262 肺癌是世界上发病率致死率和复发率最高的肿瘤疾病, 无论手术放疗还是化疗都难以治愈肺癌患者的五年生存率很低因此, 探讨新的肺癌 [1,2] 治疗手段和方法迫在眉睫 CyclinD1 ( 细胞周期 [3] 蛋白 D1) 基因是一个新的致癌基因, 其在细胞周期从 G 1 期 (DNA 合

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欧孟
7 years ago
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1 生理学报 Acta Physiologica Sinica, June 25, 2011, 63(3): 研究论文 CyclinD1 反义核酸诱导肺腺癌细胞 A549 的凋亡李尊岭 1,*, 邵淑红 2, 谢书阳 1, 岳真 1, 马颖 1 1 滨州医学院生物化学与分子生物学教研室, 分子遗传学研究所 ; 2 应用心理学教研室, 烟台摘要 : 为了探讨 CyclinD1 反义核酸在肺癌基因治疗中的作用, 本研究构建了含有 CyclinD1 反义核酸的表达载体 ( 命名为 : pcdna3.1-cyclind1), 并将该载体转染肺腺癌细胞 A549, 进行 G418 筛选后, 获得稳定表达 CyclinD1 反义核酸的 A549 细胞 ( 命名为 :anti-cyclind1-a549) 通过 MTT 法检测细胞增殖, 流式细胞术检测细胞的凋亡情况, 结果显示稳定转染 CyclinD1 反义核酸后,A549 细胞增殖显著被抑制, 细胞凋亡增加为探讨 CyclinD1 反义核酸诱导细胞凋亡的机理, 应用 Western blot 的方法检测了细胞内视网膜母细胞瘤蛋白质 (retinoblastoma protein, prb) adenovirus E2 factor-1 (E2F-1) 血管内皮生长因子(vas- cular endothelial growth factor, VEGF) 基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)-2 和 MMP-9 的表达, 其结果显示, 稳定转染 CyclinD1 反义核酸后,A549 细胞内 prb E2F-1 VEGF MMP-2 和 MMP-9 蛋白表达均显著降低以上结果表明,CyclinD1 反义核酸可引起肺癌细胞的凋亡, 其机制可能与细胞内 prb E2F-1 VEGF MMP-2 和 MMP-9 的表达降低相关关键词 : 肺癌 ; 凋亡 ;CyclinD1; 基因治疗中图分类号 :R734 Anti-sense nucleic acid of CyclinD1 induces apoptosis of lung adenocarcinoma cancer cell A549 LI Zun-Ling 1,*, SHAO Shu-Hong 2, XIE Shu-Yang 1, YUE Zhen 1, MA Ying 1 1 Department of Biochemistry and Molecular Biology, Institute of Molecular Genetics; 2 Department of Medical Psychology; Binzhou Medical College, Yantai , China Abstract: To explore the potential of the anti-sense nucleic acid of CyclinD1 in lung cancer therapy, the expression vector containing the anti-sense nucleic acid of CyclinD1 was constructed and named pcdna3.1-cyclind1. The A549 cells were transfected with pcdna3.1-cyclind1 vectors. After being screened by G418, the stable expression positive clones were obtained. MTT method and flow cytometry technique were used to detect cell proliferation and apoptosis, respectively. The results showed the transfected cells exhibited significantly increased apoptosis and inhibited cell growth, compared with negative control and empty vector groups. To investigate the mechanism for anti-sense nucleic acid of CyclinD1 inducing A549 cells apoptosis, the expression levels of retinoblastoma protein (prb), adenovirus E2 factor-1 (E2F-1), vascular endothelial growth factor (VEGF), matrix metalloproteinase (MMP)-2 and MMP-9 were detected by Western blot, and the results showed the expressions of these proteins were all decreased significantly in antisense nucleic acid of CyclinD transfected group, compared with those in negative control and empty vector groups. In a word, antisense nucleic acid of CyclinD1 induces the apoptosis of lung adenocarcinoma cancer cells, and the depressions of prb, E2F-1, VEGF, MMP-2 and MMP-9 expressions may be the possible mechanism. Key words: lung tumor; apoptosis; CyclinD1; gene therapy Received Accepted This work was supported by the Natural Science Foundation of Shandong Province, China (No. Y2008C164) and Science Development Project of Yantai Municipality, Shandong Province, China (No ). * Corresponding author. Tel: ; lizunling@hotmail.com

2 262 肺癌是世界上发病率致死率和复发率最高的肿瘤疾病, 无论手术放疗还是化疗都难以治愈肺癌患者的五年生存率很低因此, 探讨新的肺癌 [1,2] 治疗手段和方法迫在眉睫 CyclinD1 ( 细胞周期 [3] 蛋白 D1) 基因是一个新的致癌基因, 其在细胞周期从 G 1 期 (DNA 合成前期 ) 到 S 期 (DNA 合成期 ) 的过渡具有重要作用正常情况下,CyclinD1 水平在 G 1 期是恒定的, 而 CyclinD1 的过量表达使细胞较容易地通过 G 1 /S 期的限制点, 从而导致肿瘤的发生 CyclinD1 最早是在研究甲状腺癌时发现的由于甲状旁腺激素基因和 CyclinD1 基因在染色体位点上的重排, 其调控序列与 CyclinD1 基因 5 端融合, 驱动了 CyclinD1 的过表达, 改变了 CyclinD1 的正常行为, 引起细胞周期 G 1 /S 期的异常 [4] 改变, 最终导致甲状腺癌的发生有研究报道, B 细胞淋巴瘤的免疫球蛋白重链基因增强子与 bcl-1 基因发生重排, 引起了 CyclinD1 的过表达, 后来 [5] 证实 bcl-1 就是 CyclinD1 基因大量研究显示 CyclinD1 的过表达在肺癌乳腺癌膀胱癌头颈部肿瘤喉癌 B 淋巴细胞瘤肝细胞癌胃肠癌 [6,7] 食道癌子宫癌病例中也有发生, 可见 CyclinD1 的过度表达与许多肿瘤的发生密切相关, 因此人们推断 CyclinD1 基因是一个新的致癌基因 CyclinD1 除了与肿瘤的发生有关外, 还与肿瘤的转移浸润和恶化有关功能性敲除 CyclinD1 可致成纤维细胞在 G 1 期停滞, 不能进入 S 期 ; 在食管癌细胞中转染 CyclinD1 反义核酸, 发现细胞的恶 [8] 性程度明显下降视网膜母细胞瘤蛋白质 (retinoblastoma protein, prb) 基因作为一个抑癌基因, 其活性受 CyclinD1/cdk4 (cyclin dependent kinase 4) 的调控 prb 通过调控 E2F-1 (adenovirus E2 factor-1) 蛋白的活性, 进而影响细胞周期的进程血管内皮生长因子 (vascular endothelial growth factor, VEGF) 基质金属蛋白酶 (matrix metalloproteinase, MMP)-2 和 MMP-9 在肿瘤细胞血管生成过程中发挥重要作用, 与肿瘤细胞的浸润转移密切相关由此可见,CyclinD1 基因作为一个新的致癌基因, 其蛋白与肿瘤的发生发展有着密切的关系那么对 CyclinD1 基因进行表达抑制后, 是否能获得抑制肿瘤发生发展的效果呢? 为了验证这一猜想, 本研究利用反义核酸技术, 构建了 CyclinD1 的反义表达载体 ( 命名为 :pcdna3.1-cyclind1), 将该载体转染肺腺癌细胞, 通过 MTT 法测得细胞生理学报 Acta Physiologica Sinica, June 25, 2011, 63(3): 生长曲线, 用 Annexin V 标记的流式细胞术测细胞凋亡情况, 从而研究 CyclinD1 反义寡核苷酸对肿瘤细胞的生长凋亡的影响, 并通过 Western blot 检测与肿瘤发生发展相关的蛋白表达, 进一步探讨 CyclinD1 反义寡核苷酸作用的相关机制 1 材料和方法 1.1 细胞及试剂本研究所用的人肺腺癌细胞 A549 细胞株质粒 pcdna3.1(+) 载体由本研究所保存 1640 培养基胎牛血清由 Hyclone 公司提供抗 CyclinD1 E2F-1 抗体由 Santa Cruz Biotechnology 公司提供, 抗 VEGF prb MMP-2 和 MMP-9 抗体由 Cell Signaling Technology 公司提供 CyclinD1 反义寡核苷酸由北京赛百盛生物科技有限公司合成 T4 DNA 连接酶 EcoRI 内切酶 HindIII 内切酶均购自 Fermentas 公司, 胶回收试剂盒购自大连宝生物生物技术有限公司 Lipofectamine2000 Reagent kit 购自 Invitrogen 公司,Annexin V 试剂盒购自碧云天生物有限公司 1.2 实验分组根据实验要求, 将 A549 细胞分为空白对照组 ( 不进行任何处理 ) 空载体组 ( 仅转染了载体质粒 ) 和转染组 ( 转染了重组 pcdna3.1- CyclinD1) 1.3 CyclinD1 反义核酸表达载体的构建以人 CyclinD1 外显子 1 为模板, 应用 Primer5.0 软件设计该基因的特异引物, 上游 :5 -GCGGAATTC- CGAGGAACAGAAGTGCG-3 ( 下划线为 EcoRI 酶切位点 ), 下游 :5 -GCGAAGCTTGGAGTTGTCG- GTGTAGATG-3 ( 下划线为 HindIII 酶切位点 ) PCR 扩增 CyclinD1 反义片段, 条件为 :95 C 5 min 预变性后,94 C 45 s,58 C 1 min,72 C 1 min, 连续 30 个循环后,72 C 延伸 10 min 将扩增后的目的片段和 pcdna3.1(+) 载体应用 EcoRI 和 HindIII 进行双酶切, 酶切体系为 :CyclinD1 或 pc DNA3.1(+) 载体 10 µl 10 Buffer R 2 µl EcoRI 和 HindIII 各 2 µl 双蒸水 4 µl, 总体系为 20 µl, 37 C 孵育 6 h 胶回收试剂盒回收目的片段, 具体操作如下 : 首先用锋利的手术刀片对长度为 200 bp 的目的片段进行切割称重, 根据凝胶质量按照 1:3 加入 Extraction Buffer,50 C 孵育 10 min, 加入等体积异丙醇混匀离心清洗, 用干净的 EP 管收集目的基因 T4 DNA 连接酶进行连接, 具体操作如下 :pcdna3.1(+) 载体片段 0.5 µl CyclinD1 目

3 李尊岭等 :CyclinD1 反义核酸诱导肺腺癌细胞 A549 的凋亡 263 的片段 1 µl T4 DNA 连接酶 1 µl 10 Buffer 1 µl 双蒸水 6.5 µl, 总体系 10 µl,22 C 孵育 5 h 对连接产物进行电泳和 PCR 鉴定, 获得阳性克隆, 并测序 ( 由北京拜尔特普生物科技发展有限公司进行 ) 验证连接的正确性 1.4 稳定转染详细操作步骤按照 Lipofectamine 2000 Reagent kit 说明书进行操作, 用 G418 进行筛选 1.5 MTT 测细胞增殖情况取 96 孔板, 接种个细胞, 常规培养 48 h,pbs 洗涤细胞一次, 每孔加 0.1 ml PBS 和 10 μl MTT 染液, 继续培养 6 h, 每孔加 0.1 ml 酸化异丙醇, 在振荡器上振荡混匀, 让还原产物充分溶解置酶联检测仪上测定光密度 (OD) 值, 检测波长 570 nm 1.6 流式细胞术检测细胞凋亡常规培养细胞, 细胞铺满培养皿底面积 80% 左右时,PBS 洗涤 2 次, 应用 Binding buffer 结合并悬浮细胞, 加入 1 μl Annexin V-FITC 混匀后加入 5 μl 碘化丙啶 (propidium iodide, PI) 进行标记, 室温避光反应 5 min, 流式细胞仪测细胞的凋亡实验重复 3 次流式原始记录图中各象限含义为 : 左下角代表没有被 Annexin V 和 PI 染色的活细胞, 右下角代表仅被 Annexin V 染色的凋亡早期细胞, 右上角代表被 Annexin V 和 PI 同时染色的凋亡晚期和坏死的细胞, 左上角代表许可范围内的误差 1.7 Western blot 检测相关蛋白的表达细胞总蛋白应用细胞蛋白裂解液进行提取, 超声 10 s, r/min 离心 20 min 收集上清应用 Bradford 试剂盒进行蛋白定量, 等量的细胞总蛋白进行 12% 的 SDS-PAGE 胶进行电泳转膜封闭杂交, 一抗应用兔抗 CyclinD1 E2F-1 VEGF prb MMP-2 和 MMP-9 抗体, 二抗采用辣根过氧化物酶标记的鼠抗兔抗体,ECL 荧光试剂盒进行曝光显影定影压片每个蛋白重复 3 次, 以目的蛋白和 β-actin 光密度比值作为目的基因的相对表达量 1.8 统计学分析数据采用 mean ± SD 表示采用 SPSS11.0 软件, 应用随机区组方差分析, 组间两两比较应用 SNK 检验 ( 即 Q 检验 ),P < 0.05 时认为差异具有显著性 2 结果 2.1 CyclinD1 反义核酸表达载体的成功构建本研究应用 PCR 的方法, 扩增 CyclinD1 的反义片段, 电泳后在 200 bp 显示有一条带 ( 图 1), 与目的片段大小相吻合, 表明 CyclinD1 反义片段扩增正确 ( 测序结果进行了证实 ) 应用 EcoRI 和 HindIII 对 pcdna3.1(+) 空白载体进行双酶切, 电泳后在 bp 显示单一条带, 且条带整齐, 无弥散和多条带现象, 表明成功对 pcdna3.1(+) 空白载体进行了双酶切 ( 图 1) 应用胶回收试剂盒对以上 CyclinD1 反义核苷酸和 pcdna3.1(+) 的双酶切片段进行回收, 电泳结果显示在 200 bp 和 bp 各有一整齐条带, 表明片段回收正确, 在回收过程中无条带断裂等现象 ( 图 1) 应用 T4 DNA 连接酶对以上回收的目的片段进行连接, 由于电泳的方法较难区分 bp 和 bp 条带, 本实验采用菌落 PCR 的方法对阳性克隆进行鉴定阳性克隆菌落组电泳结果显示在 200 bp 有一整齐条带, 而阴性对照 PCR 扩增后, 电泳结果没有任何条带 ( 图 1), 表明成功构建了 CyclinD1 的反义表达载体 ( 测序也证实了构建的正确性 ) 2.2 CyclinD1 反义核酸促进肺癌细胞凋亡将各组细胞常规培养 96 h 后, 发现转染组细胞出现细胞形态变圆, 体积变小, 贴壁能力和粘附性明显减弱, 细胞连接消失, 细胞漂浮现象严重, 细胞质浓缩细胞核边集, 细胞凋亡现象较明显应用 Annexin V 试剂盒对细胞进行标记, 流式细胞术检测显示转染组细胞凋亡率为 73.21%, 显著高于空白对照和空载体组, 差异具有统计学意义 (P < 图 1. CyclinD1 反义表达载体的鉴定 Fig. 1. Validation of the construction of anti-sense nucleic acid of CyclinD1 expression vector detected by gel electrophoresis. M represents marker; 1 represents the fragment of anti-sense nucleic acid of CyclinD1 (200 bp); 2 represents the fragment of pcdna3.1(+) vector digested by EcoRI and HindIII; 3 represents the purified sample of digested pcdna3.1(+) vector; 4 represents the purified sample of digested CyclinD1; 5 represents DNA sample from negative control group; 6 represents DNA sample from the positive clone.

4 264 生理学报 Acta Physiologica Sinica, June 25, 2011, 63(3): 图 2. 转染 CyclinD1 反义核酸对 A549 细胞凋亡的影响 Fig. 2. Effect of transfection of anti-sense nucleic acid of CyclinD1 on the apoptosis of A549 cells detected by FCM. A: Original recording of FCM. B: Apoptosis rates in different groups. Mean ± SD, n = 3. ** P < 0.01 vs control and empty vector groups. 0.01)( 图 2) 2.3 CyclinD1 反义核酸抑制肺癌细胞增殖细胞生长曲线显示 ( 图 3), 在细胞培养的前 3 天, 各组细胞生长未见明显差异从第 4 天开始, 和对照组与转染空载体组相比, 转染组细胞开始出现明显的增殖抑制现象 (P < 0.01) ; 而对照组和空载体组细胞没有明显的增殖抑制现象, 两组之间没有显著差异 2.4 Western blot 检测目的蛋白的表达与空白对照和空载体组相比较, 转染组 CyclinD1 蛋白的表达明显降低 (P < 0.05), 表明 CyclinD1 反义核酸能够明显抑制 CyclinD1 基因的表达 ; 而空白对照组和空载体组 CyclinD1 蛋白的表达之间无明显差异与空白对照和空载体组相比较, 转染组 prb (P < 0.05) E2F-1 (P < 0.05) VEGF (P < 0.05) MMP-2 (P < 0.05) 和 MMP-9 (P < 0.01) 蛋白的表达都出现了明显下降, 提示了 CylinD1 反义核酸抑制细胞生长, 可能与这些基因表达降低有关 ; 而空白对照组和空载体组的上述蛋白之间无明显差异 ( 图 4) 图 3. 转染 CyclinD1 反义核酸对 A549 细胞增殖的影响 Fig. 3. Effect of transfection of anti-sense nucleic acid of CyclinD1 on the proliferation of A549 cells detected by MTT method. Mean ± SD, n = 3. ** P < 0.01 vs control and empty vector groups.

5 李尊岭等 :CyclinD1 反义核酸诱导肺腺癌细胞 A549 的凋亡 265 图 4. 转染 CyclinD1 反义核酸对 A549 细胞 CyclinD1 prb E2F-1 VEGF MMP-2 和 MMP-9 蛋白表达的影响 Fig 4. Effects of transfection of anti-sense nucleic acid of CyclinD1 on the expressions of CyclinD1, prb, E2F-1, VEGF, MMP-2 and MMP-9 in A549 cells detected by Western blot. Mean ± SD, n = 3. * P < 0.05, ** P < 0.01 vs control and empty vector groups. 3 讨论 CyclinD1 基因定位于 11q13, 有 5 个外显子, 全长 15 kb, 其蛋白质的分子量为 34 kda, 在 N- 端有 E1A E7 和 SV40 抗原共有序列 Leu-X-Cys-X- Glu, 该序列是 CyclinD1 与抑癌蛋白 prb 结合所必 [9] 须的结构域 CyclinD1 与 CDK4/CDK6 形成复合物后, 激活 CDK4 (CDK6), 引起 prb 蛋白的磷酸化, 从而解除 prb 对 E2F 的抑制效应, 启动 DNA 的合成, 使细胞由 G 1 期过渡到 S 期因此 CyclinD1 表达量 [10] 的高低与细胞能否实现 G 1 /S 期转换密切相关 [11] 现已公认 CyclinD1 是一个新的致癌基因正常情况下,CyclinD1 在 G 1 期是恒定的, 其过量表达使细胞很容易通过 G 1 /S 期的限制点, 从而导致肿 [12,13] 瘤的发生本研究利用反义核酸技术, 成功构建了 CyclinD1 基因的反义表达载体, 稳定转染细胞后, 发现细胞的形态明显改变, 细胞间粘附能力降低, 贴壁减弱, 出现明显的凋亡我们进一步观察到下调 CyclinD1 基因表达后, 其下游的 prb E2F-1 蛋白的表达明显降低, 提示 CyclinD1 可以调控其下游 prb E2F-1 的表达 CyclinD1 和 CDK4 形成复合物后, 激活 prb E2F-1 信号通路, 在细胞周期转换, 尤其是 G 1 /S 期转换中发挥着重要作用活化的 prb, 释放 E2F-1 E2F-1 作为基本转录因子, 调控下游基因的表达, 主要是一些 DNA 复制相关的酶细胞周期调控相关蛋白以及 DNA 损伤修复相关酶的表达, 在细胞增殖和凋亡中发挥着重要的作用应用反义核酸技术抑制 CyclinD1 基因表达后, prb E2F-1 信号通路活化受到抑制, 细胞 G 1 /S 期不能顺利转换, 细胞停滞在 G 1 期, 从而抑制细胞的生长血管上皮生长因子 VEGF 基质金属硫蛋白 MMP-2 和 MMP-9 与肿瘤细胞的转移和浸润密切相关 VEGF 作为特异性的血管内皮生长因子, 能够促进血管内皮的增殖, 进而增加肿瘤的营养供应, 促进肿瘤细胞的快速生长另外,VEGF 还可以增加血管的通透性, 导致血浆蛋白外渗, 为肿瘤的转移提供了基质形成因子 MMP-2 和 MMP-9 都是蛋白水解酶, 能够水解血管基底膜和细胞外基质, 从而使得肿瘤细胞易于突破屏障, 促进肿瘤细胞的局部浸润和远处转移 ; 同时 MMP-2 和 MMP-9 也可以促进肿瘤血管内皮的迁移, 参与了肿瘤血管生成的过程本研究通过对血管上皮生长因子 VEGF 金属硫蛋白 MMP-2 和 MMP-9 的检测发现, 下调 CyclinD1 后, 这些蛋白的表达明显降低, 从而降低了肿瘤的浸润和转移的能力, 说明 CyclinD1 反义核酸抑制肿瘤细胞的浸润和转移, 与 VEGF MMP-2 和 MMP-9 的表达降低相关

6 266 综上所述,CyclinD1 作为一个细胞周期调控蛋白, 利用反义核酸技术下调其表达后, 能明显抑制肺腺癌细胞 A549 的增殖浸润和转移因此, 对 CyclinD1 基因的表达抑制可能会成为治疗肺癌的新策略参考文献 1 Eymin B, Gazzeri S, Brambilla C, Brambilla E. Distinct pattern of E2F1 expression in human lung tumours: E2F1 is upregulated in small cell lung carcinoma. Oncogne 2001; 20: Zhong Z, Yeow WS, Zou C, Wassell R, Wang C, Pestell RG, Quong JN, Quong AA. CyclinD1/cyclin-dependent kinase 4 interacts with filamin A and affects the migration and invasion potential of breast cancer cells. Cancer Res 2010; 70(5): Hunter T, Pines J. Cyclins and cancer.Ⅱ: CyclinD and CDK inhibitors come of age. Cell 1994; 79(4): Schwartz MD, Linzer M, Bobbott D, Divine GW, Broadhead WE. The impact of an ambulatory rotation on medical student interest in internal medicine. The Society of General Internal Medicine Task Force on Career Choice in Internal Medicine. J Gen Inter Med 1995; 10(10): Takahashi E, Yamakawa K, Nakamura Y, Hori T. A high-resolution cytogenetic map of human chromosome 3: localization of 291 new cosmid markers by direct R-banding fluorescence in situ hybridization. Genomics 1992; 13(4): Li X, Hao Z, Fan R, Zou X, Jin H, Pan Y, He L, Du R, Gao L, Liu D, Fan D. CIAPIN1 inhibits gastric cancer cell prolifera- 生理学报 Acta Physiologica Sinica, June 25, 2011, 63(3): tion and cell cycle progression by downregulating CyclinD1 and upregulating P27. Cancer Biol Ther 2007; 7(4): Sanda T, Asamitsu K, Ogura H, Lida S, Utsunomiya A, Ueda R, Okamoto T. Induction of cell death in adult T-cell leukemia cells by a novel IkappaB kinase inhibitor. Leukemia 2006; 20(4): Yan KX, Liu BC, Shi XL, You BR, Xu M. Role of cyclind1 and CDK4 in the carcinogenesis induced by silica. Biomed Environ Sci 2005; 18(5): Shah MA, Schwartz GK. Cyclin-dependent kinases as targets for cancer therapy. Cancer Chemother Biol Response Modif 2005; 22: Li Z, Shao S, Xie S, Jiao F, Ma Y, Shi S. Silencing of CT120 by antisense oligonucleotides could inhibit the lung cancer cells growth. Irish J Med Sci 2010; 179: Xiang M ( 向敏 ), Xu YJ, Liu XS, Zeng DX. Cyclin D1 is involved in human pulmonary artery smooth muscle cells proliferation and migration induced by cigarette smoke extract. Acta Physiol Sin ( 生理学报 ) 2010; 62 (2): (Chinese, English abstract). 12 Russo G, Zamparelli A, Howard CM, Minimo C, Bellan C, Carillo G, Califano L, Leoncini L, Giordano A, Claudio PP. Expression of cell cycle-regulated proteins prb2/p130, p107, E2F4, p27, and pcna in salivary gland tumors: prognostic and diagnostic implications. Clin Cancer Res 2005; 11(9): Senderowicz AM. Inhibitors of cyclin-dependent kinase modulators for cancer therapy. Prog Drug Res 2005; 63:

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽