第 卷第 期 年 月 西安交通大学学报 医学版!" #$# # %&'& & 临床研究 在急性髓系白血病骨髓细胞中的异常表达及意义 黄 婷 杨桂玲 南昌大学第二附属医院血液科 江西省血液重点实验室 中国人民解放军第九四医院 江西南昌 摘要 目的 分析急性髓系白血病 #$% 患者骨髓细胞中 &' 的表

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1 第 卷第 期 年 月 西安交通大学学报 医学版!"#$## %&'& & 临床研究 在急性髓系白血病骨髓细胞中的异常表达及意义 黄 婷 杨桂玲 南昌大学第二附属医院血液科 江西省血液重点实验室 中国人民解放军第九四医院 江西南昌 摘要 目的 分析急性髓系白血病 #$% 患者骨髓细胞中 &' 的表达情况及其在白血病发生发展中的可能作用及临床意义 方法 应用实时荧光定量 检测 例初治 #$% 患者 例完全缓解期 #$%#$% 患者 例难治复发患者 例非血液肿瘤患者及健康人骨髓中 &' 的表达水平 并分析 #$% 患者 &' 的表达水平与临床指标的相关性 结果 &' 在 #$% 中的表达是上调的 初治组 完全缓解组及难治复发组 &' 的表达水平均高于对照组 完全缓解组 &' 的表达量较初治组有所下降 难治复发组 &' 的表达量高于初治组 但两组间无统计学意义 初治 #$%&' 表达水平与骨髓原始幼稚细胞数呈正相关 与外周血白细胞数 血小板计数 血红蛋白含量以及年龄 性别 染色体异常等均无明显相关性 结论 &' 在急性髓系白血病患者骨髓细胞中的表达上调 并与肿瘤负荷相关 可能在白血病的发生发展中起重要作用 并有望成为白血病诊断的新的分子标志物 关键词 急性白血病 &' 骨髓细胞 实时荧光定量 分子标志物中图分类号 文献标志码 # (!"#$%%&'&!"%!&""&!$!%!%%! )*#+, -'. /#+,,!'0'. 1"&")"&0."" #'0'")'0+.* '2"' 3"%)"&0.' 4'.'2'" +()'0%#+.' ()*+* ( ) * ## +!!',*# "-.!/"#"#### "".!/&(0#1, 0(1, *"(.!/#"** "".!/.!/ *#,#.!/"#) *&")* ("##& ( *".!/" ( *#,"# ## && (,** &*# # )*#"# &&( "#*))*#&) )#*)"-## # )# "#) && (# ") * #.!/ "#" *)" ""# ( )" ".!/"#)"* #-"##&,-. /) #- ()*#((1,#- 收稿日期 5 修回日期 通讯作者 杨桂玲 6&'0((577& 优先出版 8'"8&"'0(((&0(

2 期 黄 婷 杨桂玲 $'+# 在急性髓系白血病骨髓细胞中的异常表达及意义 (( $'+#&'+# 是一类长约 5 个核苷酸的 参与转录后基因调控的内源性非编码单链小 +# 分子 通过碱基互补配对的方式识别靶基因 &+#9 端非翻译区 9*- 抑制翻译或降解 靶标 &+# 而调节基因的表达 研究发现 &'+# 在正常血细胞分化过程中发挥着重要作用 并参与细胞增殖与凋亡 造血生成等生物学过程 推测 &'+# 的异常表达可能与血液系统疾病的发生 发展密切相关 &' 是一个典型的 &' 在肺癌 胰腺癌 结肠癌等多种恶性肿瘤中高表达 其 表达水平与疾病分期 远处转移和预后密切相关 研究报道 &' 在白血病 3 细胞中的表达量增高 且靶向 &' 的反义核酸可使白血病 3 细胞生长受抑制并诱导其凋亡 但是 目前国内外关于 &' 与白血病的关系多由体外实验得出 急性白血病患者骨髓中 &' 表达情况及作用机制尚不明确 本研究通过检测急性髓系白血病 #$% 患者骨髓细胞中 &' 的表达 并与临床指标进行相关性分析 探讨其在白血病发生发展中的可能作用 为将来白血病的临床诊断及治疗提供可靠的理论和实验依据 对象与方法 研究对象 收集 年 月 年 月南昌大学第二附属医院收治并诊断明确的 #$% 患者骨髓细胞 例 其中男 ( 例 女 例 年龄 岁 中位年龄 5 岁 包括初治患者 例 难治复发患者 例 完全缓解期 &0"""&'' 患者 例 所有患者均符合 :#; 国际分型诊断标准 且同意使用其骨髓标本用于研究并签署知情同意书 例健康骨髓捐献者和非恶性血液病患者骨髓作为正常对照组 本课题所涉及的 #$% 的治疗方案与疗效判定参照张之南主编的 血液病诊断及疗效标准 第三版 0 标本采集及骨髓单个核细胞 (+ 的分离 按常规无菌操作行骨髓穿刺术 取患者及对照者新鲜骨髓液 &% 放入 61-# 抗凝管中 用 ; 稀释 淋巴细胞分离液 :'0 密度梯度离心法分离获得 ;$$+ 适量红细胞裂解液去除残留的红细胞 ; 洗涤 次后留取沉淀 单个核细胞 加入 &% -'0 振荡混匀 充分裂解细胞 直接提取总 +# 或于 5 保存备用 01 总 的提取及鉴定 按 -'0 美国 2'." 公司产品 试剂产品说明书进行 ;$$+ 总 +# 提取 16 水溶解 琼脂糖凝胶电泳检测 +# 完整 性 紫外线分光光度计测定总 +# 的浓度 纯度 ##5 值为 5 者为合格样品 0& 逆转录反应 按 -3 公司 1+# 逆转录试剂盒 5 说明 进行多聚 # 尾逆转录过程 反应体系为 &'+#"'!"$'%&' +#'&"'-6&"$'%+":"") % 总 +#%-0% 反应条件为 &' 5 逆转录后 1+# 中用 +""") 补到 % 保存 0 实时荧光定量 + 检测 & 的表达 -3 公司试剂盒 5 已提供 通用引物和成品内参 * 应用 /;'&"6< 进行 扩增反应 由美国 #; 公司的 型 "0 -'&" 扩增仪完成 同一样本分别进行 &' 和 * 的扩增反应 并设 个复孔及空白对照 不加 1+# 模板 &' 正义引物序列 =,,-#,--#- #,#-,#-,= 反应体系为 /;'&"6< % 通用正义引物 % 正义引物 %< """"1"%) 5%1+#% -0% 反应条件为 预变性 ( 反应 ( 个循环 琼脂糖凝胶电泳判定 产物 0& 相对表达量的计算 读取 &' 和 * 的 值 用公式 计算目的基因 &' 的相对表达量 值 > 目的基因 值 内参基因 值 0 统计学处理 采用 统计软件分析 连续型变量资料不符合正态分布 各组数据间差异的比较采用 $?'" 检验 用中位数和四分位数表示非正态计量资料 采用 "& 秩相关法进行相关性分析 为差异有统计学意义 结 果 0& 的扩增结果 实时荧光定量 扩增效果好 所有患者骨髓标本所测 &' 及 * 内参的 - 值均在 以下 溶解曲线呈单峰 无非特异性扩增 图 0+ 产物电泳结果 电泳可见 &' 产物 * 产物在 左右 图 扩增产物未见明显杂带 符合要求 01 各组样本 & 的表达水平 采用 $?'" 检验的方法进行各组间的比较 各组 &' 表达水平的中位数及四分位数统计结果见表 结果表明 &' 在急性白血病中的表达是上调的 初治组 完全缓解组及难治复发组的表达水平均高于对照组且有统计学意义 结合图 可以

3 西安交通大学学报 医学版 第 卷 胞数 血小板计数 血红蛋白含量无明显统计学意义 表 图 1& 在各分组之间的表达水平 图 & 及 的扩增曲线及熔解曲线 :'.#&0'''!2"&"0'.!2"&' * # 分别为 &' 的扩增曲线及熔解曲线 ;1 分别为 * 的扩增曲线及熔解曲线 :'.-"""' &'' ".! 表 初治 2 患者 & 的表达与临床指标的相关性 --""0' """ "0"2"0&'0'' 0''' '''0#$%'" 四分位数 "& 临床指标 值 相关系数骨髓原始幼稚细胞 5 5 白细胞数 ( 5 血红蛋白含量 5 5 血小板计数 5 图 + 扩增产物的电泳结果 :'.-""0""'"!0! $&8"* 空白对照 完全缓解组 &' 难治复发组 &' 初治组 &' 表 各组样本 & 的表达水平与比较 -&' """' &'' 0.! &' 相对表达量 四分位数 组别例数 值 初治组 5 完全缓解组 5( 难治复发组 (( 正常对照组 5 5 ( 与完全缓解组 正常对照组比较 均 与其他 组比较 均 与完全缓解组 正常对照组比较 均 发现化疗缓解组 &' 的表达量较初治患者有所下降 差异有统计学意义 难治复发组 &' 的表达量高于初治组 但两组间无统计学意义 0 初治 2 患者 & 表达与临床指标的相关性 初治 #$% 患者 &' 表达水平与骨髓原始幼稚细胞数呈正相关 与患者外周血白细 0 初治 2 患者 & 表达与年龄 性别及染色体核型的相关性 将初治 #$% 患者按性别及年龄 岁为界各分为两组 采用 $?'" 检验的方法进行各组间 &' 表达的比较 结果未发现初治 #$% 患者 &' 表达与年龄 性别存在相关性 &' 在各组间的表达差异无统计学意义 在 例初治 #$% 患者中 例获得了可供分析的染色体核型 按照?, 分型标准 预后差组 例 包括 例 ( 例 例复杂核型 预后良好组 例 包括 例 例 5 例 '2 预后中等组 例 包括正常核型和其他染色体异常 采用 $?'" 检验的方法进行 组间 &' 表达的比较 结果未发现初治 #$% 患者 &' 表达与染色体预后分组存在相关性 &' 在 组间的表达差异无统计学意义 表 1 讨 论白血病是血液系统最常见的恶性疾病 随着人口老龄化 其发病率逐年升高 急性白血病 #% 起病急 自然病程短 严重威胁着人类的生存和健康 虽然随着新型化疗药物的不断出现及干细胞移植技术的

4 期 黄 婷 杨桂玲 $'+# 在急性髓系白血病骨髓细胞中的异常表达及意义 表 1 初治 2 患者 & 的表达与年龄 性别及染色体核型的相关性 --""0' "0"2"0&' '".".""8"' '''0#$%'" 临床指标 性别 例数 &' 中位表达量 男 ( 女 ( 年龄 岁 ( 5(?, 核型分型 预后良好 (5 预后中等 ( 预后差 各组间比较 不断进步 其疗效有了显著提高 但部分 #% 治疗反应差 复发及继发耐药仍是目前白血病研究的重点和难点 目前 国内外对 &'+# 的研究进展很快 文献证实 &'+# 参与造血干细胞的成熟分化 其差异性表达与血液系统疾病的发生和发展密切相关 可通过调控某些癌基因或抑癌基因参与恶性血液病的 5 发生 &' 是一个典型的致癌性 &'+# 被证实在多种实体肿瘤和血液系统肿瘤中高表达 其通过调控多个抑癌基因和凋亡相关分子 如 -6+1 ( 163-'" 等促进肿瘤的形成及转移 目前 已发现多种与白血病相关的 &'+# 其中关于 &' 的研究逐渐增多 研究报道 &' 在白血病细胞株 3 中的表达水平异常增高 同时 设计靶向 &' 的反义寡核苷酸可有效抑制白血病 3 细胞的生长 并显著促进其凋亡 说明 &' 参与白血病的发生发展 并可作为治疗白血 病的一个作用靶点 吴共发等通过转染 &' 抑制物抑制 &' 表达 检测细胞的迁移和增殖变化 表明抑制 &' 表达不仅能诱导白血病细胞凋亡和增加白血病细胞对化疗药物的敏感性 还能抑制白血病 3 细胞的迁移和增殖能力 并初步探讨其中机制与 &' 调节抑癌基因 -6+ 的表达有 关 ;# 等亦证明 &' 可通过抑制 -6+ 表达 激活 3#3- 通路诱导白血病 3 细胞对柔红霉素!!'' 1+ 的耐药 而抑制 &' 则可增强 1+ 对 3 细胞的毒性作用 综上所述 &' 可能成为白血病诊断的心得分子标志物和治疗及预后评估的分子靶点 鉴于白血病依赖于形态学 免疫学及分子遗传学等的诊断方法都需完善骨髓穿刺 骨髓标本易获得且 较易被患者接受 检测 #% 患者骨髓中 &'+# 的表达 将成为白血病诊断 治疗及预后评估的有利手段 目前 关于 #% 患者骨髓细胞中 &' 表达水平检测及与临床指标相关性的研究尚未见报道 本研究采用实时荧光定量 方法检测 #$% 患者骨髓细胞中 &' 的表达情况及与临床指标的相关性 结果表明不同分组间 &' 的表达水平有显著差异 初治组 完全缓解组及难治复发组的表达水平均高于对照组 并有统计学意义 对初治 #$% 患者化疗前后 &' 表达量研究发现 化疗后获得 的患者 &' 的表达量较初治患者有所下降 但仍高于正常对照组 差异有统计学意义 难治复发组 &' 的表达量高于初治组 但两组间无统计学意义 有待进一步加大样本量进行研究 这些结果表明 &' 不仅在 #$% 中普遍存在过表达 且其表达水平与疾病状态有关 提示 &' 的过表达参与了 #$% 的发生发展过程 等报道 &' 在慢性淋巴细胞白血病 %% 中过表达并与 %% 患者生存时间负相关 可用于染色体 缺失的 %% 患者早期存活率分层 另有研究表明 &' 的表达水平与多发性骨髓瘤 $$ 瘤细胞负荷呈正相关 并通过相关性分析证实 &' 与 $$ 的发生发展和疾病预后有密切关系 可作为诊断 $$ 的新标志物及判断 $$ 患者 5 预后不良指标之一 本实验通过分析 &' 表达与一些临床指标的相关性 我们发现 &' 表达水平与骨髓原始幼稚细胞数呈正相关 而与患者年龄 性别 外周血白细胞数 血小板计数 血红蛋白含量等因素无明显相关 目前 认为在 #$% 的预后因素中 最有意义的是染色体的异常 本实验分析了 &' 表达水平与?, 的染色体预后之间的关系 未发现初治 #$%&' 表达与染色体预后分组存在相关性 由于本实验尚有不足 限于时间 标本数量等限制 且实验方法单一 在 #% 的发病中 &' 是作为一个独立的影响因素来发挥作用 还是联合其他致病因素一同作用的 有待后续进一步的研究 本研究初步证实 &' 与 #$% 的疾病状态 骨髓原始幼稚细胞等相关 参与 #$% 的发生发展和预后 可能成为白血病诊断的新的分子标志物和治疗及预后评估的分子靶点 本研究可为将来探索白血病的诊断 治疗及预后评估提供理论依据和新思路 参考文献 $..+//.23!&!#'."" "&15(55&

5 西安交通大学学报 医学版 第 卷,./2' 4.$%24'.'2,!2,&5 #'.0 #""( #"##&1#'.#"$# $.((((& $/,6/$7'745!$12//.',&( - ###&+#$# (1(5((&!/ 4474(2//2.!!11./.$ &,#(") " ####&+## 5((& 张帅 王萍玉 尹娟 等 &( 在白血病发病过程中的作用研究 & 滨州医学院学报 ((& 郭敏 李育敏 费嘉 等 & 以 #'.( 为靶标的反义寡核苷酸对人白血病 6 细胞的抑制作用 & 中国病理生理杂志 ((& 吴共发 黄绮亭 曾宇婷 等 &( 通过 1'.6 通路抑制白血病细胞 6 的迁移和增殖 & 医学研究生学报 (& 5/.2,5&!#'.##& +"*(& (6!.$.! %7/6!.''25! & "#'.(""&'.+( 5(& #" 1,&1#(.(& / 8,5' &!#'.((( #" ) 1',6"+#(0##( 49,,&1$7(5(5&.':.'41.'4&!#'.( (#) "# &,;(& 5.!235.!2!'5.!.2.&"( #'.# "-&24# ;,#;((& 7'.6 6!' '.&!2'.."))--&2 ((5& +.25,.78&2(( #")#) 1'( -6#&3+$/5(5& 7$$2$$52!28!+.+.77&#'.,//*#"( " (# &+" (((& 王金行 周雯雯 刘柏新 等 & 多发性骨髓瘤患者外周血 ( 的表达与意义 & 现代肿瘤医学 (5(((& 5/7'!7//22!.2'7!&,5.2.'4' 7$12'.(127$!7./$(12( () " # 7!&!(")#) ( * &,,#(5((& 1'"" 编辑 卓选鹏 上接第 5 页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编辑 国 荣

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