2009,29(6) 杨琳等 :SHIP 基因真核表达载体的构建 鉴定及其表达抑制白血病细胞增殖的实验研究 15 1 材料与方法 1.1 细胞培养人白血病细胞系 K562, 用含 10% 胎牛血清 RPMI? 1640 培养基, 加入青霉素 (100u/ml) 和链霉素 (100μg/ ml) 的培

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1 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2009,29(6):14~19 SHIP 基因真核表达载体的构建 鉴定 及其表达抑制白血病细胞增殖的实验研究 杨琳罗建民 刘小军成志勇温树鹏杜行严杨晓阳武学文 ( 河北医科大学第二医院石家庄 ) 摘要构建真核表达载体 pcag?ires?ship?gfp, 并观察其在 K562 细胞中的表达 将 SHIP 逆转录聚合酶链反应 (RT?PCR) 产物克隆入 pcag?ires?gfp, 经酶切 PCR 鉴定及测序分析, 构建 pcag?ires?ship?gfp 重组真核表达载体 ; 采用脂质体转染法将 pcag?ires?ship?gfp 及空载体转入 K562 细胞, 实时荧光定量 PCR(FQ?PCR) Westernblot 方法检测转染前后 K562 细胞中 SHIP mrna 和蛋白的表达及 Akt 磷酸化水平改变,MTT 流式细胞仪检测等方法观察野生型 SHIP 基因表达对白血病细胞 K562 凋亡的影响 结果显示重组后的 pcag?ires?ship?gfp 质粒已成功载入 SHIP 的全长编码基因, 序列测定的结果与预期设计完全一致 荧光显微镜下可见在转染 pcag? IRES?SHIP?GFP 的 K562 细胞中存在荧光分布 外源性 SHIP 基因表达能使 K562 细胞增殖受抑 ; Westernblot 检测提示 K562 细胞 Akt308 和 Akt473 的磷酸化水平较转染前显著下调, 分别为转染前的 38.7% 和 36.8%(P<0.01) 上述结果表明基因全长 3.5kb 的人野生型 SHIP 基因真核表达载体质粒 pcag?ires?ship?gfp 构建成功, 并在 K562 细胞中表达 ; 外源性 SHIP 基因表达能使 K562 细胞凋亡增加 ; 这些改变可能与 p?akt 表达下调有关 关键词 pcag?ires?ship?gfp 肌醇 5 磷酸酶基因转染白血病 K562 细胞 Akt 磷酸化细胞增殖中图分类号 R733.4;R 含 SH2 域肌醇 5 磷酸酶 (SH2domaincontaining inositol5?phosphatase,ship) 在造血细胞增殖和生存的信号传导途径中起关键性负调控作用, 人类 SHIP 基因仅限于造血细胞表达, 其主要功能是特异性降解磷脂酰肌醇?3? 激酶 (phosphatidylinositol?3?kinase,pi3k) 的产物三磷酸肌醇 (inositoltriphosphate,pip3), 后者作为细胞内的第二信使在蛋白激酶 B(proteinkinaseB,Akt) 活化及维持细胞存活信号通路 对抗各种因素引起的细胞凋亡方面发挥重要功能 [1,2] 最近研究发现在急性髓系白血病患者原始细胞中存在 SHIP 基因的催化区域失活性突变 [3~5], 提示正常情况下 SHIP 在造血前体细胞中可能具有肿瘤抑制作用 SHIP 基因在白血病收稿日期 : 修回日期 : 国家自然科学基金 ( ) 河北省自然基金 ( ) 资助项目 通讯作者, 电子信箱 :luojm315@yahoo.com.cn 发病中的作用尚不完全清楚 我们前期研究表明 K562 细胞中 bcr/abl 的表达对 SHIP 基因的功能有抑制作用, 应用甲磺酸伊马替尼或 RNAi 技术封闭 bcr/abl 后, SHIP 蛋白表达水平上调,Akt 磷酸化水平下调, 细胞凋亡增加, 这些研究均提示 SHIP 基因可能参与白血病的发生发展 [6,7] 选择性敲除 SHIP 基因小鼠出现骨髓细胞高度增生, 并导致肝脾肿大及其他重要脏器骨髓细胞的高度浸润, 生长因子刺激导致 SHIP?/? 小鼠骨髓细胞 PIP3 水平增加,Akt 磷酸化水平明显上调, 细胞凋亡减少 [8] 本研究旨在构建真核表达载体质粒 pcag? IRES?SHIP?GFP 并瞬时转染人白血病细胞系 K562, 观察其表达对 K562 细胞增殖及对 Akt 磷酸化水平的影响, 为进一步探讨 SHIP 基因的生物学作用及其在白血病中的发病机制奠定基础

2 2009,29(6) 杨琳等 :SHIP 基因真核表达载体的构建 鉴定及其表达抑制白血病细胞增殖的实验研究 15 1 材料与方法 1.1 细胞培养人白血病细胞系 K562, 用含 10% 胎牛血清 RPMI? 1640 培养基, 加入青霉素 (100u/ml) 和链霉素 (100μg/ ml) 的培养体系, 均在 37,5%CO 2, 饱和湿度环境下孵育 1.2 试剂和仪器载体 pcag?ires?gfp 以及大肠杆菌 E.coliDH5α 由本室保存 TRIzol Lipofectamine2000 购自 Invitrogen 公司 逆转录试剂 T4DNA 连接酶购自 NEB 公司 引物由上海吉凯基因技术有限公司合成 各种限制性内切酶和 Pyrobest 高保真酶购自 NEB 公司 胶回收试剂盒和质粒小量抽提纯化试剂盒购自 Qiagen 公司 SHIP p?akt308 p?akt473 β?actin 抗体购自 SantaCruz Biotechnologies 公司 HRP 标记的山羊抗小鼠 IgG Western 化学发光底物系统均为美国 Pierce 公司产品 SHIP 探针由广州达安基因公司合成, 绝对荧光定量 PCR 试剂盒 ( 针对 SHIP) 由达安基因公司设计合成 ( 基因序列来自基因库, 获取号 M77273) SHIP 正义序列 : 5?CGACAAGAAGCTGAGTCCCTTT?3 反义序列 : 5?GGTAGTTAAGATCCCCAAACCAGAA?3 探针 : 5?FAM?ACA TCA CTC ACC GCT TCA CGC ACC? TAMRA?3 荧光定量仪 LightCycle 来自 Applied Biosystems 公司, 测序仪 AB13730 来自 Invitrogen 公司 稳压 DNA 电泳仪为 BioRad 公司 1.3 总 RNA 的提取和 cdna 的合成 总 RNA 的提取 Ficol 淋巴细胞分离液提取正常人外周血白细胞约 溶于 1mlTRIzol 后, 接着按 TRIzol 说明书进行操作 最后 DEPC 处理的蒸馏水溶解 RNA cdna 合成反应体系 : 缓冲液 :5μl; 2 dntp(10mmol/l):2.0μl;3 Oligo(dT)15primer (100μg/ml):5μl;4 RNasin 酶抑制剂 (40U/μl):0.5 μl;5 M?MLV(200U/μl):1μl;6 RNA 模板 :1~2 μg;7 加 DEPC 处理的三蒸水至 25μl 反应条件为: 25 退火 10min,37 延伸 60min 合成 cdna,70 10min 灭活 M?MLV,4 冷却 5min cdna 置于 -20 保存备用 1.4 引物设计及 RT?PCR 引物设计按载体 pcag?ires?gfp 的要求, 扩增的 SHIP 和启动的编码序列, 无读码框内终止信号, 全长为 3585bp 为方便将 RT?PCR 产物装入 pcag? IRES?GFP 载体中, 合成 5 端悬垂 XhoⅠ Xam Ⅰ 酶切位点的 SHIPcDNA 序列, 经计算机模拟分析, 引物自身不会互补或形成发夹结构 正义序列 hship?xhoⅠ:5?atcgatgcggccgcctcgagatggtcccctgctggaa C?3 ( 酶切位点 :XhoⅠ); 反义序列 hship?xam Ⅰ:5? GGGAGAGGGG GGATCCCGGGTCACTGCATGGCAGTC CTG?3 ( 酶切位点 :XamⅠ) 上游引物含起始密码子, 下游引物不含终止密码子 该引物扩增的靶序列全长 3585bp PCR 反应体系 110 Pyrobest 缓冲液 :2μl; 2 dntp(2.5mmol/l):0.8μl;3 hship?xhoⅠ(10 μmmol/l):0.4μl;4 hship?xam Ⅰ(10μmmol/L): 0.4μl;5 Pyrobest 高保真酶 (5U/μl):0.2μl;6 cdna 模板 :1μl;7 MgCl 2 0.5μl; 加灭菌蒸馏水 14.7 μl 至 20μl 阴性对照用灭菌蒸馏水代替 cdna 模板 PCR 反应条件 94 预变性 30s,94 变性 30s,55 退火 30s,72 延伸 8min, 扩增 30 个循环 ; 最后 72 延伸 15min 1.5 PCR 产物的克隆 PCR 产物和 pcag?ires?gfp 的酶切体系 1 10 bufer:5μl;2 10 BSA:0.5μl;3 XhoⅠ(10U/ μl):1μl;4 XamⅠ(10U/μl):1μl;5 PCR 产物 (100 ng/μl):2μl;6 加灭菌蒸馏水 40.5μl 至 50μl 37 饱和酶切 1h 酶切产物的回收酶切的质粒 DNA 和 PCR 产物应用胶回收试剂盒回收 连接反应体系及条件 1 10 T4 噬菌体 DNA 连接酶缓冲液 :1μl;2 T4 噬菌体连接酶 :1μl;3 双酶切回收的载体 DNA(100ng/μl):1μl;4 双酶切回收的 PCR 产物 (100ng/μl):1μl;5 加灭菌蒸馏水 7μl 至 10μl 于 4 12h 连接反应, 制备克隆连接液, 准备转化 质粒 DNA 抽提连接产物转化感受态大肠杆菌 E.coliDH5α 后, 将 150μl 已转化的感受态细胞转移至含 20mmol/LMgSO 4 和 kan 抗性的 SOB 琼脂培养基上, 将平板置于室温直至液体被吸收, 倒置平皿, 于 37 培养,16h 长出的克隆进行后续 PCR 鉴定 1.6 pcag?ires?gfp?ship 重组体的鉴定质粒 DNA 经 Xam I/XhoI 双酶切和 PCR 扩增鉴定, 阳性克隆送上海吉凯基因技术有限公司经 ABI3730 自动测序仪进行序列分析

3 16 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.29No 真核表达质粒转染 K562 细胞分为未转染组 转染 pcag?ires?gfp 组和 pcag? IRES?SHIP?GFP 组, 当细胞处于对数生长期时, 以 lipofectamine2000 分别转染上述质粒, 转染 24h 后用荧光显微镜观察 GFP 的表达, 检测 SHIPmRNA 及蛋白的表达及转染前后 K562 细胞中 Akt 磷酸化水平变化 1.8 转染前后 K562 细胞增殖凋亡变化 细胞生长曲线分别取转染前后细胞调整密度均为 /ml, 接种于 96 孔无菌培养板中, 每孔 200μl 每个时段下设 3 个复孔 终止培养前 4h, 每孔加入四唑氮兰 (MTT)10μl(10mg/ml), 终止培养时, 每孔加入 150μl 二甲基亚砜 (DMSO), 溶解后用酶标仪测 490nm 处光密度 (A) 值, 并计算增殖抑制率 : 增殖抑制率 =(1-A 实验组 /A 对照组 ) 100% 流式细胞术检测细胞增殖指数收集转染 5 天时的各组细胞, 每组收集 个,70% 乙醇 4 固定过夜 ; 加入 RNA 酶,37 水浴消化 15~30min 后加入碘化丙啶 (PI),4 存放 15min 以上, 流式细胞仪检测, 分析凋亡率及计算增殖指数 增殖指数 (PI)=(S+G2/M) 细胞数 /(G0/G1+S +G2/M) 细胞数 1.9 统计学分析数据用 X±SD 表示, 均数比较采用配对 t 检验,P <0.05 认为有统计学意义 2 结果 2.1 重组质粒 pcag?ires?ship?gfp 的构建采用 RT?PCR 方法扩增消除终止密码子的 SHIP 基因片段,PCR 的产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳鉴定, 符合预期片段的大小 (bp)( 图 1a) 将 PCR 的扩增产物纯化回收并用 XamI/XhoI 双酶切之后插入真核表达载体 pcag?ires?gfp 中, 构建了重组质粒 pcag?ires? SHIP?GFP 2.2 真核表达载体 pcag?ires?ship?gfp 的鉴定 pcag?ires?ship?gfp 的 Xam I/XhoI 双酶切鉴定重组质粒 pcag?ires?ship?gfp 经 XamI/XhoI 双酶切后可获得预期大小的条带 ( 约 3585bp)( 图 1b) pcag?ires?ship?gfp 的 PCR 扩增鉴定随机选取 kan 抗性的转化克隆, 提取质粒 DNA 作为模板, 取 1μl 进行 PCR 扩增, 蒸馏水 1μl 作为阴性对照排除系统中外源核酸污染导致的假阳性结果, 同时以 GAPDH 基因作为内参, 排除 PCR 反应体系的异常造成的假阴 图 1 PCR 电泳图谱 Fig.1 ElectrophoresispaternofSHIPRT?PCR (a)1:dnamarkerdl2000;2:pcrproduct(3585bp)(b) RestrictionanalysisofrecombinantplasmidspCAG?IRES?SHIP?GFP bypcranddoublerestrictionwithxami/xhoi(c)identification ofpositiveclonesbyrt?pcr;1:negativecontrol(ddh 2 O);2: Negativecontrol(transfectedwithemptyvector);3:Positivecontrol (GAPDH);4:DNAMarker;5~10:Transfectedwith pcag?ires?ship?gfp 性结果, 均在相同条件下进行扩增 正义序列 pcag? IRES?GFP?SEQF:5?GCTCTAGAGCCTCTGCTAACC?3 ; 反义序列 hship?seqr:5?gtgaagaacctc ATGGAGACG?3 ; 用于 PCR 鉴定目的基因定向连接的阳性克隆菌落及测序 扩增产物电泳结果阳性克隆送测序 阴性对照未能扩增出条带, 排除假阳性 ( 图 1c) pcag?ires?ship?gfp 的阳性结果测序及结果分析将含重组质粒的阳性克隆进行正 反双向测定, 拼接出 SHIP 完整序列, 经 blast 分析, 目的基因克隆正确, 与基因库收录的 SHIPORF( 收录号 U57650) 一致 2.3 SHIPmRNA 和蛋白在 K562 细胞中的表达实验设 3 组, 转染 pcag?ires?ship?gfp 质粒的 K562 细胞为实验组, 转染空载体的细胞和未转染组为对照组 48h 后荧光显微镜下观察 GFP 表达情况 直接用流式细胞仪上机检测表达绿色荧光蛋白的细胞比例计算转染效率 48.2±6.6% FQ?PCR 结果显示, 转染 SHIP 基因后,K562 细胞中的 SHIPmRNA 显著上升, K562/SHIP 组 SHIPmRNA 表达水平 (19.26±4.66) 明显高于 K562/RIV 组 (0.011±0.003) 和未转染组 (0.011±0.004)(t=24.73,P<0.01)( 图 2) 2.4 外源性 SHIP 蛋白表达对 K562 细胞增殖及凋亡的影响 MTT 法比较转染 SHIP 基因和空载体 K562 细

4 2009,29(6) 杨琳等 :SHIP 基因真核表达载体的构建 鉴定及其表达抑制白血病细胞增殖的实验研究 17 胞的生长结果发现, 转染野生型 SHIP 基因明显地抑制 K562 细胞生长, 自转染后 3d 出现明显区别, 细胞最大生长抑制率达到 (34±1.9)%, 明显高于 K562/IRES 细胞 (P<0.05)( 图 4) 图 4 不同转染组细胞增殖抑制率 Fig.4 Theanti?proliferativeefectofSHIPonK562 图 2 转染 pcag?ires?ship?gfp 的 K562 细胞 ( 200) Fig.2 K562celstransfectedwithpCAG?IRES?SHIP?GFP orpcag?ires?gfpshowedgreencolor( 200) (a)k562celswhichhadbeentransfectedwith pcag?ires?gfp?shiporpcag?ires?gfp (b)k562celswhichhadbeentransfectedwithpcag?ires?gfp 细胞周期分布于转染 5d 收集每组细胞 个, 流式细胞仪分析结果表明 K562/SHIP 细胞主要表现为 G0/G1 期细胞增多 G2/M 期细胞减少, 细胞增殖指数降低, 凋亡率增加 ; 表明 K562/SHIP 细胞较亲代 K562 细胞增殖能力降低 ( 表 1) 2.5 pcag?ires?ship?gfp 转染 K562 细胞前后 Akt308 和 473 的磷酸化水平变化 Westernblot 分析比较转染前后 K562 细胞中 Akt? 308 和 Akt?473 的磷酸化水平均出现明显下降,Akt?308 在转染组细胞的磷酸化水平 (0.182) 显著低于对照组 (0.470),Akt?473 在转染组细胞的磷酸化水平 (0.709) 也较对照组 (0.421) 明显减低, 差异有统计学意义 (P< 0.01)( 图 5) 3 讨论 图 3 不同转染组 SHIPmRNA 表达情况 Fig.3 DetectionofSHIPmRNAinK562cels CelstransfectedwithSHIPoremptyvectorwereanalyzedby fluorescencequatitypcr.representativeplotsofthreeindependent experimentsareshown.a:k562/ship;b:k562/ires; C:Untransfectedgroup 近年来, 关于肿瘤发生发展中的基因功能研究, 很多都是应用基因转染技术 真核表达载体 pcag?ires? GFP 是一个能表达绿色荧光蛋白的质粒 在本研究中, 为了构建 SHIP 与 pcag?ires?gfp 的重组表达载体, 我们选择 2 个含有 pcag?ires?gfp 上常用的限制性内切酶位点 XhoI 和 XamI 的引物扩增 SHIPcDNA 表 1 细胞周期分布及细胞增殖指数 (x±s) Table1Thedistributionofcelcycleandproliferationindex(PI)inK562/SHIPandK562cels(x±s) Group G0/G1(%) S(%) G2/M(%) PI Apoptosisrate(%) K562/SHIP K562/IRES K ± ± ± ± ± ±3.29 P<0.05,vsK562/IRES; P<0.05,vsK562; P>0.05,vsK ± ± ± ± ± ± ± ± ±3.52 的编码序列, 对 SHIP 基因的终止密码子进行删除 电泳结果表明,RT?PCR 产物符合预期大小 将该片段克隆入 pcag?ires?gfp 的 N 端上游后, 双酶切和 PCR 鉴定结果都提示 pcag?ires?ship?gfp 重组载体构建成 功 ;DNA 测序进一步表明, 扩增序列正确包括起始密码子序列 ATG 但不含有终止密码子 pcag?ires?ship? GFP 载体转染 K562 细胞, 由于二者共用了 1 个启动子序列且 SHIP 基因位于上游, 因而报告基因 GFP 的表达

5 18 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.29No 图 5 pcag?ires?ship?gfp 或空载体转染 K562 细胞后 Akt 的磷酸化水平变化 Fig.5 Aktphosphorylationisinhibitedin SHIPexpresingK562cels (a)totallevelsofaktandaktphosphorylationwas analyzedbywesternbloting (b)thelevlsofaktphosphorylationandthetotalamountofakt wasnormalizedtoβ?actindetectedineachsample Openbars:pThr 308 /Akt;dashedbars:pThr 473 /β?actin; 1:K562/IRES;2K562/SHIP 能够反映目的基因 SHIP 在细胞内表达的状况 RT? PCR 及基因测序检测证实了重组载体 pcag?ires? SHIP?GFP 成功构建 SHIP 基因属于磷酸肌醇脂磷酸酶家族 与张力蛋白同源的 10 号染色体缺失的磷酸酶基因 (phosphatase andtensinhemologydeletedon chromosometen gene, PTEN) 是第一个被证实的具有抑癌基因作用的磷酸肌醇脂磷酸酶, 它对磷酸酪氨酸和磷酸酯底物具有双重磷酸酶作用 在造血系统恶性肿瘤中,PTEN 基因主要表现为不同程度的低表达和表达缺失, 而基因突变 重排少见 [9,10], 且研究表明 PTEN 只能负性调控细胞的基础 Akt 活性, 而不能调节造血生长因子刺激引起的 Akt 的活化 [11] 最近研究发现 SHIP 基因在造血细胞增殖和生存的信号传导途径中起关键负性调控作用, 人类 SHIP 基因位于染色体 2q37, 仅限于造血细胞表达, 其主要功能是特异性降解 PI3K 的产物 PIP3, 包括 PI(3, 4,5)P3 和 PI(1,3,4,5)P4, 后两者作为细胞内的第二信使在 Akt 活化及维持细胞存活信号通路 对抗各种因 [3,4] 素引起的细胞凋亡方面发挥重要功能 罗建民等 首次报道 22% 的急性髓系白血病和 12% 的急性淋巴细胞白血病患者标本中存在 SHIP 基因的功能结构域遗传学突变 ; 在这些突变中,78% 的突变集中在 SHIP 基因的重要结构域, 如 SH2 结构域的 FLVRES 修饰区 PTPase 和 PxxP 功能区 ; 并且有些突变在疾病完全缓解 [5] 后消失 ; 张苏江等也在急性髓系白血病中发现了两 种 SHIP 突变 (A>T,Q1154LQ1153L) 至今 SHIP 基因在白血病发病中的作用尚不完全清楚 我们前期研究证实 K562 细胞中 bcr/abl 的表达对 SHIP 基因的功能有抑制作用, 应用甲磺酸伊马替尼或 RNAi 技术封闭 bcr/abl 后,SHIP 蛋白表达水平上调, 同时 Akt 磷酸化水平下降, 细胞增殖下降, 凋亡率增加 [6,7], 这些研究都表明 SHIP 基因可能在白血病的发生发展中发挥重要作用 我们将 pcag?ires?ship?gfp 转染 K562 细胞后发现外源性 SHIP 基因表达能明显抑制 K562 细胞增殖, 并促进其凋亡 同时检测 Akt 磷酸化水平, 结果表明 p?akt308 和 p?akt473 水平较对照组均明显降低, 从而证实了在 K562 细胞中 SHIP 基因缺失是其 p?akt 高表达的关键因素之一 总之, 我们的研究结果初步显示, 由于 SHIP 基因表达缺失, 导致 PI3K/Akt 信号转导通路的激活可能在白血病发生 发展中发挥重要作用, 并有可能成为白血病治疗的新靶点, 但是确切的分子网络调控机制还有待于进一步研究 以 PI3K/Akt 为靶点开发的小分子靶向抑制 Akt 活性的药物目前在白血病治疗上已取得进展 本研究中成功构建了 pcag?ires?ship?gfp 真核表达载体并在 K562 细胞内成功表达 SHIPmRNA 及蛋白, 为更深入的研究工作奠定了基础 参考文献 [1]GeierSJ,AlgatePA,CarlbergK,etal.ThehumanSHIP geneisdiferentialyexpresedincellineagesofthebone marowandblood.blood,1997,89(6):1876~1885 [2]HelgasonCD,AntonchukJ,BodnerC,etal.Homeostasisand regenerationofthehematopoieticstem celpoolarealteredin SHIP?deficientmice.Blood,2003,102(4):1541~1547 [3]LuoJM,YoshidaH,KomuraS,etal.Posibledominant? negativemutationoftheshipgeneinacutemyeloidleukemia. Leukemia,2003,17(1):1~8 [4] 罗建民, 刘泽林, 郝红领, 等. 急性白血病细胞 SHIP 基因的突变分析. 中华血液学杂志,2004,25(7):385~388 LuoJM,LiuZL,HaoHL,etal.ChinJHematol,2004,25 (7):385~388 [5] 张苏江, 李建勇, 施静艺, 等. 急性髓系白血病患者 PDGFβ 和 SHIP 基因突变及其单核苷酸多态性研究. 中华血液学杂志,2006,27(6):383~385 ZhangSJ,LiJY,ShiJY,etal.ChinJHematol,2006,27 (6):383~385 [6] 刘晓军, 罗建民, 杨琳, 等. 慢性粒细胞白血病中 SHIP 基

6 2009,29(6) 杨琳等 :SHIP 基因真核表达载体的构建 鉴定及其表达抑制白血病细胞增殖的实验研究 19 因的表达变化及机制探讨. 解放军医学杂志,2007,33:701 ~703 LiuXJ,LuoJM,YangL,etal.MedicalJournalofChinese People sliberationarmy,2007,33:701~703 [7] 任金海, 罗建民, 杨敬慈, 等. 白血病细胞内 SHIP 基因表达及其对 AKT 磷酸化的影响. 中华血液学杂志,2007,28 (12):844~845 RenJH,LuoJM,YangJC,etal.ChinJHematol,2007,28 (12):844~845 [8]KiselevaM V,CaoL,MajerusPW,etal.Phosphoinositide? specificinositolphlyphosphate5?phosphataseⅣ inhibitsakt/ proteinkinaseb phosphorylationandleadstoapoptoticcel death.jbiolchem,2002,277(8):6266~6272 [9]Aggerholm A,GronbaekK,GuldbergP,etal.Mutational analysisofthe tumorsuppresor gene MMAC1/PTEN in malignantmyeloiddisorders.eurjhaematol,2000,65(2): 109~113 [10]YangJ,LiuJ,ZhengJ,etal.Areappraisalbyquantitative flowcytometryanalysisofptenexpresioninacuteleukemia. Leukemia.2007,21(9):2072~2074 [11]LiuQ,SasakiT,KozieradzkiI,etal.SHIP isnegative regulatorofgrowthfactorreceptor?mediatedpkb/aktactivation andmyeloidcelsurvival.genesdev,1999,13(7):786~791 Construction,IdentificationandExpresionofRecombinantEukaryotic VectorpCAG?IRES?SHIP?GFPonPorliferationofLeukemiaCelLineK562 YANGLin LUOJian?min LIUXiao?jun CHENGZhi?yong WENShu?peng YANGXiao?yang WUXue?wen (ProvincialKeyInstituteofHematology,DepartmentofHematology,SecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China) Abstract Theaim wastoconstructandidentifythemammalianexpresionvectorofpcag?ires?ship? GFPandtodetectwhetheritcouldexpresinhumanacuteleukemiacellineK562.ThecDNAfragmentofSHIP obtainedbyrt?pcrwasinsertedintopcag?ires?gfp.therecombinantplasmidwasconfirmedbyrestriction enzymedigesiton,pcr anddna sequecing.pcag?ires?ship?gfpwastransfectedintok562celswith lipofectamine2000.theexpresionofshipwasdeterminedbygfpfluorescenceandwesternblotanalysis.fq?pcrwasusedtoquantitateshipmrna.theexpresionofp?akt,aktweredeterminedbywesternblot.pi weretestedbyflowcytometryandmtttoverifywhetherexogenousshipcouldinhibitproliferationofk562 cels.theresultsshowedthatthecorectconstrutionoftherecombinantplasmidpcag?ires?ship?gfphasbeen shownbyrestrictionenzymedigestion,pcranddnasequencing.pcag?ires?ship?gfpcouldexpresship proteinink562cels.thek562celsviabilityaftertransfectedwithshipgenedropeddown.westernblot analysisshowedthatphospha?akt308andakt473werereducedto38.7% and68% respectively.itwas concludedthatthevectorofpcag?ires?ship?gfphasbeensuccesfulyconstructedanditcanbeexpresedin K562cels.TheexpresionofexogenousSHIPgenecanleadtoapoptosisofK562celsbydown?regulatingthep?Aktexpresion.Whatfoundheremightbeoneofthemechanismsinvolvedinthepathogenesisofleukemia. Keywords pcag?ires?ship?gf PSIHP Genetransfection Leukemia K562celp?Akt Proliferation

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