲罗鲑生长发育中的调控机制及绿色高效促生长制剂的研发奠定基础 1 材料与方法 1.1 材料实验用哲罗鲑 ( 每尾平均体质量 10 g) 采自中国水产科学院黑龙江水产研究所渤海冷

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矮赫
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1 第 40 卷第 11 期水产学报 Vol. 40, No 年 11 月 JOURNAL OF FISHERIES OF CHINA Nov., 2016 文章编号 : (2016) DOI: /jfc 哲罗鲑胰岛素样生长因子 -I 的原核表达及活性鉴定王晓玉 1,2, 徐黎明 1, 刘淼 1, 赵景壮 1, 卢彤岩 1, 曹永生 1 1 *, 尹家胜 (1. 中国水产科学研究院黑龙江水产研究所, 黑龙江哈尔滨 ; 2. 上海海洋大学水产与生命学院, 上海 ) 摘要 : 为进一步了解哲罗鲑 IGF-I, 实验采用逆转录聚合酶链式反应 (RT-PCR) 方法, 从哲罗鲑肝脏的总 RNA 中扩增出胰岛素样生长因子 -I(IGF-I) 的 cdna 开放阅读框 (open reading frame, ORF) 序列利用原核表达载体 ps 构建重组表达质粒 (IGF-I/pS), 并将其转化到宿主大肠杆菌 Rosetta 后经 IPTG 诱导获得重组哲罗鲑 IGF-I 蛋白经 SDS-PAGE 电泳检测, 在 35~50 ku 有条带与预期相符, 且重组蛋白以包涵体的形式存在包涵体经变性 / 复性实验后, 获得纯化的 IGF-I 融合蛋白 ELISA 鉴定结果显示, 目的蛋白能特异性识别抗鱼类 IGF-I 抗体, 表明获得了具有免疫活性的哲罗鲑 IGF-I 蛋白细胞增殖实验 (MTT 法 ) 结果显示, 重组 IGF-I 蛋白对大麻哈鱼胚胎细胞 (CHSE-214) 鲤上皮细胞(EPC) 及虹鳟性腺细胞 (RTG-2) 均有显著促增殖作用, 表明获得的重组 IGF-I 蛋白具有细胞水平的生物活性本研究为深入了解 IGF-I 在哲罗鲑生长发育中的调控机制及绿色高效促生长制剂的研发奠定基础关键词 : 哲罗鲑 ; 胰岛素样生长因子 -I; 原核表达 ; 生物活性中图分类号 : Q 785;S 文献标志码 : A 鱼类胰岛素样生长因子 (insulin-like growth factors, IGFs) 是一类具有胰岛素样代谢和促进有丝分裂功能的多肽,IGF-I 选择性地与 IGF-I R (IGF-I receptor) 结合, 通过促进细胞分裂分化和已知凋亡来调节生长分化和繁殖等生理过程 [1] 胰岛素样生长因子包括 IGF-I IGF-II 以及 [2] 近年来 Wang 等研究罗非鱼发现的新成员 IGF- III, 其中 IGF-I 是生长激素 (GH) 发挥生物学功能的重要传导因子 [3-4], 鲑鳟鱼类的肝脏 IGF-I mrna 和血液中的 IGF-I 的含量明显与幼鱼的生长速率有关对鱼类的 IGF-I 进行深入研究, 在鱼类的育种及养殖管理等方面都具有重要的指导作用但从鱼类的血浆或组织中直接提取天然的 IGF-I 具有一定的困难, 从而限制了对鱼类 IGF-I 功能和作用的深入研究, 因此获得足够的重组 IGF-I 对鱼类生理生殖作用的研究具有重要意义哲罗鲑 (Hucho taimen) 又称哲罗鱼, 属鲑形目 (Samoniformes) 鲑科(Salmonidae) 哲罗鱼属 (Hucho), 是我国名贵的冷水性鱼类, 具有较高的经济价值 [5], 其属肉食性凶猛鱼类, 具有明显的季节性洄游, 主要分布于俄罗斯蒙古哈萨克斯坦和中国的额尔齐斯河乌苏里江喀纳斯湖等近些年由于受到过度捕捞环境污染等因素的影响, 哲罗鲑资源逐渐下降, 并已被列入中国濒临保护动物 [6-7], 但近年来, 我国关于哲罗鲑人工繁殖技术的研究也逐渐有了进展 [8-9] 本实验克隆了哲罗鲑 IGF-I 基因片段, 利用原核表达载体 ps 构建 IGF-I 重组表达质粒 (IGF- I/pS), 实现了哲罗鲑 IGF-I 重组蛋白的体外高效收稿日期 : 修回日期 : 资助项目 : 国家科技支撑计划 (2012BAD25B10); 公益性行业 ( 农业 ) 科研专项 ( ) 通信作者 : 尹家胜, xwsc20@tom.com

2 1658 水产学报 40 卷表达, 并对重组 IGF-I-pS 蛋白进行了生物学活性分析, 以期为深入解析 IGF-I 在哲罗鲑生长发育中的调控机制及绿色高效促生长制剂的研发奠定基础 1 材料与方法 1.1 材料实验用哲罗鲑 ( 每尾平均体质量 10 g) 采自中国水产科学院黑龙江水产研究所渤海冷水鱼试验站一步法 RT-PCR 试剂盒 rtaq 酶 pmd18-t simple Vector 及限制性内切酶均为宝生物公司产品 ;DNA 纯化试剂盒及 RNA 提取试剂盒购自 Promega 公司 ; 质粒提试剂盒购自 Axygen 公司 ; 表达载体 ps 由东北农业大学制药教研室李德山教授惠赠 ; 克隆用菌株大肠杆菌 (Escherichia coli ) DH5α 和表达用菌株 E. coli Rosetta 在本实验室保存 ; 鱼胰岛素样生长因子 -I(IGF-I)ELISA 试剂盒购自上海常斤生物科技有限公司 ;MEM (minimum essential medium) 细胞培养基胰蛋白酶胎牛血清均购自 Hyclone 公司 ; 噻唑蓝 (MTT) 购自 Sigma; 鲤上皮细胞 (EPC) 大麻哈鱼胚胎细胞 (CHSE-214) 和虹鳟性腺细胞 (RTG-2) 由中国水产科学研究院长江水产研究所鱼类病害研究室曾令兵教授惠赠 1.2 引物设计与合成对 GenBank 收录的多条鲑鳟类 IGF-I 基因开放阅读框序列进行比对, 然后选择北极红点鲑的 IGF-I 基因开放阅读框序列 (NCBI 登录号为 GU ) 为模板, 利用 Primer 5.0 设计用于扩增哲罗鲑 ORF 序列的引物 P-F 和 P-R, 根据 ps 载体上多克隆位点的排列特点, 分别在上下游引物的 5' 端添加了 Bsa I 和 BamH I 酶切位点 ( 酶切位点见下划线标识 ) P-F:5'GGTCTCATGGAAA CCCAGAAAAGACACGAAT3', P-R:5'GGAT CCTCAATTGTGGCTGACGTAGTTGTCC 3', 退火温度为 55 C 1.3 IGF-I 基因的克隆根据 RNA 提取试剂盒 (Promega 公司 ) 的方法提取哲罗鲑肝脏总 RNA, 并用 1% 琼脂糖凝胶电泳检测其质量和浓度依据 RT-PCR 试剂盒 (TaKaRa) 的方法对获得的 RNA 进行 RT-PCR 一步反应扩增 IGF-I 基因将 PCR 扩增产物用 1% 琼脂糖凝胶电泳进行检测, 并切胶回收, 连接 pmd18-t simple Vector 构建重组质粒将重组质粒转化至 E.coli DH5α 感受态细胞中, 经 LB 平板倒置培养后, 挑取单菌落培养并进行 PCR 鉴定选择阳性克隆送哈尔滨博仕生物技术有限公司测序 1.4 IGF-I/pS 重组表达质粒的构建使用限制性内切酶 Bsa I 和 BamH I 对表达载体 ps 及鉴定正确的重组质粒 IGF-I/pMD18-T 进行双酶切, 再用 T4 DNA 连接酶将具有相同粘性末端的两基因片段连接, 获得重组表达质粒 IGF- I/pS, 转化至 E. coli DH5α 中, 提质粒进行 PCR 和酶切鉴定, 鉴定正确的送哈尔滨博仕生物技术有限公司测序 1.5 重组 IGF-I 蛋白的表达将测序结果正确的重组质粒 IGF-I/pS 转化至表达菌株 E.coli Rosetta 中, 挑取单菌落进行菌液 PCR 鉴定, 将鉴定结果正确的接种于含 Amp 的 10 ml LB 液体培养基中,37 C 摇床培养过夜次日按比例接种于含 Amp 的 500 ml LB 液体培养基中扩大培养至 OD 600 值为 0.6 左右, 加入 125 μl 浓度为 1 mmol/l 的 IPTG 进行 IGF-I 蛋白的诱导表达, 分别在 h 时取样,4 C r/min 离心 10 min 收菌,PBS 洗涤重悬沉淀加入溶菌酶 ( 至终浓度为 1 mg/ml) 后 4 C 作用 1 h 80 C 放置过夜次日将菌体冻融后在冰浴中超声破碎, 破碎后产物 4 C r/min 离心 10 min, 分别取上清和沉淀, 进行 SDS-PAGE 电泳检测, 以确定蛋白形式及最佳诱导时间 1.6 重组 IGF-I 蛋白的纯化蛋白表达为包涵体形式, 则需进行包涵体纯化菌体超声破碎后的沉淀即为包涵体, 用复性液 ( 尿素 Tris-buffer 丙酮巯基乙醇甘氨酸氧化型谷胱甘肽还原型谷胱甘肽 ) 洗涤 2~3 次, 洗涤后的包涵体溶于变性液 ( 尿素 Tris- HCl 磷酸二氢钠 ) 中,4 C 过夜向变性产物中逐滴加入 10 倍体积的复性液, 置于 4 C 冰箱 12 h 后, 用 PBS 溶液 (ph 8.0) 于 4 C 冰箱中透析 12 h 透析后的溶液于 4 C r/min 离心 10 min, 取上清, 并进行 SDS-PAGE 电泳检测 1.7 IGF-I 蛋白免疫学检测利用鱼胰岛素样生长因子 -I ELISA 试剂盒

11 期王晓玉, 等 : 哲罗鲑胰岛素样生长因子 -I 的原核表达及活性鉴定 1659 ( 上海常斤生物科技有限公司 ) 对 IGF-I 蛋白进行免疫学检测分别按 48 24 12 6 3 μg/l 的浓度梯度, 对 IGF-I 蛋白进行稀释后, 按照 ELISA 试剂盒的说明书进行操作 : 设置空白对照组, 在酶标包被板待测样品孔中加入 50 μl 稀释后的 IGF- I 蛋白,37 C

3 11 期王晓玉, 等 : 哲罗鲑胰岛素样生长因子 -I 的原核表达及活性鉴定 1659 ( 上海常斤生物科技有限公司 ) 对 IGF-I 蛋白进行免疫学检测分别按 μg/l 的浓度梯度, 对 IGF-I 蛋白进行稀释后, 按照 ELISA 试剂盒的说明书进行操作 : 设置空白对照组, 在酶标包被板待测样品孔中加入 50 μl 稀释后的 IGF- I 蛋白,37 C 温育 30 min, 洗涤液洗涤 5 次每孔加入酶标试剂 50 μl,37 C 孵育 30 min 后, 洗涤 5 次然后每孔加入显色剂 A 50 μl, 再加显色剂 B 50 μl, 轻轻震荡混匀,37 C 避光显色 15 min, 最后每孔加入终止液 50 μl 终止反应在 15 min 以内用酶标仪检测结果 1.8 IGF-I 蛋白生物活性检测使用 MTT 法检测 IGF-I 蛋白的生物活性实验前测量 IGF-I 蛋白浓度并进行无菌过滤, 按 IGF-I 蛋白浓度为 0( 对照组 ) μg/ml 分为 8 组, 每组 6 个重复取生长状态良好的 EPC CHSE-214 和 RTG-2 细胞, 以个 /ml 每孔接种 100 μl 于 96 孔板中,CO 2 培养箱中培养过夜使细胞贴壁, 次日加入不同浓度梯度的 IGF-I 蛋白, 对照组加入等体积的无菌 PBS 继续培养 24~48 h 后, 每孔加入 20 μl MTT (5 mg/ml), 孵育 4 h, 小心吸去上清, 每孔加入 100 μl 二甲基亚砜 (DMSO),37 C 摇床低速震荡 10 min, 酶标仪检测 490 nm 处的吸光值实验数据运用 SPSS 13.0 软件进行分析 2 结果 2.1 IGF-I 基因的克隆哲罗鲑肝脏总 RNA 经过 RT-PCR 扩增, 产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳检测分析, 发现在 500~750 bp 之间有一明显条带, 与预期的目的条带大小相符 (573 bp)( 图 1-a) 将 PCR 产物纯化回收后与 pmd18-t simple 载体连接, 并利用 Bsa I/BamH I 对重组质粒 pmd18-t-igf-i 进行酶切鉴定 ( 图 1-b) 将鉴定正确的 pmd18-t-igf-i 送测序, 得到开放阅读框 (ORF) 长度为 573 bp 的 IGF-I 基因片段, 在 NCBI 上 BLAST 分析后发现此基因片段与北极红点鲑的 IGF-I 基因 ORF 长度相同, 且同源性高达 99%, 判断出此序列是哲罗鲑 IGF-I 基因该基因序列已提交至 GenBank 数据库, 登录号 :KR IGF-I/pS 重组质粒的构建将鉴定正确的 pmd18-t-igf-i 质粒进行双酶切 (Bsa I/BamH I), 并连接至 ps 表达载体中将重图 1 IGF-I 基因扩增产物及重组质粒 pmd18-t-igf-i 酶切鉴定 (a) 1. IGF-I 基因片段 ;2. 阴性对照 ;M. DL2000 DNA (b)1. 双酶切后的重组质粒 pmd18-t-igf-i;2. 重组质粒 pmd18-t-igf-i; M.DL2000 分子量标准 Fig. 1 Agrose gel analysis of IGF-I PCR products and identification of IGF-I by dual-digestion (a) 1. PCR products of IGF-I; 2. Negative control; M. DL2000DNA marker. (b) 1. Dual-digestion of recombinant plasmid pmd18-t-igf-i; 2. Recombinant plastmid pmd18-t-igf-i; M. DL2000 DNA marker.

25 mmol/l) 诱导 3 h 表达效果最佳, 且重组 IGF- I 蛋白以包涵体的形式存在 ( 图 3-a) 2.

4 1660 水产学报 40 卷组质粒 IGF-I/pS 转化至表达菌株 E.coli Rosetta 中, 挑单菌落培养, 菌液 PCR 鉴定得到与预期相符合的条带 ( 图 2) 进一步对重组质粒 IGF-I/pS 进行双酶切鉴定 (Bsa I/BamH I), 结果显示与预期相符, 且测序结果也显示正确, 说明目的片段已成功载入表达载体后的菌液超声破碎, 分别收集上清和沉淀进行 SDS-PAGE 电泳检测, 结果显示,37 C IPTG (0.25 mmol/l) 诱导 3 h 表达效果最佳, 且重组 IGF- I 蛋白以包涵体的形式存在 ( 图 3-a) 2.4 重组 IGF-I 蛋白的纯化经上述对重组 IGF-I 蛋白的 SDS-PAGE 电泳检测, 可知重组 IGF-I 蛋白以包涵体的形式存在因此, 取破碎后的沉淀, 用复性液洗涤 3 次后, 加入变性液,4 C 过夜, 再将 10 倍体积复性液缓慢加入并不断搅拌, 最后经 PBS 透析得重组 IGF- I 融合蛋白将纯化后的重组 IGF-I 融合蛋白进行 SDS-PAGE 电泳分析, 发现有与预期相符的特异性条带 ( 图 3-b) 2.5 IGF-I 蛋白的免疫学鉴定图 2 重组质粒 IGF-I/pS PCR 鉴定 M. DL 2000 分子量标准 ;1. 阴性对照 ;2. IGF-I 基因片段 Fig. 2 Agrose gel analysis of IGF-I/p PCR products M. DL2000 DNA marker; 1. Negative control; 2. PCR product of IGF-I 2.3 重组 IGF-I 蛋白在 E.coli Rosetta 中的表达将重组质粒 IGF-I/pS 转入 E.coli Rosetta 中, 利用 IPTG 进行诱导表达, 分别对诱导时间及诱导温度进行对比实验, 得出最佳诱导条件诱导将 IGF-I 融合蛋白用包被液稀释到不同浓度梯度, 依据 ELISA 试剂盒操作方法, 加入酶标包被板与 IGF-I 蛋白的抗体结合, 最后加入酶标试剂, 用酶标仪检测, 结果显示,A 490 值随 IGF-I 蛋白浓度的升高逐渐增大, 且对照组与实验组之间呈极显著性差异 (P<0.01)( 图 4), 表明本实验通过原核表达获得了完整的具有免疫活性的哲罗鲑 IGF-I 融合蛋白 2.6 IGF-I 蛋白的生物活性鉴定运用 MTT 法检测不同浓度的哲罗鲑 IGF-I 融图 3 IGF-I 蛋白的可溶性最佳诱导时间分析以及纯化后的蛋白分析 (a)m: 蛋白分子量标准 ;1: 未诱导菌体破碎后上清 ;2: 未诱导菌体破碎后沉淀 ; : 诱导 2 h 3 h 4 h 5 h 后菌体破碎上清 ; : 诱导 2 h 3 h 4 h 5 h 后菌体破碎沉淀 (b)1: 纯化后的重组 IGF-I 蛋白 ;M: 蛋白分子量标准 Fig. 3 Analysis of the solubility and optimal induction time of IGF-I protein and the analysis of the purified protein (a)m: Protein marker; 1: Supernatant of uninduced bacteria; 2: Sediment of uninduced bacteria; : Supernatant of induced bacteria of 2 h 3 h 4 h and 5 h; : Sediment of induced bacteria of 2 h 3 h 4 h and 5 h. (b) 1: Purified IGF-I protein; M: Standard protein marker

5 11 期王晓玉, 等 : 哲罗鲑胰岛素样生长因子 -I 的原核表达及活性鉴定 1661 的蛋白在大肠杆菌中的表达效果最佳 3.2 蛋白的定性及生物活性分析图 4 IGF-I 蛋白的 ELISA 检测结果 ** 表示与对照组差异极显著 (P<0.01) Fig. 4 ELISA detection results of IGF-I protein ** indicated extremely significant difference with the control group 合蛋白对 EPC CHSE-214 和 RTG-2 细胞的增殖效应随着 IGF-I 蛋白浓度的增高,EPC CHSE-214 和 RTG-2 细胞均呈现出有增殖效应, 且与对照组相比有显著性差异 (P<0.01)( 图 5) 图 5 IGF-I 蛋白的 MTT 检测结果 * *' 和 *" 分别表示与各自对照组呈显著性差异 (P<0.05) Fig. 5 MTT detection results of IGF-I protein *, *' and *" indicated significant difference with the control group (P<0.05) 3 讨论 3.1 蛋白的诱导表达分析原核表达系统因其周期快表达量高以及成本低等众多优势, 被广泛应用于很多生物制剂的表达, 而大肠杆菌表达系统又是原核表达系统中最受欢迎的外源蛋白表达系统 [10] 目的蛋白在大肠杆菌中的表达量受多种因素的影响, 如诱导剂的浓度诱导的时间以及诱导温度等 [11] 本研究选用 Bsa I 和 BamH I 酶切位点, 将 IGF-I 基因片段连接至 ps 表达载体中, 转入表达菌株 E.coli Rosetta 中, 利用 IPTG 进行诱导表达经实验发现,37 C IPTG(0.25 mmol/l) 诱导 3 h, 目 IGF-I 在促细胞生长分裂分化及骨发生与 [12] 重建等方面具有显著作用, 但关于鱼类 IGF- I 蛋白的诸多生物功能还有待深入研究由于目前商业化的鱼类 IGF-I 抗体较少, 对鱼类 IGF-I 生物功能的研究有所制约本研究原核表达获得的哲罗鲑 IGF-I 融合蛋白, 经免疫活性实验检测显示其具有识别特异性抗体的能力, 说明获得具有免疫活性的完整结构的哲罗鲑 IGF-I 蛋白 IGF-I 能特异性识别组织细胞膜上的受体, 并与之结合以激活细胞核内核糖体 DNA 的启动子, 从而促进细胞分裂与增殖 [13] 有研究显示, 重组虹鳟 IGF-I 对小鼠成纤维细胞有促增殖作用 [14], [15] 赵晓杰等也发现, 重组大菱鲆 IGF-I 能促进大菱鲆肾脏细胞增殖本实验利用 CHSE-214 EPC 以及 RTG-2 鉴定重组哲罗鲑 IGF-I 融合的生物活性 MTT 法结果显示, 目的蛋白对 3 种细胞均有显著促增殖效应, 表明本研究利用原核表达系统成功获得了具有良好生物学活性的哲罗鲑 IGF-I 融合蛋白 IGF-I 作为 GH 的中介体, 在调节鱼类生长代谢中起核心作用目前关于哲罗鲑 IGF-I 基因的研究非常少, 本研究通过对哲罗鲑 IGF-I 基因的克隆原核表达以及蛋白产物的纯化研究, 获得了具有免疫活性和生物学活性的 IGF- 蛋白, 为深入解析 IGF-I 在哲罗鲑生长发育中的调控机制及绿色高效促生长制剂的研发奠定基础参考文献 : [ 1 ] [ 2 ] [ 3 ] Reinecke M. Insulin-like growth factors and fish reproduction[j]. Biology of Reproduction, 2010, 82(4): Wang D S, Jiao B W, Hu C J, et al. Discovery of a gonad-specific IGF subtype in teleost[j]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2008, 367(2): 张春香, 罗海玲, 陈喻, 等. IGF-1 基因内含子 4 多态性与南江黄羊生长性状的关系 [J]. 中国草食动物, 2008, 28(5): Zhang C X, Luo H L, Chen Y, et al. Relationship between the polymorphism of IGF-1 gene intron 4 & the growth performance of Nanjiang Yellow goat[j]. China

6 1662 水产学报 40 卷 [ 4 ] [ 5 ] [ 6 ] [ 7 ] [ 8 ] [ 9 ] Herbivores, 2008, 28(5): (in Chinese). Peter R E, Marchant T A. The endocrinology of growth in carp and related species[j]. Aquaculture, 1995, 129(1-4): 王清印, 徐来宁, 杨宁生. 中国水产生物种质资源与利用 [M]. 北京 : 海洋出版社, 2005: Wang Q Y, Xu L N, Yang N S. Genetic Resources & Utilization of Aquatic Organisms in China[M]. Beijing: Ocean Press, 2005: (in Chinese). 董崇智, 李怀名, 赵春刚, 等. 濒危名贵哲罗鱼保护生物学的研究 Ⅱ. 哲罗鱼性状及生态学资料 [J]. 水产学杂志, 1998, 11(2): Dong C Z, Li H M, Zhao C G, et al. Study on the protective biology of precious Hucho trout being in critically ill Ⅱ properties of Hucho trout and its ecology data[j]. Chinese Journal of Fisheries, 1998, 11(2): (in Chinese). 乐佩琦, 陈宜瑜. 中国濒危动物红皮书 : 鱼类 [M]. 北京 : 科学出版社, 1998: Le P Q, Chen Y Y. China Red Data Book of Endangered Animals: Pisces[M]. Beijing: Science Press, 1998: (in Chinese). 徐伟, 尹家胜, 姜作发, 等. 哲罗鱼人工繁育技术的初步研究 [J]. 中国水产科学, 2003, 10(1): Xu W, Yin J S, Jiang Z F, et al. A technique of artificial reproduction of Hucho taimen[j]. Journal of Fishery Sciences of China, 2003, 10(1): (in Chinese). 姜作发, 尹家胜, 徐伟, 等. 人工养殖条件下哲罗鱼生长的初步研究 [J]. 水产学报, 2003, 27(6): Jiang Z F, Yin J S, Xu W, et al. A preliminary study on [10] [11] [12] [13] [14] [15] the growth of Hucho taimen under artificial rearing conditions[j]. Journal of Fisheries of China, 2003, 27(6): (in Chinese). Fischer B, Summer L, Goodenough P. Isolation, renaturation, and formation of disulfide bonds of eukaryotic proteins expressed in Escherichia coli as inclusion bodies[j]. Biotechnology and Bioengineering, 1993, 41(1): Amersham Pharmacia Biotech. GST Gene Fusion System[M]. 3rd ed. San Francisco: Pharmacia Biotech, Inc., 2001: 2-4. Rosen C J. Donahue L R. Insulin-like growth factors and bone: The osteoporosis connection revisited[j]. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine, 1998, 219(1): 1-7. Ong J, Yamashita S, Melmed S. Insulin-like growth factor I induces c-fos messenger ribonucleic acid in L6 rat skeletal muscle cells[j]. Endocrinology, 1987, 120(1): Van Reeth T, Drèze P L, Szpirer J, et al. Positive selection vectors to generate fused genes for the expression of His-tagged proteins[j]. Biotechniques, 1998, 25(5): 赵晓杰, 陈松林, 王娜, 等. 大菱鲆胰岛素样生长因子 - I 成熟肽的克隆重组表达及活性分析 [J]. 水产学报, 2010, 34(1): 1-7. Zhao X J, Chen S L, Wang N, et al. Cloning, recombinant expression and purification of Turbot (Scophthalmus maximus) mature IGF-I[J]. Journal of Fisheries of China, 2010, 34(1): 1-7 (in Chinese).

7 11 期王晓玉, 等 : 哲罗鲑胰岛素样生长因子 -I 的原核表达及活性鉴定 1663 Prokaryotic expression and bioactivity analysis of insulin-like growth factor-i from Hucho taimen WANG Xiaoyu 1,2, XU Liming 1, LIU Miao 1, ZHAO Jingzhuang 1, LU Tongyan 1, CAO Yongsheng 1, YIN Jiasheng 1 * (1. Heilongjiang River Fishery Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Harbin , China; 2. College of Fishery and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai ) Abstract: Insulin-like growth factor-i (IGF-I) plays a major role in the control of growth and development in fish. Total RNA was isolated from H. taimen liver tissue. The cdna encoding insulin-like growth factor I (IGF-I) peptide was amplified by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) strategy using isolated total RNA as template. Recombinant expression plasmid (IGF-I/pS) was constructed by prokaryotic expression vector ps and transformed into E. coli Rosetta. The expression of recombinant IGF-I protein of H. taimen was induced by IPTG. There was a clear target band with expected size between 35~50 kd in SDS-PAGE electrophoresis, and the recombinant protein existed in the form of inclusion body. Purified IGF-I protein was obtained after the inclusion body was denatured/renatured. ELISA results showed that target protein can identify commercial fish IGF-I antibody, indicating that H. salmon IGF-I protein with immune activity was obtained. Cell proliferation assay (MTT) results showed that recombinant IGF-I protein can significantly promote the propagation of CHSE-214, EPC and RTG-2, indicating that the recombinant IGF-I protein had biological activity. The study has laid a foundation for the research of IGF-I function in the growth and development of H. taimen. Key words: Hucho taimen; insulin-like growth factors-i; prokaryotic expression; bioactivity Corresponding author: YIN Jiasheng. xwsc20@tom.com Funding projects: National Science and Technology Support Program (2012BAD25B10); Public Welfare Industry (Agriculture) Research ( )

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽