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1 計畫編號 :DOH97-DC-2004, DOH98-DC-2012, DOH99-DC-2028 行政院衛生署疾病管制局 年度科技研究發展計畫 鼠類及其外寄生節肢動物病原體監測整合型計畫 ( ) (!) 全程研究報告 執行機構 : 疾病管制局計畫主持人 : 慕蓉蓉研究人員 : 王錫杰 舒佩芸 王琇儀 邱詩惠 李沛龍 高英訓 林穎君 林文珍 姜佩芳執行期間 : 97 年 1 月 1 日至 99 年 12 月 31 日 * 本研究報告僅供參考, 不代表本局意見, 如對外研究成果應事先徵求本局同 意 * 1

2 目 錄 一 圖次 3 表次 4 二 摘要 : 中文摘要 5 英文摘要 7 三 本文 ( 一 ) 前言 9 ( 二 ) 材料與方法 16 ( 三 ) 結果 31 ( 四 ) 討論 42 ( 五 ) 結論與建議 50 ( 六 ) 計畫重要研究成果及具體建議 52 ( 七 ) 參考文獻 54 ( 八 ) 圖 64 表 87 2

3 圖次 圖一 鉤端螺旋體菌 16S 序列親緣關係圖 64 圖二 萊姆疏螺旋體菌 5S-23S 序列親緣關係圖 65 圖三 莫拉克風災鉤端螺旋體疫情人體與環境檢體之序列親緣關係圖 66 圖四 連江縣斑點熱立克次體 OmpB 部分序列親緣關係圖 67 圖五 連江縣斑點熱立克次體 glta 部分序列親緣關係圖 68 圖六 金門縣斑點熱立克次體 OmpB 部分序列親緣關係圖 69 圖七 金門縣斑點熱立克次體 glta 部分序列親緣關係圖 70 圖八 澎湖縣斑點熱立克次體 OmpB 部分序列親緣關係圖 71 圖九 澎湖縣斑點熱立克次體 glta 部分序列親緣關係圖 72 圖十 宜蘭縣斑點熱立克次體 OmpB 部分序列親緣關係圖 73 圖十一 宜蘭縣斑點熱立克次體 glta 部分序列親緣關係圖 74 圖十二 花蓮縣斑點熱立克次體 OmpB 部分序列親緣關係圖 75 圖十三 花蓮縣斑點熱立克次體 glta 部分序列親緣關係圖 76 圖十四 台東縣斑點熱立克次體 OmpB 部分序列親緣關係圖 77 圖十五 台東縣斑點熱立克次體 glta 部分序列親緣關係圖 78 圖十六 桃園縣斑點熱立克次體 OmpB 部分序列親緣關係圖 79 圖十七 桃園縣斑點熱立克次體 glta 部分序列親緣關係圖 80 圖十八 台中縣斑點熱立克次體 OmpB 部分序列親緣關係圖 81 圖十九 台中縣斑點熱立克次體 glta 部分序列親緣關係圖 82 圖二十 高雄屏東斑點熱立克次體 OmpB 部分序列親緣關係圖 83 圖二十一 高雄屏東斑點熱立克次體 glta 部分序列親緣關係圖 84 圖二十二 洛磯山革蜱 (Dermacentor andersoni) 85 圖二十三 金門縣鼠類外寄生節肢動物季節消長 86 3

4 表次 " #$% & ' ( ) * (+, -) 87 " #$% & ' ( ) * (+. / -) 88 " 0 #$% & ' (+. / -) 89 " 7 #$% & ' (+, -) 90 " 8 # > 99 9 : ;< = ( "? #$% & A 6(+. / -) 92 " B #$% & A 6(+, -) 93 " C #$% & ' D E 4 5 6(+. / -) 94 " F #$% & ' D E 4 5 6(+, -) 95 " G #$% & ' HI J K L 96 " G # > 99 9 : ;< = ( HI J K L 97 " G #$% & ' HI 4 5 D E 98 " G 0 #MN O P Q R 99 " G 7 # 1 2 S T U (+. / -) 100 " G8 # 1 2 S T U (+, -) 101 " G? # & V S W X Y (+. / -) 102 " G B # & V S W X Y (+, -) 103 " GC # Z[ Rickettsia \ PCR L (+. / -) 104 " G F # Z[ Rickettsia \ PCR L (+, -) 105 " G # ] Rickettsia \ PCR L 106 " G # ^_ Rickettsia \ PCR L 107 " G # ` a Rickettsia \ PCR L 108 " G 0 # b c Rickettsia \ PCR L 109 " G 7 # d: ;e f g h i j k l m nl * o 110 " G8 # p q r[rickettsia\ st R u vvv 4

5 摘要關鍵詞 : 鼠類 鉤端螺旋體病 萊姆病 Rickettsia 屬立克次體 即時定量聚合酶連鎖反應 親緣樹狀圖演化分析 在 95 年至 99 年於離島連江縣 金門縣 澎湖縣, 東部宜蘭縣 花蓮縣 台東縣及西部桃園縣 台中縣 高雄縣 屏東縣共進行 22 次的調查, 共捕獲鼠類 10 種共 1375 隻, 其中以小黃腹鼠數量最多 751 隻佔 54.62%, 錢鼠其次 183 隻佔 20.58% 血清鉤端螺旋體總抗體陽性率 27.8% (313/1126), 腎臟中鉤端螺旋體帶菌 22.5%(268/1190), 經親緣樹狀圖分析均隸屬致病性鉤端螺旋體 其中金門縣鼠類鉤端螺旋體盛行率及帶菌率為最高 鼠腎檢體培養鉤端螺旋體菌株共 45 株, 總培養陽性率 4.9% 本計畫建立之鉤端螺旋體分子偵測法成功應用於 98 年莫拉克風災檢驗,152 個個案,6 個血液中以 real-time PCR 偵測出鉤端螺旋體病原, 環境檢體也檢驗出致病性鉤端螺旋體菌 粒形硬蜱中萊姆疏螺旋體菌總感染陽性率 49%, 並由一鼠耳檢體培養出疾管局第一個本土萊姆疏螺旋體菌 所有萊姆疏螺旋體序列經親緣樹狀圖分析均近似 Borrelia valaisiana-related 在 Rickettsia 屬立克次體檢測部份, 採集之 1283 隻鼠類血清以 3 種立克次體抗原玻片 (Rickettsia rickettsii R. conorii 和 R. typhi) 進行血清學檢測 結果發現小黃腹鼠斑點熱立克次體抗體陽性率離島 東部 西部分別為 94.5% 94.4% 及 94.8%, 非常相近 ; 所有鼠種地方性斑疹傷寒立克次體抗體陽性率以離島最高為 3.42%, 其次為西部 1.89%, 東部最低為 1.53%, 顯示台灣離島野外鼠類感染地方性斑疹傷寒立克次體有偏高的現象 鼠類本身及其外寄生節肢動物是否帶有 Rickettsia 屬立克次體, 取其鼠類內臟以 kda surface antigen (ompb) 及 citrate synthase (glta) 為基因標的進行 Rickettsia 屬立克 5

6 次體 nested-pcr 檢測, 離島 東部 西部鼠類脾肝腎臟中平均偵測出 Rickettsia 屬立克次體的比例為 61.1% 70.4% 及 49%, 顯示這些野外鼠類皆有成為 Rickettsia 屬立克次體傳染窩 (reservoir) 的可能性 而 Rickettsia 屬立克次體在採自台灣地區蜱 恙蟎 跳蚤及厲蟎的 nested-pcr 的陽性率分別為 31.9% 37.4% 26.9% 及 20.7% PCR 於台中縣採獲之板齒鼠血蜱及嗜龜花蜱 (Amblyomma geoemydae) 及台東採獲的粒形硬蜱分別培養出斑點熱立克次體, 經由幾個重要的基因如 ompa 及 ompb 與目前已知斑點熱立克次體菌株序列不同, 研判為三株新的斑點熱立克次體菌株序列 所有檢測出之 500 株 Rickettsia 屬立克次體菌株序列進行親緣關係分析, 結果可分成 10 群, 其中以近似 R. conorii 的菌株最多, 佔 37.43%, 其次為近似 Rickettsia sp. MB74-1 的菌株, 佔 22.91% 本研究顯示萊姆疏螺旋體菌及 Rickettsia 屬立克次體可透過這些鼠類體外節肢動物在鼠類間循環, 甚至可能傳給人類 6

7 Abstract Keywords: rodent, leptosiprosis, lyme disease, Rickettsia, real-time PCR, phylogenetic analysis Rodent trapping and ectoparasite collection were conducted twenty-two times from 2006 to 2010 in Lienchiang, Kinmen, Penghu, Yilan, Hualian, Taitung, Taoyuan, Taichung and Kaohsiung-Pingtung (Kaoping). A total of 1375 rodents were collected. Rattus losea was mostly trapped, with capture rate 54.62%. The total seroprevalence rate of leptospirosis is 27.8% (313/1126) and the infection rate is 22.5% (268/1190). Kimen county has the highest rate for both seroprevalence and infection among the counties. There are 45 isolates obtained from kidney culture, the cultural rate is 4.9%. The phylogenetic analysis showed all the leptospira sequences belong to pathogenic leptospira. The molecular method applied in clinical diagnostic during the typhoon Morakot hit in August 2009, 6 out of 152 cases were identified as confirmed cases by using real-time PCR. The environmental samples were also detected using the same method. For lyme borrelia detection, the infection rate of Borrelia in Ixodes granulatus is 49%, the first Borrelia isolate in Taiwan CDC was cultured from a rodent ear. The sequences from ticks and a rodent ear are related to Borrelia valaisiana-related genospecies. The rodent sera were challenged to detect IgG against Rickettsia rickettsii, R. conorii and R. typhi antigens with immunofluorescent antibody test (IFA). The seropositive rates of R. losea against R. rickettsii or R. conorii in remote islands, eastern part and western part of Taiwan were 94.5%, 94.4% and 94.8%, respectively, and the seropositive rates of rodents against R. typhii were 3.42%, 1.53% and 1.89%, respectively. This revealed that R. losea, the locally dominant 7

8 wild rodent species in these areas, was severely infected with spotted fever rickettsia. To detect the rickettsia infection in rodents, spleens, livers, kidneys were examined by nested-pcr with kda surface antigens (ompb) and citrate synthase (glta) as gene targets. Average PCR positive rates for spleens, livers and kidneys were 61.1%, 70.4% and 49%, suggesting rodents might be the reservoirs of spotted fever rickettsia in these three areas. The PCR positive rates for rickettsia ompb and glta were 37.4% 30.5% 26.9% and 20.7% in ticks, trombiculi mites, fleas, and Laelaps spp. respectively. Three novel species of spotted fever group rickettsiae, were identified and isolated from adult Haemaphysalis bandicota, Amblyomma geoemydae and Ixodes granulatus ticks collected from Taichung County and Taitung County. Pairwise nucleotide sequence analysis of ompb and ompa shows that these three strains belonged to spotted fever group rickettsiae. All 500 PCR positive samples were also sequenced and could be divided into 10 phylogenetic groups. Most sequences are closely related to R. conorii (37.43%), followed by Rickettsia sp. MB74-1 (22.91%). These results suggest lyme borrelia and spotted fever rickettsia might therefore be transmitted among rodents by ectoparasites, and humans could also be infected. 8

9 前言 在人類所豢養的動物如狗 貓 雞 鴨等以外, 鼠類是與人類生活最接近的小型哺乳動物, 其生活的適應性強, 取食廣, 且具機敏性, 極適合人類的居住環境, 所以不論是居家 辦公廳舍 倉庫或廠房都可見到他們的蹤影 有些鼠類習慣棲息於屋內外四週如溝鼠 (Rattus norvegicus) 屋頂鼠(R. rattus) 家鼷鼠(Mus musculus) 及錢鼠 (Suncus murinus), 或棲息於居家附近的農耕地及草地如小黃腹鼠 (R. losea) 鬼鼠(Bandicota indica) 赤背條鼠(Apodemus agrarius) 田鼷鼠 (Mus caroli), 而有些則已登堂入室成為寵物如楓葉鼠 (Phodopus sungorus) 黃金鼠 (Mesocricetus auratus) 花栗鼠(Tamias sibiricus) 及天竺鼠 (Cavia porcellus) 等 鼠類的繁殖能力很強, 根據估算亞熱帶地區鼠口約為人口之四倍, 以台灣二千三百萬人口計算, 鼠口即超過九千萬, 因此其每年所消耗的糧食損失實在難以估計 ( 王正雄,1999) 鼠類所帶來的危害還不僅於此, 更重要的是疾病的傳播 鼠類為許多人畜共通傳染病的儲主 (reservoir), 這些病原可經由鼠糞或鼠尿直接傳染給人類, 如沙門氏菌病 (Samonellosis) 鉤端螺旋體病(Leptospirosis) 漢他病毒出血熱 (Hanta virus) 原蟲病 絛蟲病 ; 或直接經由鼠咬傳染, 如鼠咬熱 (Rat-bite fever); 另可經由老鼠身上的外寄生節肢動物來傳播, 如鼠蚤傳播鼠疫 (Plaque) 地方性斑疹傷寒 (Murine typhus) ; 鼠蟎傳播恙蟲病 (Scrub typhus) 立克次體痘 (Rickettsial-pox); 鼠蜱傳播 Q 熱 (Q fever) 萊姆病(Lyme disease) 巴比西亞原蟲症 (Babesiosis) 等 ( 王和林,1995) 台灣地區近幾年與鼠類相關的傳染病都具有相當的病例數, 年恙蟲病確定病例數分別為 例 ;Q 熱為 例 ; 地方性斑疹傷寒為 例 ; 漢他病毒出血熱在 95 年有 3 例,96 及 97 年各有 1 例 中國大陸為國人經常往來旅遊 探親及商務的地點, 自從兩岸開放小三通, 往來更是頻繁 根據行政院大陸委員會統計, 國人於 95 9

10 年前往大陸探親旅遊商務的人數高達 400 萬人次, 而大陸各地衛生情況不一, 經鼠傳播的疾病相當嚴重, 如 96 年漢他病毒出血熱 9,227 例 鉤端螺旋體病 865 例 斑疹傷寒 2,441 例 ( 未具名,2009), 前年 (96 年 )6 月洞庭湖地區甚至發生十年來最嚴重的鼠患 鼠類同時會直接傳播許多新興之人畜共通傳染病, 如拉薩熱 (Lassa fever) 淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎 Lymphocytic choriomeningitis(lcm) 南美沙狀病毒 (South American Arenaviruses) 及兔熱病 (Tularemia) 淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎雖主要由家鼷鼠傳播, 但美國有多次的疫情爆發是經由寵物鼠 (CDC, 2005; Amman, 2007) 另外由鼠類可間接傳播的新興人畜共通傳染病如科羅拉多壁蝨熱 (Colorado tick fever) 人粒細胞無形體病 (Human granulocytic anaplamosis) 波瓦桑病毒腦炎(Powassan virus encephalitis) 及斑點熱立克次體病 (Spotted fever rickettesiosis) 等 鉤端螺旋體病是由鉤端螺旋體 (Leptospira spp.) 感染引起的重要的人畜共通傳染病 (Levett, 2001) 人類感染重症描述最早見於 1886 年德國醫師 Adolf Weil 在急性腎衰竭的病人身上觀察到的脾腫大 黃疸及腎臟炎等臨床表現 (Faine, 1994; Weil, 1886) 近年來, 在尼加拉瓜 (Brandling-Bennett, 1996) 阿根廷 (Seijo et al., 2002) 秘魯(Johnson et al., 2004) 巴西 印度(Chaudhry et al., 2002) 東南亞 (Laras et al., 2002) 美國 (CDC.1998, 1998) 與馬來西亞 (Sejvar et al., 2003) 等地爆發鉤端螺旋體病之重大疫情, 令此病成為受到矚目的再現傳染病 (re-emerging infectious disease) 鉤端螺旋體為細桿狀螺旋型 兩端呈鉤狀具內鞭毛的高運動性螺旋體, 其最佳生長溫度為 28 o C 到 30 o C, 可以在潮溼的環境中存活很長的時間 (Trueba et al., 2004) 目前, 全球已知的鉤端螺旋體約有兩百多種 (Morey et al., 2006): 10

11 可應用基因分型方法將其分為 16 種基因型 (genomospecies), 依照致病性分為 3 大群 : 致病型 (pathogens) 中間型 (intermediate) 腐生型 (saprophytes); 血清型的分類則常用交叉凝集吸收測試 (cross agglutination absorption test); 另外, 亦可利用 16S ribosomal RNA gene 進行序列比對及親緣樹狀圖演化分析 (phylogenetic tree analysis), 以確定分離菌株的親緣關係 (Matthias et al., 2005) 鉤端螺旋體可經由傷口或黏膜組織感染幾乎所有哺乳類 鼠類 狗 牛 豬等為保菌宿主 (reservoir hosts), 造成腎臟慢性感染, 並且由尿液長時間持續地大量排菌, 污染水或環境 人類或其他動物為意外感染宿主 (incidental hosts), 經由接觸受鉤端螺旋體污染的水或環境而感染, 但病情較嚴重, 排菌期卻較短 ( 行政院衛生署疾病管制局, 2002) 鼠類被認為是鉤端螺旋體病的重要保菌宿主, 也扮演重要的傳播角色 (Faine, 1994) 如 Saravanan et al. 研究顯示, 病患住所周圍的鼠隻分離鉤端螺旋體, 其血清型常和病患血清抗體吻合 (Saravanan et al., 2000) Vinetz et al. 研究也顯示, 鉤端螺旋體病患可能因暴露於住家附近遭鼠尿污染的環境而罹病, 調查發現病患住家附近捕獲的 21 隻溝鼠中, 以 PCR 檢測,19 隻的腎臟組織呈陽性, 故推論都市區鼠類族群鉤端螺旋體帶原率與居民罹病的機率有極大的相關性 (Vinetz et al., 1996) 台灣地區野鼠帶有鉤端螺旋體是在 1966 年 Yeh 和 Young 從台北市近郊捕捉野鼠, 由腎臟組織中分離出 Javanica 與 Autumnalis 血清型的菌株而被證實 (Yeh and Young, 1966) 但由於鉤端螺旋體培養耗時 (Levett, 2001), 常以其血清盛行率調查代替, 但歷年血清陽性盛行率 血清型及鼠種之分佈之結果不盡相同, 如 1968 年 Fresh et al. 調查顯示 586 隻野鼠中有 4.81% 呈陽性反應 (Fresh 11

12 et al., 1968);2000 年邱對台灣地區港埠鼠隻調查, 則發現鼠類總陽性率高達 53% 抗體陽性率最高者為錢鼠(75%) 及 Shermani 血清型陽性率最高 ( 邱, 2000);2006 年吳於台中地區進行調查, 結果顯示鼠類血清陽性率為 23% 溝鼠抗體陽性率最高 以 Pomona 血清型為主 ( 吳, 2007) 加上, 保菌宿主如鼠類除了本身攜帶的特有的鉤端螺旋體, 亦可感染其他血清型造成急性感染, 故血清抗體調查是否能確實反應其帶原情形仍有待商確, 故鼠類實際帶原情形仍有賴於菌株的分離培養與鑑定 萊姆病是經蜱傳染之人畜共通疾病 (tick-borne zoonotic disease), 萊姆病病原體為疏螺旋體, 存在保菌宿主 ( 如囓齒動物, 鳥類 ) 與媒介 (vector) 蜱或蚤身上 (Stanek and Strle, 2003) 人類被帶有疏螺旋體的蜱叮咬後, 於皮膚上產生游走性紅斑 (Erythema migrans), 進而侵犯心血管及神經系統 (Steere, 1989; Steere et al., 1983) 歐洲 北美甚至日本及俄羅斯均為萊姆病盛行區 疏螺旋體菌須在病患感染之初, 取游走性紅斑周圍之皮膚病灶培養, 常由於病患延誤或臨床醫師疏忽而無法在第一時間取得 因此, 臨床上多倚賴血清學診斷 台灣萊姆病確定個案非常稀少, 本局自 94 年將萊姆病收回自行檢驗以來, 尚無確定個案 是台灣無萊姆病發生? 抑或台灣流行之本土型菌株與一般檢驗用的代表菌株差異性大而無法偵測, 一直以來頗具爭議 文獻顯示, 台灣地區有從野鼠分離 出兩種疏螺旋體 Borrelia burgdorferi sensu stricto 及 Borrelia valaisiana-related, 前者型別與歐 美相同, 美國只有此種型別, 後者為與歐洲相似, 為亞洲特有型別 本計畫在粒形硬蜱中發現 Borrleia valaisiana-related 的存在, 代表台灣地區的確有可作為萊姆疏螺旋體菌之媒介 但是目前對於 Borreia valaisiana-related 是否具致病性而導致萊姆病的發生仍不清楚 因此台灣是否有萊姆病傳播仍需持續觀察與監測 12

13 斑點熱立克次體病是一種世界性散發的立克次體疾病, 主要是經由蜱 (ticks) 及蟎 (mites) 的媒介而使人得病 引起斑點熱的病原體種類繁多且不斷的有新的種類被發現, 早期發現的如發生在美國 加拿大及墨西哥等地, 由 Rickettsia rickettsii 引起的洛磯山斑點熱 (Rocky mountain spotted fever); 發生在非洲 印度及地中海沿岸, 由 R. conorii 引起的蒲東熱 (Boutonneuse fever) 肯亞蜱熱 (South African tick typhus), 發生在澳洲, 由 R. australis 引起的昆士蘭蜱熱 (Queensland tick typhus); 發生在美國 韓國 烏克蘭及克羅埃西亞, 由 R. akari 引起的立克次體痘及發生在日本, 由 R. japonica 引起的日本斑點熱 (Japanese spotted fever) 等 (Lennette et al., 1988; Marmion 1990; Takada et al., 1994) 後來發現的種類如發生在俄國 中國 蒙古及巴基斯坦等地由 R. sibirica 引起的北亞蜱熱 (North Asian tick typhus), 發生在澳洲南部及泰國由 R. honei 引起的澳洲斑點熱 (Flinders Island spotted fever), 發生在非洲撒哈拉沙漠以南及加勒比海, 由 R. africae 引起的非洲蜱咬熱 (African tick bite fever) 及全世界分佈經由跳蚤媒介, 由 R. felis 引起的蚤媒斑點熱 (Flea-borne spotted fever) 等, 如今斑點熱病原體已至少有 18 種以上且陸續的被發現中 (Parola et al., 2005; Brouqui et al., 2007) 台灣第一例斑點熱病例報告為 95 年 5 月自南非旅遊回來, 感染 R. africae 之境外移入個案 (Tsai et al., 2008; Tsai et al., 2009a), 而第一例斑點熱之本土病例報告也已出現證實感染 R. felis (Tsai et al., 2009b), 同時野外貓蚤族群之 R. felis 感染率, 單隻貓蚤平均感染率為 18.8%(13/69), 亦於流浪貓中檢測出血清抗 R. felis IgG 抗體效價為 1:320(Tsai, et al., 2009c) 而人群斑點熱血清流行病學調查, 在台南的盛行率調查為 %(Takada et al., 1993), 同時陳等 (1997) 報告金門地區的鼠類血清檢體斑點熱的抗體陽性率為 66.4%; 採自台北市南港區 松山區, 台北縣中和市, 永和市及宜蘭縣福山植物園的 21 隻鼠類, 13

14 斑點熱的抗體陽性率為 42.9% 本局 94 年研究報告指出捕獲自台灣地區 13 個空海港的 810 隻鼠類, 其 R. rickettsii 及 R. conorii 血清抗體陽性率分別為 50.3% 及 26.8%, 兩者重複感染比率為 23.7%; 另自南部 11 個地方性斑疹傷寒確定病例病媒調查 屏東市市場及台北市北投區捕獲 113 隻鼠類, 其 R. rickettsii 及 R. conorii 血清抗體陽性率分別為 36.3% 及 30.1% 斑點熱立克次體的菌株雖然很多, 但目前商品化的斑點熱立克次體 IFA 抗原玻片之菌株僅有 R. rickettsii 及 R. conorii, 依 Fang and Raoult (2003) 報告顯示 R. rickettsii 及 R. conorii 抗原玻片易與其他 Rickettsia 屬立克次體產生之抗體發生交互作用, 故台灣地區港口 都市及野地鼠類可能存在 R. rickettsii 或 R. conorii 或其他 Rickettsia 屬立克次體菌株, 其在鼠類產生之抗體可與 R. rickettsii 及 R. conorii 產生交互作用, 應以分子生物技術或菌株分離培養來進一步分析台灣地區 Rickettsia 屬立克次體之菌株種類 Rickettsia 屬之立克次體除可經由鼠類血清抗體監測外, 亦可由鼠類外寄生節肢動物發現 在日本於台灣革蜱 (Dermacentor taiwanensis) 及褐黃血蜱 (Haemaphysalis flava) 分離出 R. japonica, 於單刺硬蜱 (Ixodes monospinosus) 卵形硬蜱 (I. ovatus) 及全溝硬蜱 (I. persulcatus) 分離出 R. asiatica, 同時亦於龜形花蜱 (Amblyomma testudinarium) 分離出新的斑點熱立克次體菌株 R. tamurae ( Fujita et al., 2006; Fournier et al., 2006) 在韓國亦從長角血蜱(Haemaphysalis longicornis) 檢測出 R. japonica 及 R. rickettsii (Lee et al., 2003; Kim et al., 2006), 甚至從恙蟲體內檢測出近似 R. australis, R. akari, R. japonica, R. conorii 及 R. felis 之立克次體種類 (Choi et al., 2007) 台灣地區依文獻記載有 32 種蜱, 包括硬蜱科有 7 屬 29 種, 軟蜱科有 2 屬 3 種 (Robbin, 2005), 是否有蜱種攜帶 Rickettsia 屬立克次體, 在鼠類間造成傳播循環甚至叮咬人成為病媒, 都是值 14

15 得探究的 本整合型研究計畫期望藉此鼠類監測計畫釐清台灣地區鼠類鉤端螺旋體 萊姆疏螺旋體及 Rickettsia 屬立克次體帶原情形及其可能的傳播途徑, 並分離出更多的本土型菌株納入本局病原體基因資料庫及加入例行的血清學檢驗中以提高人類感染的檢出率 15

16 材料與方法本整合型研究計畫以 3 年為期, 進行台灣地區鼠類及其外寄生節肢動物鉤端螺旋體 萊姆疏螺旋體及 Rickettsia 屬立克次體帶原之調查, 以 PCR 進行鼠類及其外寄生節肢動物帶原的快速診斷, 並利用基因序列比對及親緣樹狀圖演化分析 (phylogenetic tree analysis), 確定分離菌株的種別及親緣關係 第一年將針對鉤端螺旋體的基因序列 16S ribosomal RNA, 第二年將針對數種不同萊姆疏螺旋體的基因序列 hbb, 進行即時定量聚合酶鏈鎖反應 (real-time PCR), 測試其特異性及敏感度, 評估何者為最適用的快速篩檢診斷方法 同時進行台灣地區離島及本島各地的鼠類捕捉及其外寄生節肢動物採集, 以蜱 恙蟲 鼠類腎臟及耳部檢體進行鉤端螺旋體 萊姆疏螺旋體及 Rickettsia 屬立克次體培養, 並由基因序列比對及親緣樹狀圖演化分析 (phylogenetic tree analysis) 確定其種別, 期望釐清本地鼠類鉤端螺旋體 萊姆疏螺旋體及 Rickettsia 屬立克次體帶原的實際情形 本土型菌株的基因型與血清型及臨床病例的關係 一 樣本採集地點樣本之採集分為離島及台灣本島, 第一年進行連江縣 澎湖縣及金門縣三離島採集 ; 第二年進行宜蘭縣 花蓮縣及台東縣等東部縣市採集 ; 第三年進行桃園縣 台中縣及高高屏等西部縣市採集 二 採集方法 : 1. 捕鼠 : 在選定地點佈鏤空鼠籠 ( cm)20 至 40 個,Sherman 鼠籠 ( cm) 80 個以地瓜加花生醬為誘餌, 下午置放隔日早上收籠 捕獲鼠類後, 16

17 依體型大小以 0.1~0.4 ml Zoletil 50 進行腹腔注射迷昏, 心臟採血後將鼠體外節肢動物如跳蚤 蝨子 蟎類以毛刷刷下置於 70% 酒精中, 蜱類則置於直徑 3.7 cm, 高 5.8 cm 有蓋塑膠瓶中, 內鋪 1 cm 石膏碳粉 ( 熟石膏粉 : 活性碳粉 =9: 1) 保持濕度, 置於 4 冰箱 如有恙蟎寄生, 將恙蟎寄生之外耳殼及其他部位如生殖器附近 尾端 後腿基部之皮膚剪下置於石膏碳粉瓶中, 靜置 1 天讓恙蟎脫離鼠體, 置於 4 冰箱 準備進行鑑定及立克次體分離檢測 2. Dragging and flagging: 以 2m 1m 棉布製成之拖曳帶及 1m 1m 棉布製成之旗竿在適當的草地或灌木叢進行拖曳, 將沾附上之蜱以鑷子移入石膏碳粉瓶中, 置於 4 冰箱, 準備進行鑑定及立克次體分離檢測 3. 鼠類解剖 : 將鼠體腹面朝上固定後, 由表皮層及肌肉層逐層剪開固定, 避免體表的污染, 取脾臟 肝臟及腎臟約 0.5 cm 置於 70% 酒精之小管中, 準備進行立克次體 PCR 檢測 三 鼠體外節肢動物鑑定方法 1. 蜱 : 部份蜱浸泡於 70% 酒精殺死後, 置於 Leica MZ12 解剖顯微鏡下鑑定, 蜱之分類方法參考鄭和姜 (1991) Yamaguti et al.(1971) 及 Baker(1999) 2. 跳蚤 : 將保存於 70 % 酒精的蟲體置入水中 30 分鐘後, 轉換成 5 % KOH 置於 45 烤箱 小時, 冷卻後置於水中 30 分鐘, 再以 10 % acetic acid 作用 5-10 分鐘, 然後脫水 40 % 酒精 15 分鐘,70 % 酒精 2 小時,100% 酒精置換 2 次 2 小時後轉換成丁香油 (clove oil) 隔夜, 再以加拿大膠 (Canada balsam) 封片, 置於 45 烤箱 2 週 以 Olympus BX50 顯微鏡鏡檢 跳蚤之分類方法參考柳 (1986) 及 Hopkins and Rothschild( ) 3. 蝨 : 當標本尚在酒精中時, 以細針由腹面刺穿腹部, 將標本置於 10 % KOH 於 17

18 室溫下處理 24 小時或直到所需的透明度 用扁針輕壓腹部移除體內雜物, 將標本換到水中 10 分鐘, 去除任何雜物, 同時要將 KOH 完全去除 進行脫水步驟, 50 % 酒精 70 % 酒精 80 % 酒精 95 % 酒精 100 % 酒精各處理 10 分鐘 ; 木餾油 (cresote) 處理 4 小時, 最後以 Canada balsam 封片 以 Olympus BX50 顯微鏡鏡檢 蝨之分類方法參考 Kim et al.(1986) 及金 (1999) 4. 厲蟎及恙蟎 : 厲蟎由 70% 酒精中取出, 或將部份恙蟎浸泡於 70% 酒精殺死, 再置於去水 3~4 次每次 30 min 再將蟎類以 Berlese fluid 封片液 (ASCO Lab. UK) 封片 以 Olympus BX50 顯微鏡鏡檢 厲蟎之分類方法參考 Jameson(1965), 恙蟲之分類方法則參考 Nadchatram and Dohany (1974) Vercammen-Grandjean and Langston (1976) Wang and Yu (1992) 及黎等 (1997) 之報告 鑑定完成之標本以數位影像系統照相存檔 四 鉤端螺旋體培養 : 將鼠檢體樣本以無菌針筒擠入含 5.0 ml EMJH 培養基 (Bacto Leptospira Medium Base EMJH, No.0794,Difco,Michigan,USA 及 Enrichment) 並添加 5-fluorouracil ( g/ml) 以抑制雜菌生長, 將接種後之培養基置於 之培養箱中 每週 1 次以暗視野顯微鏡檢查, 至少觀察 8 周, 觀察是否分離出鉤端螺旋體 五 鉤端螺旋體菌株 : 本計畫將採用 20 株鉤端螺旋體菌株 : 由潘銘正教授分讓 之參考菌株 17 株及 89 年與 90 年間分離之人類臨床分離株 2 株 (CCF 及 CSY); 再加上本局 95 年度分離之人類臨床分離株 1 株 六 細菌 鼠腎 鼠耳及蜱組織 DNA 之萃取 18

19 1. 鉤端螺旋體菌株 : 鉤端螺旋體菌株次培養於 EMJH 液體培養基以 QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN) 進行 取 1 ml 的液體培養基以 1,2000 g 離心 15 分鐘, 去除上清, 沈澱物加入 180 µl ATL 及 20 µl proteinase K,55 震盪作用 1 小時, 染色體 DNA 萃取依照套組操作說明進行 2. 非鉤端螺旋體之菌株 : 以 QIAamp DNA mini kit (QIAGEN) 萃取染色體 DNA 並依照套組操作說明進行 3. 鼠腎及鼠耳組織 : 以 DNeasy Tissue kit(qiagen) 進行 鼠腎及鼠耳樣本約 25 mg 加入 180 µl ATL 磨碎, 再加入 20 µl proteinase K,55 震盪至少 3 小時, 後依照套組操作說明進行 七 鉤端螺旋體及萊姆疏螺旋體即時定量聚合酶連鎖反應 (real-time PCR) 1. 即時 PCR 引子 探針 試劑與反應條件 : 鉤端螺旋體 16S r-rna 引子與探針序列與反應條件則是參考文獻 (Ganoza et al., 2006) LeptoF 5 -CCCGCGTCCGATTAG-3 LeptoR 5 -TCCATTGTGGCCGRACAC-3 Lepto probe 5 (FAM)CTCACCAAGGCGACGATCGGTAGC3 (BHQ) 萊姆疏螺旋體 hbb 引子與探針序列與反應條件則是參考文獻 (Portnoi et al., 2006): Probe: hbb640: 5 -GTAAGGAAATTAGTTTATGTCTTT*(red640)T-3 hbbfluo2: 5 -CAATGTCTGACTTAGTAACCTTTGGTCTTCTTGA-3 (fluo) Primer: hbbbw: 5 -TAAGCTCTTCAAAAAAAGCATCTA-3 本計畫將使用 Roche LightCycler 2.0 之儀器並配合 Roche LightCycler 19

20 FastStart DNA MasterHybPROBE 之 DNA 定量 PCR 試劑進行 2. Real-time PCR 之靈敏度 (sensitivity) 測試 : 將鉤端螺旋體參考菌株 Leptospira interrogans Icterohaemorrhagiae(CF1) 及萊姆疏螺旋體參考菌株 Borrelia burgdorferi sansu stricto, Borrelia garinii, Borrelia afzelii 以 Petroff-Hausser Counting Chamber 計算原始菌量, 重複計數取其平均值, 之後以正常人的血漿做 10 倍序列之稀釋至 10 2 bacteria/ ml 10 倍序列稀釋後的菌液利用 QIAamp DNA mini kit 萃取 DNA, 之後進行一系列即時 PCR 分析 利用電腦計算出該 DNA 各稀釋倍數所得之 Cp 值與其所代表之粗估細菌數的相關曲線, 作為日後各 Cp 值定性與定量之參考標準 3. Real-time PCR 之特異性 (specificity) 測試 : 利用非鉤端螺旋體 非萊姆疏螺旋體之菌株萃取之 DNA 進行 八 鼠類體外節肢動物 Rickettsia 屬之立克次體分離培養及檢測 ( 一 ) L929 細胞繼代培養 1. 以 37 水浴 preheat MEM 培養液及 0.25%Trypsin-EDTA MEM 培養液的組成為 (Minimum Essential Medium 1X+ Earle s salts+ L-Glutamine) 外加 4%FBS(Fetal Bovine Serum) 及 1% Antibiotic(Penicillin 10,000units/ml, Streptomycin 10mg/ml, Amphotericin 0.025mg/ml ) 2. 原 75T flask 中細胞培養至八分滿以上, 倒乾或吸乾 flask 中的培養液 3. 加入 2~3cc 之 Trypsin-EDTA, 緩緩搖晃 flask 使 Trypsin-EDTA 均勻分布, 待 Trypsin-EDTA 顏色開始變黃後, 吸去 Trypsin-EDTA 至餘 0.2~0.3cc, 蓋上瓶蓋置入 37 培養箱 2~3 分鐘 4. 取出 flask, 可先以些許 MEM 輕輕沖洗 L929 細胞再吸起, 視細胞生長情形 20

21 及實驗需求決定稀釋比例, 以 1:6 為例, 取 12cc MEM 由 flask 底部開始沖洗, 反覆吸放, 可分四至五個區域將整個 flask 沖洗一次, 至底部 L929 細胞均勻分布在 MEM 中為止 5. 取 2cc 細胞懸浮液置入新 75T flask 中, 再加入 13cc MEM, 蓋上瓶蓋, 但將瓶蓋懸開, 置入 37, 5% CO 2 培養箱中培養 ( 二 ) Shell vial 細胞培養 1. 以 37 水浴 preheat MEM 培養液及 Trypsin-EDTA,shell vial 空瓶先置於架上以 UV 燈殺菌半小時以上 2. 75T flask 中細胞培養至八分滿以上, 倒乾或吸乾 flask 中的培養液 3. 加入 2~3cc 之 Trypsin-EDTA, 緩緩搖晃 flask 使 Trypsin-EDTA 均勻分布, 待 Trypsin-EDTA 顏色開始變黃後, 吸去 Trypsin-EDTA 至餘 0.2~0.3cc, 蓋上瓶蓋置入 37 培養箱 2~3 分鐘 4. 取出 flask, 可先以些許 MEM 輕輕沖洗 L929 細胞再吸起, 視細胞生長情形及實驗需求決定稀釋比例, 一般八成以上細胞可先以約 10cc MEM 由 flask 底部開始沖洗, 反覆吸放, 分四至五個區域將整個 flask 沖洗一次, 至底部 L929 細胞均勻分布在 MEM 中為止 5. 計數細胞 : 取 0.1cc 細胞懸浮液加入 0.9cc MEM, 吸取 0.5cc, 加入 0.5cc 之 Trypan blue, 即得稀釋 20 倍之細胞稀釋液, 取一滴輕滴在血球計數器上, 蓋上蓋玻片後在顯微鏡下進行細胞計數 6. 培養所需濃度約為每 cc 中含 個細胞, 依此比例以 MEM 稀釋 每個 shell vial 需要 1cc 細胞液 7. 將細胞液加入 shell vial 中, 並略側瓶身輕搖, 去除玻片底部氣泡以免玻片傾 21

22 斜影響細胞的貼附 8. 蓋上瓶蓋, 但瓶蓋懸開, 置入 37, 5% CO 2 培養箱中培養一日以上 ( 三 ) 蜱研磨液接種 shell vial 1. 選取相同種類相同生活階段的蜱一或數隻為一個 pool, 置於微量離心管中, 微量離心管應保持低溫, 以免蜱活動 將微量離心管 spin down, 加入數滴優碘溶液 (10% Povidone Iodine) 消毒蜱體表, 輕搖微量離心管, 使蜱與優碘能均勻接觸 2. 加入約 1cc PBS(Phosphate Buffer Solution) 稀釋優碘, 以 spin down 將蜱離心下來, 吸取 PBS( 注意不可將蜱吸起 ), 再加入 PBS 清洗, 如此反覆數次, 至洗過之 PBS 不帶顏色為止 3. 每個微量離心管加入 50~100 µl MEM 培養液, 以拋棄式研磨棒均勻研磨, 磨碎後加入 MEM 補至 1.5cc 4. 取前一日培養之 shell vial, 每個 shell vial 加入 400 µl 研磨液進行接種, 以剩餘研磨液萃取 DNA 進行 PCR 5. 將 shell vial 於 32,700xg 離心一小時, 使立克次體進入 L929 細胞 6. 丟棄 shell vial 離心後的上清液, 加入 1cc MEM 輕搖瓶身, 洗去雜質後丟棄上清液, 如此清洗三次, 最後加入 1cc MEM, 旋緊瓶蓋防止污染, 置入 32 培養箱中進行培養 ( 四 ) 恙蟲研磨液接種 shell vial 1. 挑恙蟲 : 以針尖將鼠耳及石膏碳粉瓶內之恙蟲挑入裝有 1cc PBS 之微量離心 管中,100 隻為一個 pool, 微量離心管應保持低溫, 以免恙蟲活動 22

23 2. 將微量離心管以 13,500 轉離心離下恙蟲, 去除 PBS 後, 加入數滴優碘溶液消毒恙蟲體表, 輕搖微量離心管, 使恙蟲與優碘能均勻接觸 3. 加入約 1cc PBS 稀釋優碘, 以 13,500 轉將恙蟲離心下來, 吸取 PBS( 注意不可將恙蟲吸起 ), 再加入 PBS 清洗, 如是反覆數次, 至洗過之 PBS 不帶顏色為止 4. 其餘步驟與四 ( 三 ) 相同 ( 五 ) Rickettsia 屬之立克次體 IFA test 1. 接種後之 L929 細胞株, 於 32 培養箱中進行培養 8 日後, 即可進行 IFA test 2. 輕搖瓶身並略傾斜, 以尖頭鑷取出玻片, 細胞著生面朝上, 置入甲醛中 10 分鐘進行固定 3. 取出玻片, 細胞著生面朝上置於濾紙或乾淨擦手紙上風乾 4. 將 anti Rickettsia spp. 之 antibody 滴在 6 孔培養盤上, 將風乾後的玻片反蓋在培養盤上, 使 antibody 能均勻接觸到細胞著生面, 注意各玻片保持距離避免污染 放入濕潤盒中, 置於 37 處理 30 分鐘 5. 以尖頭鑷小心取出玻片, 細胞著生面朝上, 置入 PBS+0.1%Tween 1st wash 七分鐘 6. 以尖頭鑷小心取出玻片, 細胞著生面朝上, 置入 PBS+0.1%Tween 2nd wash 七分鐘 7. 以尖頭鑷小心取出玻片, 細胞著生面朝上, 置入無菌水 wash 三分鐘 8. 取出玻片, 細胞著生面朝上置於濾紙或乾淨擦手紙上風乾 9. 將標幟有螢光物質 (Fluorescein Isothiocyanate, FITC) 的山羊抗鼠 IgG+A+M 血清 (FITC-goat anti-mouse IgG+A+M (H+L), Zymed Labortories 23

24 Inc., USA) 滴在培養盤上, 將風乾後的玻片反蓋在容器上, 使二抗能均勻接觸到細胞著生面, 注意各玻片保持距離避免污染 放入濕潤盒中, 置於 37 處理 30 分鐘 10. 重複 5~8 步驟, 盡量在陰暗場所操作 11. 載玻片上滴少許甘油 +PBS, 細胞著生面朝下蓋在載玻片上, 以 Leica DM2500 螢光顯微鏡檢視 ( 六 ) Rickettsia 屬之立克次體 Gimenez stain 1. 接種後之 L929 細胞株, 於 32 培養箱中進行培養 8 日後, 即可進行 Gimenez stain 2. 輕搖瓶身並略傾斜, 以尖頭鑷取出玻片, 細胞著生面朝上, 置入甲醛中 10 分鐘進行固定 3. 取出玻片, 細胞著生面朝上置於濾紙或乾淨擦手紙上風乾 4. 置入新鮮配置的 working solution (2 ml basic fuschin stock solution+5ml buffer (NaH2PO4+Na2HPO4)) 兩分鐘, 取出後以無菌水清洗 5. 以尖頭鑷夾取玻片置入 malachite green 九秒, 立刻取出以無菌水清洗 6. 重複步驟 5 7. 取出玻片, 細胞著生面朝上置於濾紙或乾淨擦手紙上風乾 8. 載玻片上滴少許甘油 +PBS, 細胞著生面朝下蓋在載玻片上, 以 Olympus BX50 亮視野顯微鏡檢視 ( 七 ) Rickettsia 屬之立克次體 nested-pcr 檢測 1. 參考 Choi et al.(2005) 之方法, 並略加修正 以 QIAamp DNA Mini 24

25 Kit(QIAGEN) 純化 DNA, 不同檢體有不同前處理方式 2. 前述蜱或恙蟲之研磨液 200 µl 放入 1.5 ml 之 eppendorf tube, 加入 200µl 的 Buffer AL, 再加入 20 µl proteinasek,vortex 約 15 sec 後, 置於 分鐘 稍微離心後, 將附著於管壁上的 sample 集中, 加入 200 µl 的酒精 ( 濃度 %) vortex 約 15 sec 後, 稍微離心集中液體 3. 其他鼠類體外節肢動物 ( 厲蟎 跳蚤 蝨 ) 以水脫去酒精後, 單隻或數隻為一 pool 分別管置於 1.5 ml 微量離心管中, 加入 180 µl SPG buffer (3.0 mm KH 2 PO 4 (Merck),7.2 mm K 2 HPO 4 (Merck),40 mm L-glutamic acid (Sigma) 及 218 mm sucrose (Sigma),pH 7.0), 再加入 20 µl proteinase K, 以拋棄式研磨棒研磨,vortex 後置於 56 下, 隔夜處理 稍微離心後, 加入 200µl 的 Buffer AL, 置於 分鐘, 稍微離心後, 將附著於管壁上的 sample 集中, 加入 200 µl 的酒精 ( 濃度 %) vortex 約 15 sec 後, 稍微離心集中液體 4. 切下鼠類肝臟 腎臟組織約 25mg, 脾臟組織約 10mg, 加入 20 µl proteinase K, 再加入 180µl 的 Buffer ATL, 置於 分鐘, 稍微離心後, 將附著於管壁上的 sample 集中, 加入 200 µl 的酒精 ( 濃度 %) vortex 約 15 sec 後, 稍微離心集中液體 5. 所有前處理好的檢體個別置入 QIAamp spin coloum(in a 2 ml collection tube), 蓋上蓋子後以 8000 rpm 離心 1min, 取下 QIAamp spin coloum, 套入另一 collection tube 中, 丟棄原 2 ml collection tube 及其中液體 6. 小心打開蓋子, 加入 500 µl buffer AW1, 蓋上蓋子後以 8000 rpm 離心 1min, 取下 QIAamp spin coloum, 套入另一 collection tube 中, 丟棄原 2 ml 25

26 collection tube 及其中液體 7. 小心打開蓋子, 加入 500 µl buffer AW2, 蓋上蓋子後以 rpm 離心 3 min, 取下 QIAamp spin coloum, 套入一 1.5 ml eppendorf tube 中, 丟棄原 2 ml collection tube 及其中液體 8. 小心打開蓋子, 加入 50 µl H 2 O, 於 70 中浸潤 5min, 以 8000 rpm 離心 1min 此為 DNA 模板 9. 偵測 Rickettsia 屬之立克次體的標的基因為 kda surface antigen (OmpB) citrate synthase (glta) 10. 增幅 citrate synthase (glta): 第一次 PCR 每一管 0.5 ml 微量離心管依序加入含有 17.5 µl 去離子水 10 µl 之 5X PCR buffer (Promega) 2 µl 之 5 mm dntps (Promega) ( 終濃度為 200 µm) 3 µl 之 25 mm MgCl 2 (Promega) ( 終濃度為 1.5 mm) 6 µl 之 3.3 µm primer RpCS.877p: 5 -GGGGGCCTGCTCACGGCGG-3 ( 購自 Mission Biotech) 及 primer RpCS.1258n:5 -AATGCAAAAAGTACAGTGAACA-3 ( 引子之終濃度為 400 nm) 3 µl 之 DNA 模板及 0.5 µl 酵素 Taq (Promega) (5 U/µl) ( 終濃度為 2.5 U) 等之 PCR 反應液 PCR 反應流程為 : 先於 95, 預熱 5 min; 再依序進行 95 (15 s)/ 54 (15 s)/ 74 (30 s) 之循環, 一共 35 循環 ; 最後, 於 74 3 min 中止反應 第二次 PCR 反應液中引子更改為 3 µl 之 3.3 µm primer RpCS.896: 5 -GGCTAATGAAGCAGTGATAA-3 及 primer RpCS.1233n:5 -GCGACGGTATACCCATAGC-3 ( 引子終濃度為 200 nm), 其餘反應液如同第一次 PCR 的反應流程中之溫度循環條件與第一次相同, 一共進行 35 循環 26

27 11. 增幅 kda surface antigen (OmpB): 第一次 PCR 每一管 0.5 ml 微量離心管依序加入含有 17.5 µl 去離子水 10 µl 之 5X PCR buffer (Promega) 2 µl 之 5 mm dntps (Promega) ( 終濃度為 200 µm) 3 µl 之 25 mm MgCl 2 (Promega) ( 終濃度為 1.5 mm) 6 µl 之 3.3 µm primer rompb OF: 5 -GTAACCGGAAGTAATCGTTTCGTAA-3 ( 購自 Mission Biotech) 及 primer rompb OR:5 -GCTTTATAACCAGCTAAACCACC-3 ( 引子之終濃度為 400 nm) 3 µl 之 DNA 模板及 0.5 µl 酵素 Taq (Promega) (5 U/µl) ( 終濃度為 2.5 U) 等之 PCR 反應液 PCR 反應流程為 : 先於 95, 預熱 5 min; 再依序進行 95 (15 s)/ 54 (15 s)/ 74 (30 s) 之循環, 一共 35 循環 ; 最後, 於 74 3 min 中止反應 第二次 PCR 反應液中引子更改為 3 µl 之 3.3 µm primer rompb SFG IF : 5 - GTTTAATACGTGCTGCTAACCAA-3, primer rompb SFG/TG IR:5 - GGTTTGGCCCATATACCATAAG-3 及 primer rompb TG IF : 5 -AAGATCCTTCTGATGTTGCAACA-3 ( ( 引子終濃度為 200 nm), 其餘反應液如同第一次 PCR 的反應流程中之溫度循環條件與第一次相同, 一共進行 35 循環 12. 取 10 µl 第二次 PCR 增幅的產物, 於 1.5% agarose gel (Promega, USA) 之 1X TBE buffer (Sigma) 的膠片中進行電泳分析 將 agarose 取出, 用溴化乙錠 (ethidium bromide, amresco) 染色, 以紫外光照射觀察並照相, 並將其二次 PCR 增幅的產物進行 DNA 序列定序, 再以 NCBI 網站 ( 進行 DNA 序列之 BLAST 比對 ( 八 ) Rickettsia 屬之立克次體即時定量聚合酶連鎖反應 (real-time PCR) 27

28 1. 即時 PCR 引子 探針 試劑與反應條件 : Rickettsia 屬之立克次體 17kDa 引子 17kDa 142F: 5 -GGTATGAATAAACAAGGTACAGGAAC-3 17kDa 447R: 5 -ATATTGACCAGTGCTATTTCTATAAG-3 17kDa 139F: 5 -GGGTGGTATGAACAAACAAGGGACTG-3 17kDa 378R: 5 -CGCCATTCTATGTTACTACCGCTAGG-3 17kDa 133F: 5 -TGGTCAGAGTGGTATGAACAAACAAG-3 使用 STRATAGENE Mx3005P QPCR System 之儀器並配合 QIAGEN QuatiTect SYBR Green PCR Kit 之 DNA 定量 PCR 試劑進行 九 Rickettsia 屬之立克次體選殖與定序 1. 界定新菌種的 Rickettsia 屬之立克次體需經由下列標的基因全長基因的選殖與定序 :190 kda surface antigen (OmpA) kda surface antigen (OmpB) citrate synthase (glta) 17 kda antigen gene (htra) 16S rrna 及 gene D 2. 標的基因的 PCR 增幅依 Fournier et al.(1998) Roux and Raoult(1995) Roux and Raoult(2000) Roux et al.(1997) 及 Sekeyova et al.(2001) 報告所述 3. 選殖之準備工作 : 取出冷藏之添加 kanamycin 之 plate, 使回復至室溫並去除水滴 取出放置於 -80 之 competent cell 解凍, 放冰塊上備用, 並打開 42 水浴槽 ( 一 )TOPO cloning reaction 1. 將預備進行 cloning 之 PCR 產物置於 0.2 cc 之 eppendorf 中, 加入 1µl Salt solution (invitrogen, USA),1µl TOPO vector (invitrogen, USA), 稍混合後靜置 28

29 於室溫中約五分鐘, 若產物大於 1kb 時可視情況增加時間 2. 將作用後之混合物至於冰上 ( 二 )Transforming 至 DH5α-T1 Competent cell 中 1. 取 1.5cc 之 eppendorf, 加入約 15µl 之 One shot chemically Competent E.coli (invitrogen, USA), 再加入 2µl 作用後之混合物, 以 tip 尖輕攪混合之, 插於冰上使其作用約 5-30 分鐘 ( 通常 15 分鐘即可 ) 2. 將作用後產物置於 42 水浴槽中進行 heat shock,40 秒後馬上取出置於冰上使其急冷約五分鐘, 目的在使 plasmid 進入 Competent cell 中 3. 每管加入 250 µl 的 S.O.C medium (invitrogen, USA) 4. 將 eppendorf 倒放固定於架上, 置於 37 恆溫箱中, 以 200 rpm 水平震盪培養一小時, 同時將去除水滴之 plate 也放入 37 中預熱 5. 取出混合物, 吸取 µl 滴於預熱後之 plate 上, 加入玻璃珠輕搖, 使其均勻塗布於 plate 上 建議每個 sample 可塗布兩個 plate, 滴上不同液量如 µl, 較有機會得到生長良好的 colony 塗布後將玻璃珠倒入 70 % 酒精中回收 6. plate 置於 37 中培養 overnight ( 三 ) 檢查 transformation 結果 1. 檢查前一天之 plate 生長情形, 挑選生長良好之 plate 2. 以 loop 輕挑單一 colony, 塗布於新的 medium 上使其生長 3. 塗布過之 loop 加入 PCR reagent 中輕搖, 以 M13F 及 M13R 為 primer, 可作為 template 進行 PCR 反應, 測試轉型是否成功,PCR 產物進行定序與分析 29

30 十 親緣樹狀圖演化分析 鉤端螺旋體將依 Ganoza et al. 發表之論文進行 nested-pcr 反應 (Ganoza et al., 2006; Palaniappan et al., 2005), 以取得近乎全長的 16S-rRNA 基因片段 萊 姆疏螺旋體依 Rijpkema et al. 發表之論文進行 nested-pcr 反應 ( Rijpkema et al., 1995), 以取得的 5S-23S RNA 基因片段 Rickettsia 屬之立克次體以 kda surface antigen (OmpB) 及 citrate synthase(glta) 為基因標的 進行定序後不同的鉤端螺旋體序列 萊姆疏螺旋體序列及 Rickettsia 屬之立克次體序列 以 Bioedit Ver 7.0 進行編輯, 再以 MEGA 4 執行親緣樹狀圖分析 30

31 結果一 台灣地區十縣鼠類捕獲數 在 95 年至 99 年於離島連江縣 金門縣 澎湖縣, 東部宜蘭縣 花蓮縣 台東縣及西部桃園縣 台中縣 高雄縣 屏東縣共進行 22 次的調查, 共捕獲鼠類 10 種共 1375 隻, 其中東部三縣的鼠種最多有 10 種, 離島三縣僅 5 種最少 以鼠種捕獲率而言, 小黃腹鼠數量最多 751 隻佔 54.62%, 錢鼠其次 183 隻佔 20.58%( 表一 ), 其他鼠種捕獲率皆在 11% 以下 就各縣市的差異, 澎湖縣家鼷鼠 (Mus musculus) 花蓮縣鬼鼠 (Bandicota indica) 及桃園縣田鼷鼠 (Mus caroli) 數量較多, 防治上應考慮因地置宜 ( 表二 ) 二 台灣地區十縣鼠類鉤端螺旋體調查 鼠類血清分別以 12 種鉤端螺旋體菌進行 MAT 血清學檢測,1126 個血清樣本中 313 個呈現陽性, 總抗體陽性率 27.8% 金門縣 65.3% 的鉤端螺旋體血清盛行率為最高, 花蓮縣 32.5% 次之, 其餘縣市在 15~30% 之間, 澎湖縣 2.2% 最低 ( 表三 ) 以鼠種區分, 溝鼠 (R. norvegicus) 55.6% (5/9) 最高, 其次為刺鼠 (Niviventer coxingi) 50% (1/2), 但捕獲數過少 除溝鼠 刺鼠外, 小黃腹鼠 (R. losea) 41.2% (247/599) 血清盛行率最高 ( 表四 ) 99 年與金門大學吳尹文老師合作計畫中捕獲之鼠類亦以小黃腹鼠為主要鼠種, 溝鼠血清學抗體陽性率最高 50% (1/2), 其次為小黃腹鼠 30.2% (16/53), 與本計畫結果相似 ( 表五 ) 31

32 以 real-time PCR 偵測其腎臟中鉤端螺旋體病原帶菌情形, 總感染率 22.5% (268/1190) ( 表六 表七 ) 金門縣 45.51% (76/167) 最高, 花蓮縣 36.1% (48/133) 次之, 與血清盛行率一致 ( 表六 ) 以鼠種區分, 刺鼠 50% (1/2) 最高, 溝鼠 30% (3/10) 次之, 但捕獲數過少 除溝鼠 刺鼠外, 鬼鼠與小黃腹鼠之鉤端螺旋體病原帶菌 28.9 % (24/83) (177/612) 最高 ( 表七 ) 以 16S nested PCR 序列分析, 顯示均為致病性鉤端螺旋體菌 (pathogenic Leptospira)( 圖一 ) 從 923 個新鮮腎臟檢體培養鉤端螺旋體菌共 45 株, 總培養陽性率 4.9% ( 表八 九 ); 其中花蓮縣 8.5% (7/82) 最高, 金門縣 8.4% (15/179) 次之 ( 表八 ) 以鼠種別, 小黃腹鼠鉤端螺旋體菌培養率最高 (17.6%), 其次緬甸小鼠 (8.3%)( 表九 ) 由於鉤端螺旋體菌培養需約 12 週, 因此台中縣 10 月檢體仍在培養中 三 台灣地區十縣鼠類及硬蜱之萊姆疏螺旋體調查 萊姆疏螺旋體菌大多於節肢動物硬蜱 (Ixodes) 之 mid-gut 中存活 本實驗利用 hbb gene 為標的之 real-time PCR 偵測鼠類體外捕捉之蜱類是否帶有萊姆疏螺旋體菌 台灣地區十縣粒形硬蜱 (I. granulatus) 感染萊姆疏螺旋體病原總陽性率為 49 %, 花蓮縣 80% (8/10) 最高, 台中縣次之 75% (15/20) ( 表十 ) 99 年與金門大學吳尹文老師合作計畫中捕獲之粒形硬蜱萊姆疏螺旋體菌感染率 23.2% ( 表十一 ) 台灣粒形硬蜱感染萊姆疏螺旋體菌極高, 顯示粒形硬蜱在台灣為萊姆疏螺旋體菌之媒介 32

33 台灣地區十縣捕捉之鼠類以 hbb gene 為標的 real-time PCR 偵測其耳朵萊姆疏螺旋體病原帶菌情形, 並無偵測出萊姆疏螺旋體菌 於 98 年 6 月份台東縣捕捉之田鼷鼠耳朵檢體成功分離出一株萊姆疏螺旋體 (S7-10)( 表十二 ), 以樹狀圖分析硬蜱及耳朵分離株 (S7-10) 之萊姆疏螺旋體序列, 證實均為 Borrelia valaisiana-related group ( 圖二 ) 四 莫拉克風災造成之鉤端螺旋體病檢測 98 年 8 月 8 日因莫拉克颱風爆發屏東縣萬丹鄉鉤端螺旋體群聚疫情, 共收到 152 個疑似個案檢體,100 個二採 MAT 四倍上升,5 個二採陰性,12 個一採 MAT>100 ( 表十三 ) 其中 6 個血液中以 real-time PCR 偵測出鉤端螺旋體病原, 其中 5 位以 nested PCR 增幅取得鉤端螺旋體病原序列 (human 及 744)( 圖三 ) 18 個檢體檢驗, 共 9 個取得增幅片段, 經選殖 (cloning) 後, 每個增幅片段選擇 10 個 colony 進行序列分析 比對 ( 圖三, 例如 4-9 代表第四個環境檢體之增幅片段, 經選殖後, 第 9 個 colony), 樹狀圖顯示 9 個環境檢體均有致病性鉤端螺旋體菌存在 ( 圖三 ) 五 台灣地區十縣老鼠及其外寄生節肢動物 Rickettsia 屬立克次體調查 將所有採血成功的鼠類血清 1283 支以 3 種立克次體抗原玻片 (R. rickettsii, R. conorii, R. typhi) 進行檢測, 結果如表十四及十五 整體鼠類的斑點熱立克次體抗體陽性率為 71.5%, 其中以離島最高為 76.7%, 其次為東部 70.8%, 西部最低為 66.3% 就鼠種而言, 除 2 隻赤腹松鼠 (Callosciurus erythraeus) 外, 其他鼠種皆對斑點熱立克次體 (R. 33

34 rickettsii, R. conorii) 有抗體反應, 其中大型鼠如溝鼠 鬼鼠及小黃腹鼠抗體陽性率皆超過 88%, 中小型鼠除緬甸小鼠 (Rattus exulans) 外皆低於 68%, 錢鼠最低只有 2.28% 以數量最多的小黃腹鼠進行比較, 斑點熱立克次體抗體陽性率離島 東部 西部分別為 94.5% 94.4% 及 94.8%, 非常相近, 顯示台灣地區野外主要鼠類小黃腹鼠感染斑點熱立克次體情形非常嚴重 野外鼠類亦有感染地方性斑疹傷寒立克次體 (R. typhi) 的情形, 整體鼠類的地方性斑疹傷寒立克次體抗體陽性率為 2.34%, 以離島最高為 3.42%, 其次為西部 1.89%, 東部最低為 1.53% 就鼠種而言, 有 4 個鼠種呈現抗體陽性, 赤背條鼠 (A. agrarius) 最高為 8.7%, 其次為緬甸小鼠 6.25%, 再其次為田鼷鼠 (5.93%) 及小黃腹鼠 (2.32%), 此外澎湖縣 (6.52%) 及高雄屏東 (6.03%) 是較需注意的地區 ( 表十六及十七 ) 為探究鼠類本身是否帶有 Rickettsia 屬立克次體, 在各採集地點選取不同的鼠類 30 到 55 隻取其脾臟 肝臟及腎臟, 以 kda surface antigen (OmpB) 及 citrate synthase(glta) 為基因標的, 進行 nested-pcr 檢測 結果如表十八及十九, 整體鼠類脾肝腎臟中平均偵測出 Rickettsia 屬立克次體的比例為 60.5%, 其中以東部較高為 70.4%, 其次為離島 61.1%, 西部最低為 49% 就鼠種而言所有鼠種皆可檢測到 Rickettsia 屬立克次體, 且陽性率均高於 50%, 顯示野外鼠種皆可成為 Rickettsia 屬立克次體之儲主 鼠類是透過何種管道感染 Rickettsia 屬立克次體, 由其體外節肢 動物以 OmpB 及 glta 為基因標的, 進行 nested-pcr 檢測來瞭解 台灣 34

35 地區共抽樣檢測蜱 273 隻, 平均 Rickettsia 屬立克次體 PCR 陽性率為 37.4%, 其中以西部最高 55.4%, 其次為東部 41.7%, 離島最低為 30.4% 以蜱種為言, 粒形硬蜱 (I. granulatus) 為分布最廣之蜱種, 全台灣各地均可採到, 其平均 Rickettsia 屬立克次體 PCR 陽性率為 17.6%(21/119), 鐮形扇頭蜱 (R. haemaphysaloides) 亦為全台分布, Rickettsia 屬立克次體 PCR 陽性率為 38.1%(45/118), 板齒鼠血蜱 (H. bandicota) 僅發現於西部, 但其 Rickettsia 屬立克次體 PCR 陽性率為 97.3%(36/37) 顯示粒形硬蜱 鐮形扇頭蜱及板齒鼠血蜱可能為病媒 ( 表二十 ) 恙蟲亦帶有 Rickettsia 屬立克次體, 但絕大多數發現於離島及東 部 以 50 隻或 100 隻恙蟲為 1 池 (pool), 離島及東部 PCR 陽性率分別 為 24.7% 及 36.5% ( 表二十一 ) 抽樣檢測台灣地區採獲跳蚤 67 隻,Rickettsia 屬立克次體 PCR 陽性率為 26.9%, 以離島較高為 37%, 東部與西部相同為 20% 就蚤種而言, 印度鼠蚤 (X. cheopis) 為分布最廣之蚤種, 全台灣各地均可採到, 其平均 Rickettsia 屬立克次體 PCR 陽性率為 19%(4/21), 優勝病蚤 (N. nicanus) 分布於東部及離島, 其 Rickettsia 屬立克次體 PCR 陽性率為 36.3%(12/33) 本研究於花蓮縣採獲無孔微棒蚤(Stivalius aporus) 及於高雄屏東採獲梨山嶺蚤 (Acropsylla girshami), 其中無孔微棒蚤 PCR 陽性率為 25% (2/8), 顯示印度鼠蚤 優勝病蚤及無孔微棒蚤可能為病媒 ( 表二十二 ) 35

36 厲蟎 (Laelaps spp.) 為台灣地區常見鼠類寄生蟎類, 離島 東部及 西部各縣分別選取 40 至 50 隻共 82 池進行檢測,PCR 陽性率分別為 36.7% 14.3% 及 8.3%( 表二十三 ) 合計台灣地區三縣鼠類外寄生節肢動物 Rickettsia 屬立克次體感染情形, 蜱 恙蟎 跳蚤及厲蟎 PCR 的陽性率分別為 37.4% 30.5% 26.9% 及 20.7%, 顯示 Rickettsia 屬立克次體透過這些野外鼠類體外節肢動物在鼠類間循環, 甚至可能傳給人類 為瞭解台灣地區 Rickettsia 屬立克次體菌種及不同地理菌株, 將捕捉鼠類部份外寄生之蜱及恙蟲進行 Rickettsia 屬立克次體 Shell vial 細胞分離培養 蜱為單隻研磨接種, 恙蟲則為 50 隻或 100 隻為一池 (pool) 研磨接種 共計接種蜱 236 隻, 恙蟲 324 池, 先經 3 週 Shell vial 培養, 再接續以 25T flask 擴大培養 4 週, 期間不斷以 real-time PCR 檢測菌株是否生長 使用細胞株為 L929 Vero 及 C6/36 目前由台東縣蘭嶼鄉採獲之粒形硬蜱培養出 1 株 桃園縣鐮形扇頭蜱培養出 3 株 桃園機場板齒鼠血蜱培養出 4 株 台中縣嗜龜花蜱培養出 4 株 金門縣鐮形扇頭蜱培養出 1 株 台中縣板齒鼠血蜱培養出 23 株 桃園縣板齒鼠血蜱培養出 8 株 菌株經由 OmpB 及 OmpA 全長序列分析, 金門縣及桃園縣鐮形扇頭蜱之立克次體為相同已知菌株 Rickettsia sp. TwKM01, 台中縣 桃園縣及桃園機場板齒鼠血蜱之立克次體為相同菌株,OmpB 全長序列最接近 Rickettsia hulinensis 4768/4858 (99%),OmpA 全長序列最接近 Rickettsia heilongjiangensis 3148/3183 (99%), 為一新發現菌株 台中縣嗜龜花蜱之立克次體 OmpB 全長序列最接近 Rickettsia 36

37 aeschlimannii 4793/4894 (98%),OmpA 全長序列最接近 Rickettsia raoultii 3124/3188 (98%) 亦為一新發現菌株 台東縣蘭嶼鄉粒形硬蜱之斑點熱立克次體, 經由幾個重要的基因如 16S rrna, glta, OmpA, OmpB 及 sca4 與目前已知斑點熱立克次體菌株序列不同, 最近似的菌株為 R. slovaca 及 R. honei, 研判為一株新的斑點熱立克次體菌株序列, 定名為 Rickettsia spp. IG-1 鼠類內臟組織 外寄生節肢動物及細胞分離培養液以 OmpB 及 glta 為基因標的, 進行 nested-pcr 檢測 PCR 產物定序後, 以電腦軟體 Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) version 4.0 操作, 採用 Neighbor-joining 方法, 重覆計算 (Bootstrap) 1,000 次, 與重要的立克次體參考菌株一起進行親緣關係分析 連江縣計有 47 個菌株進行 OmpB 基因片段序列分析, 結果可分為 5 群, 分別為近似 R. conorii 近似 Rickettsia sp. IG-1 近似 R. rickettsii 近似 R. australis 及近似 R. felis, 其中以近似 R. conorii 最多 ( 圖四 ) 連江縣有 56 個菌株進行 glta 基因片段序列分析, 結果亦分為 5 群, 除近似 R. rickettsii 近似 R. conorii 及近似 R. australis 與 OmpB 相同外, 另有近似 R. japonica 及近似 R. felis, 其中以近似 R. rickettsii 數量較多 ( 圖五 ) 金門縣計有 22 個菌株進行 OmpB 基因片段序列分析, 結果可分為 5 群, 分別為近似 R. rickettsii 近似 R. conorii 近似 Rickettsia sp.twkm01 近似 R. felis 及近似 R. australis, 其中以近似 Rickettsia sp.twkm01 最多 ( 圖六 ) 金門縣有 36 個菌株進行 glta 基因片段序列分析, 結果可分為 6 群除近似 R. conorii 近似 R. rickettsii 近似 Rickettsia 37

38 sp.twkm01 近似 R. australis 及近似 R. felis 4 群與 OmpB 相同外, 另 尚有近似 R. typhi, 其中以近似 R. rickettsii 最多 ( 圖七 ) 澎湖縣計有 14 個菌株進行 OmpB 基因片段序列分析, 結果可分為 6 群, 分別為近似 R. rickettsii 近似 Rickettsia sp. IG-1 近似 R. conorii 近似 Rickettsia sp.twkm01 近似 R. felis 及近似 R. australis, 其中以近似 Rickettsia sp.twkm01 最多 ( 圖八 ) 澎湖縣有 26 個菌株進行 glta 基因片段序列分析, 結果可分為 6 群除近似 R. conorii 近似 Rickettsia sp. IG-1 近似 R. rickettsii 及近似 R. felis 4 群與 OmpB 相同外, 另尚有近似 R. japonica 及近似 R. typhi, 其中以近似 R. rickettsii 最多 ( 圖九 ) 宜蘭縣計有 17 個菌株進行 OmpB 基因片段序列分析, 結果可分為 3 群, 分別為近似 R. conorii 近似 Rickettsia sp. TwKM01 及近似 R. typhi, 其中以近似 R. conorii 最多 ( 圖十 ) 宜蘭縣有 36 個菌株進行 glta 基因片段序列分析, 結果分為 6 群, 除近似 R. conorii 及近似 R. typhi 與 OmpB 相同外, 另有近似 Rickettsia sp. IG-1 近似 R. japonica 近似 R. felis 及近似 Rickettsia sp. TwKM02, 其中以近似 R. typhi 數量較多 ( 圖十一 ) 花蓮縣計有 48 個菌株進行 OmpB 基因片段序列分析, 結果可分為 5 群, 分別為近似 R. rickettsii 近似 Rickettsia sp. IG-1 近似 R. conorii 近似 Rickettsia sp.twkm01 及近似 Rickettsia sp. MB74-1, 其中以近似 Rickettsia sp. MB74-1 最多 ( 圖十二 ) 花蓮縣有 62 個菌株進行 38

39 glta 基因片段序列分析, 結果可分為 6 群除近似 Rickettsia sp. IG-1 近似 R. rickettsii 及近似 R. conorii 3 群與 OmpB 相同外, 另尚有近似 R. japonica 近似 R. typhi 及近似 Rickettsia sp.twkm02, 其中以近似 R. japonica 最多 ( 圖十三 ) 台東縣計有 30 個菌株進行 OmpB 基因片段序列分析, 結果可分為 5 群, 分別為近似 Rickettsia sp. IG-1 近似 R. rickettsii 近似 R. conorii 近似 Rickettsia sp.twkm01 及近似 Rickettsia sp. MB74-1, 其中以近似 Rickettsia sp. IG-1 最多 ( 圖十四 ) 台東縣有 36 個菌株進行 glta 基因片段序列分析, 結果可分為 6 群除近似 Rickettsia sp. IG-1 近似 R. rickettsii 及近似 R. conorii 3 群與 OmpB 相同外, 另尚有近似 R. typhi 近似 Rickettsia sp.twkm02 及近似 R. felis, 其中以近似 Rickettsia sp. IG-1 及近似 Rickettsia sp.twkm02 最多 ( 圖十五 ) 桃園縣計有 11 個菌株進行 OmpB 基因片段序列分析, 結果皆近似 R. japonica( 圖十六 ) 桃園縣有 9 個菌株進行 glta 基因片段序列分析, 結果可分為 2 群, 多數近似 R. japonica, 有一株近似 R. felis ( 圖十七 ) 台中縣計有 21 個菌株進行 OmpB 基因片段序列分析, 結果可分為 2 群, 多數近似 R. rickettsii, 有一株近似 R. japonica ( 圖十八 ) 台中縣有 2 個菌株進行 glta 基因片段序列分析, 結果為一株近似 R. japonica, 一株近似 R. montana( 圖十九 ) 高雄屏東有 13 個菌株進行 OmpB 基因片段序列分析, 結果分為 3 群, 多數一群近似 R. japonica, 另兩群各一株, 分別近似 R. rickettsii 及近似 R. felis( 圖二十 ) 高雄屏東有 16 個菌株進行 glta 基因片段序 39

40 列分析, 結果皆近似 R. japonica ( 圖二十一 ) 六 建立防疫能量, 協助鑑定加拿大境外移入洛磯山革蜱 (Dermacentor andersoni) 新竹縣關西鎮一名婦人跟隨旅行團至加拿大進行洛磯山冰原之旅, 行經幾座國家公園及牧場, 返國後產生頭痛現象, 經同事發現有蟲叮咬於頭部, 始送醫求診並通報為萊姆病 此蟲後經衛生局轉送疾病管制局研究檢驗中心鑑定, 為一種蜱 ( 壁蝨 ), 惟不屬於存在於台灣的種類, 經抽蜱 DNA 以 12S rdna 及 16S rdna 定序分析,12S 片段 94% 近似於 Dermacentor andersoni,16s 片段則為 100% 相似 Dermacentor andersoni; 另將蜱送美國 Walter Reed Army Medical Center, Washington 請 Dr. Richard G. Robbins 協助鑑定, 結果為洛磯山革蜱 (Dermacentor andersoni)( 如圖二十二 ) 洛磯山革蜱分佈於美國 加拿大西部為洛磯山斑點熱 (Rocky mountain spotted fever) 之主要病媒, 病原體為立氏立克次體 (Rickettsia rickettsii), 臨床症狀包括急性發燒 伴隨肌肉酸痛 頭痛及出現於手掌 腳掌的出血性紅疹 經以 real-time PCR 檢測此蜱是否帶有 spotted fever rickettsia group, 結果為陽性 進一步以 nested-pcr 以 citrate synthase(glt A) 及 outer membrane protein B(OmpB) 為標的基因, 定序結果 glta 100%, OmpB 100% 相似 Rickettsia peacockii,rickettsia peacockii 為一種洛磯山革蜱共生非病原性之立克次體, 而婦人經醫師摘除蜱頭痛現象亦緩解, 萊姆病及斑點熱經檢測為陰性 本案已發新聞稿提醒國人出國旅遊時注意 40

41 七 金門縣鼠類外寄生節肢動物調查及蜱斑點熱立克次體檢測 由國立金門大學食品科學系吳尹文助理教授協助採檢, 每月寄送金門動植物防疫所所捕獲鼠類外寄生節肢動物至本局,99 年 1 月至 10 月共送檢 132 隻鼠類, 其中以小黃腹鼠 116 隻 (87.88%) 最多, 其次為錢鼠 11 隻 (8.33%)( 表二十四 ) 在鼠類外寄生節肢動物中, 蜱之種類包括粒形硬蜱及鐮形扇頭蜱, 蚤包括印度鼠蚤及優勝病蚤, 恙蟎包括地里恙蟎 (Leptotrombidium deliense) 小板恙蟎(Leptotrombidium scutellare) 及中華無前恙蟎 (Wachia chinensis), 厲蟎包括毒厲蟎 (Laelaps echidninus) 塞氏厲蟎 (Laelaps sedlaceki) 鼠顎毛厲蟎 (Laelaps myonyssognathus) 及納氏厲蟎 (Laelaps nuttalli), 蝨包括太平洋甲脅蝨 (Hoplopleura pacifica) 及彎多板蝨 (Polyplax reclinata) 這些鼠類外寄生節肢動物的季節消長, 除跳蚤在春季 3 月為高峰外, 其餘皆在夏季 6-7 月為高峰 ( 圖二十三 ) 以 real-time PCR 採檢 55 隻粒形硬蜱, Rickettsia 屬立克次體皆為陰性 檢測 1 隻鐮形扇頭蜱並進行培養, 結果 real-time PCR 為陽性, 且培養出一株 Rickettsia sp. TwKM01 41

42 討論 於 95 年 5 月至 99 年 10 月於台灣地區離島 東部及西部十縣共進行 22 次的調查, 共捕獲鼠類 10 種共 1375 隻, 其中東部三縣的鼠種最多有 10 種, 離島三縣僅 5 種最少, 顯示東部開發程度較低, 生物多樣性豐富 以鼠種捕獲率而言, 小黃腹鼠數量最多 751 隻佔 54.62%, 錢鼠其次 183 隻佔 20.58%, 其他鼠種捕獲率皆在 11% 以下, 顯示台灣地區野鼠以小黃腹鼠及錢鼠為優勢種, 在防治上需考慮此二種鼠類之生態習性 就各縣市的差異, 澎湖縣家鼷鼠 (Mus musculus) 花蓮縣鬼鼠(Bandicota indica) 及桃園縣田鼷鼠 (Mus caroli) 數量較多, 防治上應考慮因地置宜 本計畫鼠類鉤端螺旋體總血清抗體陽性率為 27.8% (313/1126), 高於潘銘正老師 95 年度計畫結果之 11.49% (64/557, 台灣各區 ) 其東部地區血清抗體陽性率 14.28% (9/63) 低於中部 26.4% (37/140), 捕捉之鼠類以溝鼠最多, 錢鼠次之, 小黃腹鼠只有 5 隻, 均與本計畫不同 可能由於其東部地區捕捉之樣本數較少 (63 隻 ), 且捕捉之鼠種分布不同 ( 本計畫捕捉最多為小黃腹鼠 ) 造成 本計畫三年來從硬蜱中偵測之萊姆疏螺旋體均為 Borrelia valaisiana-related genospecies, 而 98 年度分離出疾管局第一個本土萊姆疏螺旋體菌株, 經序列比對後亦為 Borrelia valaisiana-related genospecies, 與 Masuzawa 等人在台灣的研究相同, 此發現已被國際期刊接受且即將刊登 (Huang et al., 2010) 國防師建民教授於鼠耳培養之萊姆疏螺旋體為 Borrelia burgdorferi sensu stricto, 但其團隊於 2010 年亦發表文獻顯示自 42

43 硬蜱中偵測出與我們相同之 Borreia valaisiana -related genospecies (Chao et al., 2010) Borreia valaisiana -related genospecies 是否具致病性導致萊姆病的發生仍不清楚, 而台灣是否有萊姆病存在, 爭議尚待解決 除仍需持續觀察與監測外, 本土菌株的分離取得, 對於台灣萊姆病的檢驗將更有助益 台灣地區經由節肢動物傳播的立克次體病首推恙蟲病, 其次為地方性斑疹傷寒, 兩者每年皆有數百及數十名確定病例, 然而尚有為數眾多的不明熱患者雖經法定傳染病病原檢測, 卻仍無法診斷出病原體, 這些病例中有沒有可能是斑點熱患者, 是本研究想要探討的問題 斑點熱立克次體病為全球性分布之節肢動物所媒介的重要傳染病, 目前已報告該病發生的國家及地區高達 50 餘個, 包括洛磯山斑點熱 蒲東熱 肯亞蜱熱 昆士蘭蜱熱 立克次體痘 日本斑點熱 北亞蜱熱 澳洲斑點熱 非洲蜱咬熱及蚤媒斑點熱等 (Parola et al., 2005) 斑點熱立克次體病的宿主動物主要以野生小型哺乳動物為主, 包括囓齒目 食蟲目 兔形目及部份鳥類 另外, 部份家畜如牛 羊 兔 駱駝等也可能做為宿主動物, 本研究首先即檢測野外鼠類之斑點熱立克次體抗體陽性率 台灣地區整體鼠類的斑點熱立克次體抗體陽性率為 71.5%, 其中以離島最高為 76.7%, 其次為東部 70.8%, 西部最低為 66.3% 就鼠種而言, 除 2 隻赤腹松鼠外, 其他鼠種皆對斑點熱立克次體 (R. rickettsii, R. conorii) 有抗體反應, 但以捕獲數量最多的小黃腹鼠來進行比較, 斑點熱立克次體抗體陽性率離島 東部 西部分別為 94.5% 94.4% 及 94.8%, 非常相近, 顯示小黃腹鼠仍是最需要關注的鼠種 43

44 相較於亞洲其他國家日本鼠類平均抗 R. japonica 之抗體陽性率為 75%(539/716), 泰國鼠類平均抗 R. sibirica TT-118 之抗體陽性率為 62.2%(Ishikura et al., 1992, Okabayashi et al., 1996), 此兩國家皆有斑點熱病例, 因此台灣極有可能也存在 斑點熱立克次體為一群經節肢動物叮咬傳播的絕對細胞內寄生菌, 在野生動物與節肢動物間循環, 有著疫源性的特徵, 因此必需以當地流行的菌株為抗原進行免疫螢光染色, 才能得到正確的感染情形, 如日本的 R. japonica 及泰國的 R. sibirica TT-118 台灣的研究早期一篇人群血清盛行率調查報告為 Takada et al.(1994) 在台南的調查為 %, 是以 R. japonica 及 R. sibirica 為抗原, 蔡等 (2008) 2009 年在台北縣貢寮鄉的血清流行病學調查, 住民斑點熱 IgG 抗體盛行率為 3.09%(8/259), 使用抗原為 R. rickettsii 及 R. conorii 斑點熱立克次體的菌株雖然很多, 但目前商品化的斑點熱立克次體 IFA 抗原玻片之菌株僅有 R. rickettsii 及 R. conorii, 依 Fang and Raoult (2003) 報告,12 株 Rickettsia 屬立克次體經由 BALB/c 老鼠產生之多株抗體, 可對 R. rickettsii 抗原玻片產生螢光反應, 其效價分別為 R. felis (1:512), R. rickettsii (1:4,096), R. australis (1:512), R. montanensis (1:256), R. honei (1:1,024), R. japonica (1:256), R. typhi (1:64), R. canadensis (1:64), R. massiliae (1:128), R. belli (1:64), R. conorii (1:128) 及 R. akari (1:1,028); 另 5 株 Rickettsia 屬立克次體經由 BALB/c 老鼠產生之多株抗體, 可對 R. conorii 抗原玻片產生螢光反應, 其效價分別為 R. rickettsii (1:512), R. honei (1:512), R. japonica (1:64), R. massiliae (1:256) 及 R. conorii (1:4,096) 此報告顯示 R. rickettsii 及 R. conorii 抗原玻片易與其 44

45 他 Rickettsia 屬立克次體產生之抗體發生交互作用, 同時 R. rickettsii 與其他 Rickettsia 屬立克次體產生之抗體發生交互作用的比率較 R. conorii 高, 從本研究中也得到相同結果 在台灣地區全部檢測的鼠類血清檢體中,R. rickettsii 及 R. conorii 重覆感染的比率為 58.30%(748/1283),R. rickettsii 及 R. conorii 單獨感染的比率分別為 11.54%(148/1283) 及 1.56%(20/1283), 顯示雖然此二抗原對其他 Rickettsia 屬立克次體產生之抗體有很高的比率發生交互作用, 但其對於台灣地區 Rickettsia 屬立克次體的涵蓋率仍有待分離出台灣地區之斑點熱立克次體才得以驗證 鼠類能否成為 Rickettsia 屬立克次體的宿主端視其體內能否保存 增殖此病原體, 本研究由檢測鼠類主要器官脾 肝及腎臟著手 結果發現所有檢測的 9 種鼠類其內臟皆可檢測出 Rickettsia 屬立克次體, 台灣地區整體鼠類脾肝腎臟中平均偵測出 Rickettsia 屬立克次體的比例為 60.5%, 其中以東部較高為 70.4%, 其次為離島 61.1%, 西部最低為 49% 就鼠種而言所有鼠種皆可檢測到 Rickettsia 屬立克次體, 且陽性率均高於 50%, 顯示野外鼠種皆可成為 Rickettsia 屬立克次體之儲主 中國大陸在黑龍江 內蒙古 新疆 浙江及貴州檢測 20 種 473 隻鼠類, 結果有 12 種 69 隻鼠類在脾臟檢測出斑點熱立克次體, 陽性率為 14.6%,5 個地區陽性率分別為 3.1% 21.6% 30.0% 10.8% 及 21.4%( 黃等,2006), 台灣東西部及外島十縣的鼠類內臟檢出率相較下較高可能與使用 nested-pcr 檢測較靈敏有關 斑點熱立克次體是由節肢動物所傳播, 西部地區鼠類有如此高的斑 45

46 點熱立克次體抗體陽性率應與其體外寄生之節肢動物 ( 蟎 蜱 蚤 ) 有關, 由表二十至二十三的結果也證實此點 台灣地區共抽樣檢測蜱 273 隻, 平均 Rickettsia 屬立克次體 PCR 陽性率為 37.4%, 其中以西部最高 55.4%, 其次為東部 41.7%, 離島最低為 30.4% 以蜱種為言, 粒形硬蜱為分布最廣之蜱種, 全台灣各地均可採到, 其平均 Rickettsia 屬立克次體 PCR 陽性率為 17.6%, 鐮形扇頭蜱亦為全台分布,Rickettsia 屬立克次體 PCR 陽性率為 38.1%, 板齒鼠血蜱僅發現於西部, 但其 Rickettsia 屬立克次體 PCR 陽性率為 97.3% 目前文獻中檢測出攜帶斑點熱立克次體的節肢動物種類為數眾多且具有地域性, 其中多數為蜱, 如日本已知有 9 種蜱檢測出斑點熱立克次體, 包括褐黃血蜱 (Haemophysalis flava) 豪豬血蜱(H. hystericis) 龜形花蜱 (Amblyomma testudinarium) 長角血蜱(H. longicornis) 卵形硬蜱(I. ovatus) 具角血蜱(H. cornigera) 台灣革蜱(Dermacentor taiwanensis) 全溝硬蜱 (I. persulcatus) 及單刺硬蜱 I. monospinosus(mahara, 2006) 而中國大陸已知至少有 14 種蜱檢測出斑點熱立克次體, 包括草原革蜱 (D. nuttallii) 邊緣革蜱(D. marginatus) 森林革蜱(D. silvarm) 銀盾革蜱(D. niveus) 中華革蜱(D. sinicus) 金澤革蜱(D. auratus) 嗜群血蜱(H. concinna) 日本血蜱 (H. japonica) 長角血蜱 (H. longicornis) 越原血蜱 (H. yeni) 徽上血蜱(H. wellingtoni) 亞東璃眼蜱(Haylomma asiaticumin) 粒形硬蜱 (I. granulatus) 及微小牛蜱 (Boophius microplus)( 張,1999) 台灣在文獻記載有 32 種蜱, 除本研究發現粒形硬蜱 鐮形扇頭蜱及板齒鼠血蜱外應有可能在其他蜱種帶有斑點熱立克次體 46

47 台灣地區鼠類血清有很高的斑點熱立克次體抗體, 鼠類內臟中高比率的感染 Rickettsia 屬立克次體, 而上述這些鼠類體外節肢動物在鼠與鼠間傳播 Rickettsia 屬立克次體扮有重要角色, 至於能否傳給人成為病媒, 尚待進一步研究 全世界目前發現的斑點熱立克次體菌株已超過 50 種, 其中已知的致病株有 15 種, 如 R. rickettsii, R. conorii, R. australis, R. akari, R. japonica, R. sibirica, R. honei, R. africae, R. slovac, R. heilongjiangensis, R. aeschlimannii, R. parkeri, R. massiliae, R. marmionii 及 R. felis, 除此之外更有為數眾多的菌株尚未發現其致病性且數量持續在增加中 (Parola et al., 2005) 由 Parola et al.(2005) 報告中可發現, 斑點熱立克次體的研究多侷限在歐洲 非洲 北美洲 美亞及東亞, 因此發現的菌株也以這些地區較多, 如日本有 3 個菌株 Rickettsia japonica, R. tamurae 及 R. asiatica(uchida et al., 1992;Fournier et al., 2006;Fujita et al., 2006); 中國大陸有 4 個菌株 R. sibirica, R. heilongjiangii, R. mongolotimonae 及 R. hulinii(zhang et al., 2000), 而東南亞及澳洲近年來則於泰國及澳洲發現 R. honei; 於澳洲發現 R. australis(kollars, Tippayachai and Bodhidatta, 2001;Stenos et al., 1998;Stewart, 1991) 台灣在這方面的研究尚在起步, Tsui et al.(2007) 報告於鐮形扇頭蜱發現 Rickettsia sp. TwKM01; 於地里恙蟎發現 Rickettsia sp. TwKM02; 於地里恙蟎 粒形硬蜱及中氣門亞目節肢動物發現 Rickettsia sp. TwKM03, 此 3 株斑點熱立克次體的致病性尚不清楚 本研究經由研磨培養蜱 236 隻, 恙蟲 324 池體內立克次體, 發現斑點熱立克次體與蜱之間似乎存在種專一性, 鐮形扇頭蜱所檢測出者皆為 47

48 Rickettsia sp. TwKM01, 而板齒鼠血蜱及嗜龜花蜱皆發現新立克次體菌株 板齒鼠血蜱之立克次體,OmpB 全長序列最接近 Rickettsia hulinensis 4768/4858 (99%),OmpA 全長序列最接近 Rickettsia heilongjiangensis 3148/3183 (99%); 嗜龜花蜱之立克次體,OmpB 全長序列最接近 Rickettsia hulinensis 4768/4858 (99%), OmpA 全長序列最接近 Rickettsia heilongjiangensis 3148/3183 (99%), 其他重要基因標的正進一步研究中 本研究另於 95 年 9 月於台東縣蘭嶼鄉採獲之粒形硬蜱培養出一株斑點熱立克次體, 經由幾個重要的基因如 16S rrna(rrs), glta, OmpA, OmpB 及 sca4 與目前已知斑點熱立克次體菌株序列不同, 最近似的菌株為 R. slovaca 及 R. honei, 研判為一株新的斑點熱立克次體菌株序列, 定名為 Rickettsia spp. IG-1 R. slovaca 經由邊緣革蜱 (Dermacentor marginatus) 及網紋革蜱 (D. reticulates) 傳播蜱媒淋巴腺病 (TIBOLA), 主要分布於歐洲 (Raoult et al, 1997);R. honei 分布較廣, 包括東南亞 澳洲及北美, 在不同蜱種如 Aponomma hydrosauri, Amblyomma cajennense, 粒形硬蜱及 Haemaphysalis novaeguineae 皆曾發現 (Kollars et al, 2001; Stenos et al, 1998; Lane et al, 2005; Billings et al, 1998; Jing et al, 2005) 台灣地區十縣市老鼠內臟組織 外寄生節肢動物及細胞分離培養液以 OmpB 及 glta 部份序列為基因標的, 與重要的立克次體參考菌株一起進行親緣關係分析 結果由親緣關係樹的分枝, 與重要的立克次體參考菌株的相似度可將離島三縣所檢測到的 201 個菌株可分為 8 群 (group), 東部三縣所檢測到的 229 個菌株可分為 9 群 (group), 西部四縣所檢測到的 72 個菌株可分為 3 群 (group), 台灣地區 Rickettsia 屬立克次體菌株種類 48

49 共分為 10 群 (group), 各縣市分為 2-10 群不等, 離島及東部三縣種類較多, 西部較少 整體而言, 台灣地區以近似 R. conorii 的菌株最多, 佔 37.43%, 其次為近似 Rickettsia sp. MB74-1 的菌株, 佔 22.91% 離島及東部地區, 均以近似 R. conorii 的菌株最多, 分別為 28.6%(57/199) 及 23.1%(53/229), 而西部地區則以近似 R. japonica 的菌株最多為 66.7%(48/72) 另外 R. conorii R. japonica R. rickettsii 及 R. felis 都是致病株, 有些菌株在 OmpB 及 glta 部份序列的比對與其 100% 相同, 是否確實有這些致病株在鼠類及其外寄生節肢動物散佈, 都值得進一步研究 台灣地區十縣市所檢測出的斑點熱立克次體菌株群在不同外寄生節肢動物及內臟組織之分佈亦有一些新的發現, 如表二十五顯示所有菌株可在不同外寄生節肢動物及鼠類脾肝腎臟發現, 唯有近似 Rickettsia sp.mb74-1 只發現於恙蟲, 似乎顯示近似 Rickettsia sp.mb74-1 菌株較不具致病性 Rickettsia sp.mb74-1 菌株為 Choi et al.(2007) 在韓國恙蟎發現, 顯示恙蟎中有一群共生的斑點熱立克次體 此外近似 R. japonica 菌株群為台灣西部為最主要且分布最廣的菌株群, 此與本研究所分離出之菌株可能具有相關性, 因板齒鼠血蜱所分離出之立克次體, 最接近 Rickettsia hulinensis 及 Rickettsia heilongjiangensis 此兩株立克次體與 R. japonica 的親緣關係都非常近 49

50 結論與建議 1. 台灣地區野鼠以小黃腹鼠及錢鼠為優勢種, 在防治上需考慮此二種鼠類之生態習性 2. 粒形硬蜱為萊姆疏螺旋體菌之媒介, 偵測台灣捕捉之粒形硬蜱中之萊姆疏螺旋體菌, 經基因序列分析顯示與 Borreia valaisiana-related genospecies 屬同一群系, 此結果與 Dr. Mazusawa 從台灣野鼠分離出之萊姆疏螺旋體菌十分相近 分離出之萊姆疏螺旋體 Borrelia valaisiana 未來將用於臨床檢驗上, 加強萊姆病的監測 3. 莫拉克風災造成之鉤端螺旋體疫情顯示地下水為可能的致病源 由於鉤端螺 旋體病無特定典型症狀, 不易判斷, 此次的經驗可提供未來類似情況發生時 之借鏡 4. 小黃腹鼠為台灣地區數量最多的野外鼠種, 斑點熱立克次體抗體陽性率, 離 島 東部 西部分別為 94.5% 94.4% 及 94.8%, 非常相近, 顯示台灣地區 野外主要鼠類小黃腹鼠感染斑點熱立克次體情形非常嚴重 5. 台灣地區整體鼠類的地方性斑疹傷寒立克次體抗體陽性率為 2.34%, 以離島最高為 3.42%, 其次為西部 1.89%, 東部最低為 1.53% 就鼠種而言, 有 4 個鼠種呈現抗體陽性, 赤背條鼠最高為 8.7%, 其次為緬甸小鼠 6.25%, 再其次為田鼷鼠 (5.93%) 及小黃腹鼠 (2.32%) 6. 台灣地區整體鼠類脾肝腎臟中平均偵測出 Rickettsia 屬立克次體的比例為 60.5%, 其中以東部較高為 70.4%, 其次為離島 61.1%, 西部最低為 49% 50

51 就鼠種而言所有鼠種皆可檢測到 Rickettsia 屬立克次體, 且陽性率均高於 50%, 顯示這些野外鼠類皆有成為 Rickettsia 屬立克次體傳染窩 (reservoir) 的 可能性 7. 台灣地區三縣鼠類外寄生節肢動物 Rickettsia 屬立克次體感染情形, 蜱 恙蟎 跳蚤及厲蟎 PCR 的陽性率分別為 37.4% 30.5% 26.9% 及 20.7%, 顯示 Rickettsia 屬立克次體透過這些野外鼠類體外節肢動物在鼠類間循環, 甚至可能傳給人類 8. 於台東縣蘭嶼鄉採獲之粒形硬蜱培養出一株斑點熱立克次體, 經由幾個重要的基因如 16S rrna, glta, OmpA, OmpB 及 sca4 與目前已知斑點熱立克次體菌株序列不同, 最近似的菌株為 R. slovaca 及 R. honei, 研判為一株新的斑點熱立克次體菌株序列, 定名為 Rickettsia spp. IG-1 9. 於台中縣採獲之板齒鼠血蜱及嗜龜花蜱分別培養出斑點熱立克次體, 經由幾 個重要的基因如 ompa 及 ompb 與目前已知斑點熱立克次體菌株序列不同, 研判為二株新的斑點熱立克次體菌株序列 10. 台灣地區鼠類內臟組織 外寄生節肢動物及細胞分離培養液以 OmpB 及 glta 部份序列為基因標的, 與重要的立克次體參考菌株一起進行親緣關係分析 結果由所檢測到的 500 個菌株可分為 10 群 (group), 其中以近似 R. conorii 的菌株最多, 佔 37.43%, 其次為近似 Rickettsia sp. MB74-1 的菌株, 佔 22.91% 離島及東部地區, 均以近似 R. conorii 的菌株最多, 分別為 28.6%(57/199) 及 23.1%(53/229), 而西部地區則以近似 R. japonica 的菌株最多為 66.7%(48/72) 51

52 計畫重要研究成果及具體建議 1. 本計畫分離之鉤端螺旋體菌, 均隸屬 pathogenic Leptospira, 未來將其加入臨床 MAT 檢驗之菌株 pannel 中, 以期能更正確進行台灣鉤端螺旋體之血清流行病學分析 2. 本計畫偵測之萊姆疏螺旋體病原 Borrelia valaisiana-related genospecies 與美國 歐洲流行株不同, 自鼠耳分離出之萊姆疏螺旋體 Borrelia valaisiana-related genospecies, 更加證明台灣流行的萊姆病病原有別於歐美各國, 此發現已被國際期刊接受且即將刊登 (Huang et al., 2010) 國防師建民教授於鼠耳培養之萊姆疏螺旋體為 Borrelia burgdorferi sensu stricto, 但其團隊於 2010 年亦發表文獻顯示自硬蜱中偵測出與我們相同之 Borreia valaisiana -related genospecies (Chao et al., 2010) 顯示台灣地區的確有粒形硬蜱可作為萊姆疏螺旋體菌之媒介, 因此除原有檢驗試劑外, 未來將加上此本土分離株以強化檢驗能量 3. 因應本計劃建立之鉤端螺旋體 real-time PCR 及 nested PCR 偵測已應用至莫拉克風災疫情, 除人體檢體外, 環境檢體的偵測也發揮效能 研究成果實際應用於防疫工作上, 能及時發現確定病例, 尋找感染源, 進行緊急防治工作, 防止疫情的擴散 4. 台灣地區鼠類身上檢測出抗斑點熱立克次體抗體陽性率非常高, 平均達 71.5%, 同時鼠體外寄生之節肢動物如蜱 恙蟎 跳蚤及厲蟎皆檢測出斑點熱立克次體, 而老鼠脾肝腎臟亦檢出斑點熱立克次體, 顯示斑點熱立克次體確實存在於東部三縣的鼠類及其體外寄生之節肢動物, 因此應提醒醫師注意患者是否有斑點熱的相關症狀如發熱 畏寒 丘疹及焦痂等, 以便及 52

53 早通報, 同時實驗室也應開發更敏感的檢測方法, 以期偵測此病的發生 5. 鼠類及其外寄生節肢動物所帶的病原體多, 民眾仍應防範鼠類避免與鼠類接觸, 同時加強滅鼠, 如被蜱 蟎或跳蚤叮咬, 應注意叮咬後的反應及早就醫, 同時告訴醫師這些資訊, 蜱 蟎或跳蚤若能同時送檢, 更有助於疾病診斷 6. 文獻中尚未發現無孔微棒蚤 (Stivalius aporus) 帶有斑點熱立克次體, 本研究為首次發現 7. 本研究自台東縣蘭嶼鄉粒形硬蜱分離出一株新的斑點熱立克次體菌株 Rickettsia spp. IG-1, 同時發現此菌株及其近似種類廣泛分佈於東部三縣蜱 恙蟎 厲蟎及鼠類肝脾腎中, 甚至連江縣及澎湖縣的恙蟎及鼠脾亦曾發現, 應更進一步進行特性分析以瞭解其致病的可能性 8. 本研究分離出二株新的斑點熱立克次體菌株, 分別來自板齒鼠血蜱及龜形花蜱, 其基因序列分析板齒鼠血蜱之立克次體 OmpB 全長序列最接近 Rickettsia hulinensis 4768/4858 (99%),OmpA 全長序列最接近 Rickettsia heilongjiangensis 3148/3183 (99%) 龜形花蜱之立克次體 OmpB 全長序列最接近 Rickettsia aeschlimannii 4793/4894 (98%),OmpA 全長序列最接近 Rickettsia raoultii 3124/3188 (98%), 應更進一步進行特性分析以瞭解其致病的可能性 53

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64 99Lepm Lepm182 97Lepm169 97Lepm095 97Lepm008 99Lepm Lepm Lepm Lepm Lepm Lepm Lepm Lepm Lepm Lepm327 98Lepm318 97Lepm079 99Lepm Lepm Lepm Lepm Lepm325 99Lepm Lepm057 99Lepm Lepm Lepm Lepm Lepm344 97Lepm084 98Lepm294 97Lepm150 99Lepm Lepm Lepm Lepm Lepm Lepm Lepm Lepm Lepm Lepm284 97Lepm046 97Lepm135 97Lepm181 97Lepm017 97Lepm018 97Lepm061 97Lepm034 97Lepm089 97Lepm020 97Lepm088 97Lepm045 97Lepm178 97Lepm192 97Lepm026 97Lepm096 97Lepm139 97Lepm042 97Lepm075 97Lepm076 97Lepm087 97Lepm151 97Lepm Lepm Lepm546 98Lepm551 97Lephu204 98Lepm562 L.Kirs.cyno L.Inte.icte L.inte.canicola 99Lepm Lepm Lepm 643 Pathogenic Leptospira 99Lepm Lepm Lepm Lepm Lepm Lepm Lepm Lepm348 97Lepm164 L.geno1.sicuani 97Lepm091 97Lephu211 98Lepm317 99Lepm Lepm166 97Lepm176 97Lepm163 97Lepm081Cul 97Lepm132 97Lepm038 97Lepm027cul 98Lepm347 98Lepm326 98Lepm315 98Lepm295 99Lepm Lepm Lepm Lepm Lepm145 97Lepm085 97Lepm165 97Lepm144 98Lepm346 98Lepm324 97Lepm062 97Lepm005 97Lepm043 97Lepm024 98Lepm558 97Lepm146 97Lepm154 97Lepm153 97Lepm004 99Lepm 624 L.Borg.Ballum 99Lepm Lepm Lepm Lepm Lepm Lepm Lepm Lepm Lepm Lepm Lepm286 98Lepm Lepm Lepm343 98Lepm Lepm059 97Lepm159 97Lepm168 97Lepm189 97Lepm190 98Lepm289 99Lepm Lepm Lepm Lepm065 99Lepm 769 L.weilli. cell L.ale.manh L.nogu.panama L.santa.shermanni L.inadai.lyme wxwy L.Fainei.Hurt L.Bif.Patoc L.illini.illini 圖一 鉤端螺旋體菌 16S 序列親緣關係圖 64

65 } ~ { z ~ } ~ z ƒ { {~ { z} } ~~ { ~ { ~ ƒ B.val-TM1(Taiwan) EF D010F DF C009F B.val-KR3(Taiwan) 9556 C007F S ƒ {{ ~ 8893t F F 8979A B 8977M CF C009F D010M B.val(UK) B.val(FRANK) }} B.afzelii-PKo B.afzelii(BO23) B.lu-PoTiB6 B.garinii-PBi B.garinii(PBI) B.garinii-TN18 B.garinii-TN11 ƒƒ } } ƒ { zz { B. valaisiana-related B.lu-PoAnB1 B.lu-PotiB3 B.b-B31 B.burgdorferi-TN19 B.burgdorferi-TN20 圖二 萊姆疏螺旋體菌 5S-23S 序列親緣關係圖 65

66 圖三 莫拉克風災鉤端螺旋體疫情人體與環境檢體之序列親緣關係圖莫拉克風災鉤端螺旋體疫情人體與環境檢體之序列親緣關係圖 66

67 tick(I. g) chigger mite(l. p) 8665Laelaps mite IIchigger mite(l. p) 8637flea R. conorii 8643chigger mite(l. p) 8683tick II(I. g) 8633chigger mite(l. p) 8647chigger mite(l. p) 8637M chigger mite(l. p) 8655flea 8677chigger mite(l. p) 8660kindey tick II(I. g) 8683chigger mite(l. p) 8671chigger mite(l. p) 8648flea 8663chigger mite(l. p) 8636spleen-p1 8653chigger mite(l. p) 8655Laelaps mite IIchigger mite(l. p) 8641flea 8658liver 8673chigger mite(l. p) 8670chigger mite(l. p) 8683tick(I. g) flea 8642Laelaps mite 8679chigger mite(l. p) Rickettsia sp. IG spleen-p spleen-p chigger mite(l. p) R. rickettsii Laelaps mite flea 8661Laelaps mite 35 R. slovaca R. sibirica 25 R. parkeri 55 R. africae 53 R. honei R. heilongjiangensis R. japonica MB80-2(Korea) R. aeschlimannii R. rhipicephali R. massiliae Rickettsia sp.twkm01 R. montanensis R. tamurae R. helvetica R. asiatica R. akari MB97-2(Korea) MB103-2(Korea) chigger mite(l. p) 8672chigger mite(l. p) 8678chigger mite(l. p) 8672M chigger mite(l. d) MB115-1(Korea) R. australis 8781M chigger mite(l. d) 8781chigger mite(l. d) MB74-1(Korea) M chigger mite(l. d) 8683M chigger mite(l. d) chigger mite(l. d) 8648liver liver 39 R. felis R. typhi 99 R. prowazekii Group1, R. conorii and related species Group2, Rickettsia sp. IG-1 and related species Group3, R. rickettsia and related species Group4, R. australis and related species Group5, R. felis and related species 0.05 圖四 連江縣斑點熱立克次體 OmpB 部分序列親緣關係圖, 為連江縣菌株 67

68 kidney 8684Laelaps mite 8652liver 8673flea 8637flea 8643kidney tick(I. g) 8661Laelaps mite 8682flea 8644kidney 8648Laelaps mite 8648spleen-b2 8648kidney 63 Rickettsia rickettsii 8764chigger mite(l. d) 8655flea 8660flea 8683chigger mite(l. p) 8660tick(I. g) 8677kidney 8653liver tick(I. g) 8648flea 8637liver 8636kidney kidney 8634kidney 8670liver 8636liver Rickettsia sp. DaE100R Rickettsia sp.ig-1 37 Rickettsia africae Rickettsia sibirica Rickettsia parkeri 66 Rickettsia sp.a-167(astrakhan) Rickettsia sp.ittr Rickettsia honei Rickettsia sp.tt kidney 8673liver 8671chigger mite(l. p) 8670chigger mite(l. p) liver 8648M chigger mite(l. p) Rickettsia conorii 88 MG98-1(Korea) 8678kidney 8671liver 8660Laelaps mite 8684kidney chigger mite(l. p) 8679kidney Rickettsia amblyommii 53 Rickettsia solvaca Rickettsia sp. RpA4 Rickettsia aeschlimannii Rickettsia sp. DnS M chigger mite(l. p) 63 Rickettsia japonica 11 Rickettsia heilongjiangensis Rickettsia sp. DnS28 Rickettsia rhipicephali Rickettsia massiliae 83 Rickettsia sp.twkm01 Rickettsia montana 44 MG97-2(Korea) 97 Rickettsia felis 19 Rickettsia sp.twkm03 20 Rickettsia akari 63 MG98-3(Korea) Rickettsia sp. IRS3 98 Rickettsia tamurae chigger mite(l. p) chigger mite(l. p) 8672chigger mite(l. p) 8683tick(I. g) 8672M chigger mite(l. d) 8658chigger mite(l. p) MG91-2(Korea) chigger mite(l. p) R. australis M chigger mite(l. d) chigger mite(l. d) M chigger mite(l. d) 8785M chigger mite(l. d) 45 MG90-3(Korea) MG87-2(Korea) 13 MG73-6(Korea) chigger mite(l. d) M chigger mite(l. d) 62 Rickettsia sp.twkm chigger mite(l. d) Rickettsia prowazekii 8767tick(I. g) MG97-1(Korea) 47 Rickettsia typhi Rickettsia cooleyi MG116-4(Korea) Rickettsia helvetica 99 Rickettsia asiatica AB Bacterium Rickettsia bellii Group 1, R. rickettsii and related species Group 2, R. conorii and related species Group 3, R. japonica and related species Group 4, R. australis and related species Group 5, R. typhi and related species 0.02 圖五 連江縣斑點熱立克次體 glta 部分序列親緣關係圖, 為連江縣菌株 68

69 Syh-Hu4tick(I. g) 8493liver R. rickettsii R. slovaca Rickettsia sp. IG-1 R. sibirica R. parkeri R. africae R. honei R. conorii M chigger mite(l. d) (960529)chigger mite(l. d) 8620(960227)chigger mite(l. s) R. heilongjiangensis R. japonica 90 MB80-2(Korea) R. aeschlimannii R. rhipicephali 75 R. massiliae 9056F2tick(R. h) tick(R. h) 9044tick(R. h) 7166 Rickettsia sp.twkm01 Freetick(R. h) 8492tick(R. h) tick(R. h) 9073tick(R. h) F2tick(R. h) 9073Ftick(R. h) 8491tick(R. h) tick(R. h) R. montanensis R. tamurae R. helvetica R. asiatica R. felis 8467chigger mite(l. d) 65 R. akari 98 MB97-2(Korea) 54 MB103-2(Korea) 88 R. australis 55 MB115-1(Korea) chigger mite(l. d) chigger mite(l. s) 8452chigger mite(l. d) 85 MB74-1(Korea) 8602chigger mite(l. s) chiggr mite(l. s) chigger mite(l. s) R. typhi 99 R. prowazekii Group 1, R. rickettsii and related species Group 2, R. conorii and related species Group 3, Rickettsia sp. TwKM01 and related species Group 4, R. felis and related species Group 5, R. australis and related species 0.05 圖六 金門縣斑點熱立克次體 OmpB 部分序列親緣關係圖, 為金門縣菌株 69

70 tick(R. h) 9056F2tick(R. h) 9044tick(R. h) F2tick(R. h) 8493tick(R. h) 8504tick(R. h) 85 Shy-Hu6tick(I. g) Rickettsia sp.twkm tick(R. h) Rickettsia rhipicephali 10 Rickettsia massiliae Rickettsia sp. DnS14 Rickettsia sp. DnS28 14 Rickettsia sp. RpA4 Rickettsia aeschlimannii Rickettsia montana 9 Rickettsia japonica 61 Rickettsia heilongjiangensis Rickettsia amblyommii 1254 Rickettsia solvaca Rickettsia parkeri Rickettsia africae 66 Rickettsia sp.a-167(astrakhan) Rickettsia sp.ittr 12 Rickettsia honei Rickettsia sibirica 13 Rickettsia sp.tt MG98-1(Korea) Rickettsia conorii 9068Ftick(R. h) 8620(960529)chigger mite(l. s) kidney 8466spleen Laelaps 8476kidney Rickettsia sp.ig-1 Rickettsia sp. DaE100R 8510Laelaps 8493spleen 9072tick(R. h) M chigger mite(l. d) 8617flea 8981M chigger mite(l. d) (960529)chigger mite(l. d) Rickettsia rickettsii 8506liver liver 8897M tick(r. h) 9072F2tick(R. h) tick(R. h) Rickettsia prowazekii Rickettsia typhi chigger mite(l. s) spleen 8469liver 9 MG97-1(Korea) F1tick(R. h) 67 Rickettsia akari 31 MG98-3(Korea) Rickettsia sp. IRS3 98 Rickettsia tamurae R. australis MG73-6(Korea) MG91-2(Korea) MG90-3(Korea) MG87-2(Korea) 8452chigger mite(l. d) Rickettsia sp.twkm chigger mite(l. d) 8594chigger mite(l. s) Rickettsia cooleyi MG116-4(Korea) Syh-Hu3tick(I. g) Rickettsia felis 8902M chigger mite(l. d) Rickettsia sp.twkm03 MG97-2(Korea) 8510kidney 8509liver Rickettsia helvetica Rickettsia asiatica AB Bacterium Rickettsia bellii Group 1, Rickettsii sp. TwKM01 and related species Group 2, R. conorii and related species Group 3, R. rickettsii and related species Group 4, R. typhi and related species Group 5, R. australis and related species Group 6, R. felis and related species 0.02 圖七 金門縣斑點熱立克次體 glta 部分序列親緣關係圖, 為金門縣菌株 70

71 99 R. rickettsii spleen 11 R. slovaca Rickettsia sp. IG chiggr mite(l. d) R. sibirica R. parkeri R. africae 44 R. honei liver 8727M chigger mite(l. d) R. conorii 8722chiggr mite(l. d) liver 51 R. heilongjiangensis 99 R. japonica 96 MB80-2(Korea) Laelaps mite flea R. aeschlimannii R. rhipicephali 63 R. massiliae M tick(i. g) M chigger mite(l. d) 71 Rickettsia sp.twkm M chigger mite(l. d) 49 R. montanensis R. tamurae R. helvetica R. asiatica R. felis chiggr mite(l. d) 64 R. akari MB97-2(Korea) MB103-2(Korea) 87 R. australis 59 MB115-1(Korea) 77 MB74-1(Korea) chiggr mite(l. d) chiggr mite(l. d) R. typhi 100 R. prowazekii Group 1, R. rickettsii and related species Group 2, Rickettsia sp. IG-1 and related species Group 3, R. conorii and related species Group 4, Rickettsia sp. TwKM01 and related species Group 5, R. felis and related species Group 6, R. australis and related species 0.05 圖八 澎湖縣斑點熱立克次體 OmpB 部分序列親緣關係圖, 為澎湖縣菌株 71

72 Rickettsia heilongjiangensis chiggr mite(l. d) Rickettsia japonica Rickettsia sp. DnS28 Rickettsia aeschlimannii 20 Rickettsia sp. RpA4 Rickettsia sp.twkm01 79 Rickettsia massiliae Rickettsia rhipicephali Rickettsia sp. DnS14 Rickettsia montana Rickettsia amblyommii Rickettsia solvaca Rickettsia parkeri 66 Rickettsia sp.a-167(astrakhan) Rickettsia sp.ittr 16 Rickettsia africae Rickettsia honei Rickettsia sibirica Rickettsia sp.tt kindey 8694tick2(I. g) MG98-1(Korea) 88 Rickettsia conorii chiggr mite(l. d) 8703chiggr mite(l. d) Rickettsia sp.ig chiggr mite(l. d) chiggr mite(l. d) 8730chiggr mite(l. d) Rickettsia sp. DaE100R 8696kindey 8716liver 8721kindey liver 8702chiggr mite(l. d) 31 Rickettsia rickettsii 8709kindey liver 8709spleen kindey 8706spleen 8695chiggr mite(l. d) Rickettsia akari MG98-3(Korea) Rickettsia sp. IRS3 Rickettsia tamurae R. australis MG91-2(Korea) MG90-3(Korea) MG87-2(Korea) MG73-6(Korea) Rickettsia sp.twkm02 Rickettsia cooleyi MG116-4(Korea) Rickettsia sp.twkm03 Rickettsia felis MG97-2(Korea) spleen Rickettsia helvetica 99 Rickettsia asiatica AB Bacterium Rickettsia prowazekii 8696spleen 8699kindey 8706kindey 8702spleen 8723liver Rickettsia typhi MG97-1(Korea) 8860tick(I. g) Rickettsia bellii Group1, R. japonica and related species Group2, R. conorii and related species Group3, Rickettsia sp. IG-1 and related species Group4, R. rickettsii and related species Group5, R. typhi and related species Group6, R. felis and related species 0.02 圖九 澎湖縣斑點熱立克次體 glta 部分序列親緣關係圖, 為澎湖縣菌株 72

73 9118spleen 9150spleen 9117spleen 9114liver 9141liver 9151liver liver 9132liver Group 1, R. conorii and related species 9114spleen R. conorii 9118kidney spleen 9133spleen 9116spleen 9141spleen 59 R. rickettsii R. slovaca 22 Rickettsia sp. IG-1 R. sibirica 36 R. parkeri 54 R. africae R. honei 56 R. heilongjiangensis 99 R. japonica 90 MB80-2(Korea) chigger mite chigger mite 70 R. aeschlimannii Group 2. Rickettsia sp. TwKM01 and related species R. rhipicephali R. massiliae 68 Rickettsia sp.twkm01 46 R. montanensis R. tamurae R. helvetica 99 R. asiatica R. felis R. akari MB103-2(Korea) MB97-2(Korea) MB74-1(Korea) R. australis MB115-1(Korea) R. prowazekii R. typhi 9105liver Group 3. R. typhi and related species 0.02 圖十 宜蘭縣斑點熱立克次體 OmpB 部分序列親緣關係圖, 為宜蘭縣菌株 73

74 liver 9142liver liver 9136chigger mite 9113liver spleen MG98-1(Korea) 9131liver spleen R. conorii 9132spleen 9104liver R. sibirica 65 Rickettsia sp.a-167(astrakhan) Rickettsia sp.ittr R. africae R. honei Rickettsia sp.tt-118 R. parkeri 59 R. rickettsii Rickettsia sp. DaE100R chigger mite Laelaps mite 87 Rickettsia sp.ig chigger mite R. amblyommii R. solvaca Rickettsia sp. DnS14 R. aeschlimannii chigger mite Rickettsia sp. DnS Rickettsia sp. RpA Laelaps mite Laelaps mite R. japonica R. heilongjiangensis R. massiliae R. rhipicephali 82 Rickettsia sp.twkm01 R. montana MG97-2(Korea) Rickettsia sp.twkm liver 26 R. felis R. cooleyi 6 61 MG116-4(Korea) 78 R. akari MG98-3(Korea) 32 Rickettsia sp. IRS R. tamurae R. australis kidney kidney kidney MG73-6(Korea) MG91-2(Korea) MG90-3(Korea) 9152kidney MG87-2(Korea) Rickettsia sp.twkm02 R. helvetica R. asiatica 99 AB Bacterium Group 1. R. conorii and related species Group 2. Rickettsia sp. IG-1 and related species Group 3. R. japonica and related species Group 4. R. felis and related species Group 5. Rickettsia sp. TwKM02 and related species R. prowazekii 9142liver 9111spleen 9103spleen R. typhi 9132spleen spleen spleen 9104liver spleen 9154spleen-1 MG97-1(Korea) 9114liver 9103liver liver 9134liver 9154spleen 9137spleen R. bellii Group 6. R. typhi and related species 0.02 圖十一 宜蘭縣斑點熱立克次體 glta 部分序列親緣關係圖, 為宜蘭縣菌株 74

75 9165liver 9168liver 9169Mchigger mite 8437chigger mite 9224spleen R. rickettsii 8445BMchigger mite 8442chigger mite 9191liver tick Rickettsia sp. IG spleen liver chigger mite 9171Mchigger mite 8443AMchigger mite 8445Bchigger mite 8443Bchigger mite BMchigger mite 8592Mchigger mite Achigger mite 8444BMchigger mite Achigger mite 8446Achigger mite 63 R. conorii 8579M1chigger mite M2chigger mite R. slovaca 38 R. sibirica R. parkeri 55 R. africae R. honei R. heilongjiangensis 9211spleen 9219liver 9180liver 9165spleen spleen R. montanensis R. tamurae R. helvetica 99 R. asiatica R. felis R. akari MB97-2(Korea) MB103-2(Korea) R. australis MB115-1(Korea) chigger mite 8587chigger mite Achigger mite Dchigger mite 8573chigger mite 8444Bchigger mite MB74-1(Korea) chigger mite 9182Mchigger mite 8441Bchigger mite chigger mite R. japonica 89 MB80-2(Korea) 65 R. massiliae 81 Rickettsia sp.twkm01 52 R. rhipicephali R. aeschlimannii spleen chigger mite 8437Mchigger mite Mchigger mite 8440Bchigger mite 8440Achigger mite 9192Mchigger mite 8441Achigger mite chigger mite R. typhi R. prowazekii Group1, R. rickettsii and related species Group 2, Rickettsia sp. IG-1 and related species Group 3, R. conorii and related species Group 4, Rickettsia sp. TwKM01 and related species Geoup 5, Rickettsia sp. MB74-1 and related species 0.05 圖十二 花蓮縣斑點熱立克次體 OmpB 部分序列親緣關係圖, 為花蓮縣菌株 75

76 spleen 9211liver 9207spleen 9168spleen 9184spleen 9184liver 9178liver 9219spleen Rickettsia sp.ig liver 9198liver 9224spleen 9180liver 9207liver 9183spleen 9191liver Rickettsia sp. DaE100R R. rickettsii 9170flea 8437chigger mite 8446Achigger mite 8445Bchigger mite MG98-1(Korea) R. conorii 8445MAchigger mite 8443MBchigger mite 8443MAchigger mite 8444Bchigger mite Rickettsia sp.tt-118 Rickettsia sp.a-167(astrakhan) Rickettsia sp.ittr R. africae R. honei R. sibirica R. parkeri R. amblyommii R. solvaca Rickettsia sp. DnS liver 9208spleen 9214liver 9161spleen 9219liver R. aeschlimannii 9182liver 9217liver 9233spleen 9198spleen Rickettsia sp. RpA4 9165spleen 9233liver Rickettsia sp. DnS spleen 9180spleen 9168liver 9208liver R. heilongjiangensis R. japonica spleen R. massiliae R. rhipicephali R. montana 8580Mchigger mite 8581chigger mite Rickettsia sp.twkm01 MG97-2(Korea) R. felis Rickettsia sp.twkm03 R. akari MG98-3(Korea) Rickettsia sp. IRS3 R. tamurae 8579Mchigger mite 8592Mchigger mite R. australis MG73-6(Korea) MG91-2(Korea) 8441Bchigger mite MG90-3(Korea) 8429chigger mite 8440Achigger mite 8435chigger mite 8571chigger mite 8441Achigger mite 8436chigger mite chigger mite 8437Mchigger mite Mchigger mite 8440Bchigger mite MG87-2(Korea) 8443Dchigger mite Rickettsia sp.twkm chigger mite R. cooleyi MG116-4(Korea) R. helvetica R. asiatica AB Bacterium 100 Group1, Rickettsia sp. IG-1 and related species Group 2, R. rickettsii and related species R. prowazekii R. typhi 9183kidney 9186liver Mtick 9165liver Group 3, R. conorii and related species Group 4, R. japonica and related species 9166liver 9216spleen MG97-1(Korea) 9161chigger mite Group 5, R. typhi and related species Group 6, Rickettsia sp. TwKM02 and related species R. bellii 0.02 圖十三 花蓮縣斑點熱立克次體 glta 部分序列親緣關係圖, 為花蓮縣菌株 76

77 Rickettsia sp. IG chigger mite Mtick 8560tick 8552tick 8518tick 8552Mtick R. slovaca R. rickettsii Mtick chigger mite R. conorii Mchigger mite Mtick Mchigger mite Mtick Mtick-1 46 R. sibirica R. parkeri 54 R. africae R. honei 39 R. heilongjiangensis 99 R. japonica 94 MB80-2(Korea) 64 R. aeschlimannii 78 R. rhipicephali 62 R. massiliae Rickettsia sp.twkm01 R. tamurae 36 R. montanensis R. helvetica R. asiatica 66 R. akari 94 MB97-2(Korea) MB103-2(Korea) 93 R. australis 54 MB115-1(Korea) chigger mite chigger mite chigger mite MB74-1(Korea) chigger mite chigger mite chigger mite chigger mite chigger mite chigger mite R. felis R. typhi 100 R. prowazekii Group 1, Rickettsia sp. IG-1 and related species Group 2, R. rickettsii and related species Group 3, R. conorii and related species Group 4, Rickettsia sp. MB74-1 and related species 0.05 圖十四 台東縣斑點熱立克次體 OmpB 部分序列親緣關係圖, 為台東縣菌株 77

78 Mtick tick 8518Mtick chigger mite 9281tick Rickettsia sp.ig tick tick 8560Mtick tick tick 8518tick 8560tick Rickettsia sp. DaE100R 60 R. rickettsii chigger mite R. africae 66 Rickettsia sp.a-167(astrakhan) Rickettsia sp.ittr Rickettsia sp.tt-118 R. honei 15 R. sibirica 30 R. parkeri 8527spleen Mchigger mite Mtick 8550kidney 66 MG98-1(Korea) R. conorii Mchigger mite R. amblyommii 54 R. solvaca Rickettsia sp. RpA4 R. aeschlimannii 64 R. japonica 93 R. heilongjiangensis 12 Rickettsia sp. DnS28 Rickettsia sp. DnS14 R. massiliae R. rhipicephali Rickettsia sp.twkm01 R. montana R. akari 27 MG98-3(Korea) Rickettsia sp. IRS3 98 R. tamurae 12 R. australis MG73-6(Korea) MG91-2(Korea) chigger mite chigger mite chigger mite 8539Mtick MG90-3(Korea) 15 MG87-2(Korea) 3 Rickettsia sp.twkm chigger mite chigger mite 9289Mchigger mite chigger mite chigger mite chigger mite chigger mite chigger mite 56 R. cooleyi MG116-4(Korea) Rickettsia sp.twkm liver spleen MG97-2(Korea) 20 R. felis R. helvetica 99 R. asiatica AB Bacterium Group 1. Rickettsia sp. IG-1 and related species Group 2. R. rickettsii and related species Gruop 3. R. conorii and related species 9256spleen R. prowazekii 9244liver R. typhi spleen MG97-1(Korea) chigger mite Group 4. R. typhi and related species Group 5. Rickettsia sp. TwKM02 and related species Group 6. R. felis and related species R. bellii 0.02 圖十五 台東縣斑點熱立克次體 glta 部分序列親緣關係圖, 為台東縣菌株 78

79 spleen 9483mite 9502flea 9573liver 9508liver 9499flea 9481mite 9535flea 9533flea 9561liver 9492spleen R. japonica 87 MB80-2(Korea) R. heilongjiangensis R. africae 45 R. honei 52 R. parkeri R. sibirica R. conorii Rickettsia sp. IG-1 R. rickettsii R. slovaca R. aeschlimannii R. rhipicephali R. massiliae Rickettsia sp.twkm01 R. montanensis R. tamurae R. helvetica 99 R. asiatica R. felis R. akari MB97-2(Korea) MB103-2(Korea) MB74-1(Korea) R. australis MB115-1(Korea) R. typhi R. prowazekii Group 1. R. japonica and related strains 0.02 圖十六 桃園縣斑點熱立克次體 OmpB 部分序列親緣關係圖, 為桃園縣菌株 79

80 liver 9454tick 9470tick 9419tick 9454tick2 9466spleen 9459liver 9454tick1 9454tick3 9585tick 9431spleen 9436spleen 9430spleen 9428liver 9426liver 9434spleen 14 R. japonica 60 R. heilongjiangensis R. aeschlimannii Rickettsia sp. DnS28 Rickettsia sp. RpA4 32 Rickettsia sp. DnS14 R. amblyommii R. solvaca R. parkeri 88 R. conorii 4139 MG98-1(Korea) R. sibirica 6 R. africae R. honei Rickettsia sp.tt-118 Rickettsia sp.a-167(astrakhan) Rickettsia sp.ittr R. massiliae 81 R. rhipicephali 39 Rickettsia sp.twkm01 R. montana MG87-2(Korea) Rickettsia sp.twkm02 MG90-3(Korea) R. rickettsii 29 Rickettsia sp. DaE100R 38 Rickettsia sp.ig MG73-6(Korea) MG91-2(Korea) R. australis Rickettsia sp. IRS3 R. tamurae R. akari MG98-3(Korea) R. felis MG97-2(Korea) Rickettsia sp.twkm03 R. cooleyi MG116-4(Korea) R. helvetica R. asiatica AB Bacterium 100 Group, R. japonica and related strains R. prowazekii 100 R. typhi MG97-1(Korea) R. bellii 0.02 圖十七 桃園縣斑點熱立克次體 glta 部分序列親緣關係圖, 為桃園縣菌株 80

81 9085liver 9093spleen 9085spleen 9102liver 9094liver 9094spleen 9090liver 9090spleen 9102spleen 9095liver 9091spleen 9097liver 9097spleen 9697liver 9088spleen 9101spleen 9089spleen R. rickettsii 9087liver 9098liver 9084liver R. slovaca Rickettsia sp. IG-1 R. parkeri R. sibirica R. africae R. honei R. conorii Group 1. R. rickettsii and related strains R. heilongjiangensis spleen 99 R. japonica Group 2. R. japonica and related strains MB80-2(Korea) 68 R. aeschlimannii R. rhipicephali R. massiliae 67 Rickettsia sp.twkm01 41 R. montanensis R. tamurae R. helvetica 99 R. asiatica R. felis R. akari MB97-2(Korea) MB103-2(Korea) MB74-1(Korea) R. australis MB115-1(Korea) R. typhi R. prowazekii 0.05 圖十八 台中縣斑點熱立克次體 OmpB 部分序列親緣關係圖, 為台中縣菌株 81

82 Rickettsia sp.a-167(astrakhan) Rickettsia sp.ittr Rickettsia sp.tt-118 R. africae R. honei 38 R. sibirica R. conorii 31 R. rickettsii 60 Rickettsia sp. DaE100R R. amblyommii 54 R. solvaca 23 Rickettsia sp. DnS14 Rickettsia sp. DnS28 Rickettsia sp. RpA4 R. japonica R. heilongjiangensis liver R. aeschlimannii 35 R. massiliae MG98-1(Korea) 39 R. parkeri Rickettsia sp.ig R. rhipicephali Rickettsia sp.twkm liver R. montana MG90-3(Korea) Rickettsia sp.twkm02 MG87-2(Korea) MG73-6(Korea) MG91-2(Korea) R. australis R. akari MG98-3(Korea) Rickettsia sp. IRS3 R. tamurae R. felis R. helvetica R. cooleyi MG116-4(Korea) MG97-2(Korea) Rickettsia sp.twkm03 R. asiatica 99 AB Bacterium Group 1. R. japonica and related strains R. prowazekii 99 R. typhi MG97-1(Korea) R. bellii 0.02 圖十九 台中縣斑點熱立克次體 glta 部分序列親緣關係圖, 為台中縣菌株 82

83 spleen 9419tick 9585tick 9434spleen 9437liver 9447spleen 9454tick3 9470tick 9454tick2 9454tick1 9454tick R. japonica R. sibirica Group 1, R. japonica and related strains 56 R. conorii 49 Rickettsia sp. IG-1 21 R. slovaca 23 R. rickettsii Group 2, R. rickettsii and related strains flea 69 R. aeschlimannii R. rhipicephali R. massiliae Rickettsia sp.twkm01 R. montanensis R. tamurae R. helvetica 99 R. asiatica 98 R. felis Gruop 3, R. felis and related strains 9433flea MB80-2(Korea) R. heilongjiangensis 40 R. africae 45 R. honei 52 R. parkeri R. akari MB97-2(Korea) MB103-2(Korea) MB74-1(Korea) R. australis MB115-1(Korea) R. typhi R. prowazekii 0.05 圖二十 高雄屏東斑點熱立克次體 OmpB 部分序列親緣關係圖, 為高雄屏東菌株 83

84 R. japonica 9470liver 9454tick2 9454tick 9466spleen 9585tick 9454tick3 9470tick 9459liver 9419tick 9454tick1 R. heilongjiangensis Rickettsia sp. DnS28 R. aeschlimannii Rickettsia sp. DnS14 34 Rickettsia sp. RpA4 54 R. amblyommii R. solvaca R. parkeri 88 R. conorii 4138 MG98-1(Korea) R. africae 10 R. honei R. sibirica Rickettsia sp.tt-118 Rickettsia sp.a-167(astrakhan) Rickettsia sp.ittr R. massiliae 82 R. rhipicephali 41 Rickettsia sp.twkm01 R. montana MG87-2(Korea) Rickettsia sp.twkm02 MG90-3(Korea) MG73-6(Korea) MG91-2(Korea) R. australis R. rickettsii 29 Rickettsia sp. DaE100R 37 Rickettsia sp.ig Rickettsia sp. IRS3 R. tamurae R. akari MG98-3(Korea) Rickettsia sp.twkm03 MG97-2(Korea) R. felis R. cooleyi MG116-4(Korea) R. helvetica R. asiatica AB Bacterium 99 Group, R. Japonica and related strains R. prowazekii 99 R. typhi MG97-1(Korea) R. bellii 0.02 圖二十一 高雄屏東斑點熱立克次體 glta 部分序列親緣關係圖, 為高雄屏東菌株 84

85 圖二十二 洛磯山革蜱 (Dermacentor andersoni) 85

86 圖二十三 金門縣鼠類外寄生節肢動物季節消長 由上而下分別為蜱 恙蟲 厲蟎 跳蚤及蝨全部採獲數與鼠數之比率 86

87 表一 台灣地區鼠類捕獲數 ( 以鼠種別 ) 捕獲鼠種離島東部西部總捕獲數目捕獲率 R. losea % S. murinus % M. caroli % B. indica % M. musculus % R. exulans % A. agrarius % R. norvegicus % N. coxingi % C. erythraneus % 總計

88 表二 台灣地區鼠類捕獲數 ( 以縣市別 ) ˆ Š Œ ˆ ˆ Š Œ ˆ ˆ Š Œ ˆ Ž S. murinus % R. losea % R. losea % R. losea % S. murinus % M. musculus % M. musculus % M. musculus % S. murinus % M. caroli % M. caroli % M. caroli % R. norvegicus 0 0% R. norvegicus 0 0% R. norvegicus % ˆ Š Œ ˆ ˆ Š Œ ˆ ˆ Š Œ ˆ R. losea % R. losea % S. murinus % B. indica % B. indica % R. losea % C. erythraneus % R. exulans % M. caroli % M. caroli % A. agrarius % š B. indica % N. coxingi % S. murinus % M. musculus % R. norvegicus % M. caroli % N. coxingi % M. musculus % R. norvegicus % ˆ Š Œ ˆ ˆ Š Œ ˆ ˆ Š Œ ˆ œ R. losea % R. losea % R. losea % M. caroli % S. murinus % S. murinus % Ÿ S. murinus % B. indica % M. caroli % š B. indica % ž M. caroli % M. musculus % A. agrarius % A. agrarius % B. indica % R. norvegicus % R. norvegicus % A. agrarius % M. musculus 0 0% M. musculus 0 0% R. norvegicus %

89 表三 台灣地區鼠類鉤端螺旋體血清抗體陽性率 ( 以縣市別 ) 縣市 檢測數目 Ab titer >100X 陽性率 連江縣 % 金門縣 % 澎湖縣 % 小計 % 宜蘭縣 % 花蓮縣 % 台東縣 % 小計 % 桃園縣 % 台中縣 % 高雄屏東縣 % 小計 % 總計 % 89

90 表四 台灣地區鼠類鉤端螺旋體血清抗體陽性率 ( 以鼠種別 ) 鼠種 Ab titer >100X/ Ab titer >100X/ ª Ab titer >100X/ total Ab titer >100X/ 總陽性率 R. losea 108/220 77/186 62/ / % S. murinus 12/68 9/66 5/84 26/ % M. caroli 0/1 0/31 5/67 5/ % B. indica 0 12/37 8/39 20/ % M. musculus 1/57 0/3 1/10 2/ % R. exulans 0 5/27 0 5/ % A. agrarius 0 1/13 1/10 2/ % R. norvegicus 0/1 1/2 4/7 5/ % N. coxingi 0 1/2 0 1/2 50 % 總計 121/ /367 86/ / % 90

91 表五 99 年金門合作捕鼠計畫之鼠類鉤端螺旋體血清抗體陽性率 鼠種 檢測數目 Ab titer >100X 陽性率 R. losea % S. murinus % R. novegicus % M. musculus 0 0 0% 總計 % 91

92 表六 台灣地區鼠類鉤端螺旋體感染率 ( 以縣市別 ) 縣市 檢測數目 Real-time PCR + 陽性率 連江縣 % 金門縣 % 澎湖縣 % 小計 % 宜蘭縣 % 花蓮縣 % 台東縣 % 小計 % 桃園縣 % 台中縣 % 高雄屏東縣 % 小計 % 總計 % 92

93 表七 台灣地區鼠類鉤端螺旋體感染率 ( 以鼠種別 ) 鼠種 Real-time PCR+ / Real-time PCR+ / ª Real-time PCR+ / Total Real-time PCR+ / 總感染率 R. losea 81/220 48/199 48/ / % S. murinus 3/68 27/85 15/89 45/ % B. indica 0 15/44 9/39 24/ % M. caroli 0/1 4/37 2/80 6/ % R. exulans 0 6/26 0 6/ % A. agrarius 0 3/13 2/11 5/ % M. musculus 0/57 1/5 0/11 1/ % R. novegicus 0/1 0/2 3/7 3/10 30 % N. coxingi 0 1/2 0 1/2 50 % 總計 84/ /413 79/ / % 93

94 表八 台灣地區鼠類鉤端螺旋體培養陽性率 ( 以縣市別 ) 縣市 檢驗數目 培養陽性數 陽性率 連江縣 0 0 0% 金門縣 % 澎湖縣 0 0 0% 小計 % 宜蘭縣 % 花蓮縣 % 台東縣 % 小計 % 桃園縣 % 台中縣 % 高雄屏東縣 % 小計 % 總計 % 94

95 表九 台灣地區鼠類鉤端螺旋體培養陽性率 ( 以鼠種別 ) Š culture +/ «culture +/ «ª culture +/ «Total culture +/ «R. losea 13/154 14/129 9/193 36/ % S. murinus 2/22 0/86 2/89 4/197 2 % M. caroli 0 2/15 0/80 2/ % R. exulans 0 1/26 0 1/ % B. indica 0 0/38 0/39 0/77 0 % A. agrarius 0 2/13 0/11 2/ % M. musculus 0/2 0/3 0/11 0/16 0 % R. novegicus 0/1 0/2 0/7 0/10 0 % N. coxingi 0 0/2 0 0/2 0 % 總計 15/179 19/314 11/430 45/ % 95

96 表十 台灣地區鼠類體外節肢動物萊姆疏螺旋體病原檢測 縣市 蜱種 檢測數目 real-time PCR(+) 陽性率 連江縣 I. granulatus % 金門縣 I. granulatus % 澎湖縣 I. granulatus 2 0 0% 小計 % 宜蘭縣 I. granulatus % 花蓮縣 I. granulatus % 台東縣 I. granulatus % 小計 % 桃園縣 I. granulatus % 台中縣 I. granulatus % 高雄屏東縣 I. granulatus 0 0 0% 小計 % 總數 % 96

97 表十一 99 年金門合作捕鼠計畫之鼠類體外節肢動物萊姆疏螺旋體病原檢測 縣市 蜱種 檢測數目 real-time PCR(+) 陽性率 金門縣 I. granulatus % 97

98 表十二 台灣地區鼠類萊姆疏螺旋體陽性培養 縣市 鼠種 培養陽性數 台東縣 M. caroli 1 98

99 表十三 莫拉克風災鉤端螺旋體疫情 檢體只有一採 * 只有一採 ** 二採 >4 倍二採均無 (MAT titer >100X) (MAT titer <100X) 上升 titer 血液 * 包含 2 個一採 real-time PCR 陽性 ** 包含 4 個一採 real-time PCR 陽性 99

100 表十四 鼠類血清斑點熱立克次體血清抗體陽性率 ( 以縣市別 ) 縣市 檢測數目 R.rickettsii (+) or R.conorii(+) 陽性率 連江縣 % 金門縣 % 澎湖縣 % 小計 % 宜蘭縣 % 花蓮縣 % 台東縣 % 小計 % 桃園縣 % 台中縣 % 高雄屏東縣 % 小計 % 總計 % 100

101 表十五 鼠類血清斑點熱立克次體血清抗體陽性率 ( 以鼠種別 ) 鼠種 離島陽性率 (%) ( 陽性數 / 檢測數 ) 東部陽性率 (%) ( 陽性數 / 檢測數 ) 西部陽性率 (%) ( 陽性數 / 檢測數 ) 總陽性率 (%) ( 陽性數 / 檢測數 ) R. losea 94.5(324/343) 94.4(187/198) 94.8(183/193) 94.6(694/734) S. murinus 1.54(1/65) 5.80(4/69) 0.0(0/85) 2.28(5/219) M. caroli 33.3(9/27) 23.3(7/30) 64.1(50/78) 48.9(66/135) B. indica N.D 97.7(43/44) 76.9(30/39) 88.0(73/83) M. musculus 75.0(24/32) 40.0(2/5) 63.6(7/11) 68.8(33/48) R. exulans N.D 92.3(24/26) N.D 92.3(24/26) A. agrarius N.D 53.9(7/13) 40.0(4/10) 47.8(11/23) R. 100(1/1) 100.0(2/2) 87.5(7/8) 90.9(10/11) norvegicus N. coxingi N.D 50.0(1/2) N.D 50.0(1/2) C. N.D 0.0(0/2) N.D 0.0(0/2) erythraneus 總計 76.7(359/468) 70.8(277/391) 66.37(281/424) 71.5(917/1283) N.D: 未捕獲 101

102 表十六 鼠類血清地方性斑疹傷寒立克次體血清抗體陽性率 ( 以縣市別 ) 縣市 檢測數目 R. typhi(+) 陽性率 連江縣 % 金門縣 % 澎湖縣 % 小計 % 宜蘭縣 % 花蓮縣 % 台東縣 % 小計 % 桃園縣 % 台中縣 % 高雄屏東縣 % 小計 % 總計 % 102

103 表十七 鼠類血清地方性斑疹傷寒立克次體血清抗體陽性率 ( 以鼠種別 ) 鼠種 離島陽性率 (%) ( 陽性數 / 檢測數 ) 東部陽性率 (%) ( 陽性數 / 檢測數 ) 西部陽性率 (%) ( 陽性數 / 檢測數 ) 總陽性率 (%) ( 陽性數 / 檢測數 ) R. losea 2.62(9/343) 1.52(3/198) 2.59(5/193) 2.32(17/734) S. murinus 0.0(0/65) 0.0(0/69) 0.0(0/85) 0.0(0/219) M. caroli 18.5(5/27) 3.33(1/30) 2.56(2/78) 5.93(8/135) B. indica N.D 0.0(0/44) 0.0(0/39) 0.0(0/83) M. musculus 6.25(2/32) 0.0(0/5) 9.09(1/11) 6.25(3/48) R. exulans N.D 0.0(0/26) N.D 0.0(0/26) A. agrarius N.D 15.4(2/13) 0.0(0/10) 8.70(2/23) R. norvegicus N.D 0.0(0/2) 0.0(0/8) 0.0(0/11) N. coxingi N.D 0.0(0/2) N.D 0.0(0/2) C. N.D 0.0(0/2) N.D 0.0(0/2) erythraneus 總計 3.42(16/468) 1.53(6/391) 1.89(8/424) 2.34(30/1283) N.D: 未捕獲 103

104 表十八 鼠類內臟 Rickettsia 屬立克次體 PCR 檢測 ( 以縣市別 ) 縣市 檢測數目 Total PCR(+)* 陽性率 連江縣 % 金門縣 % 澎湖縣 % 小計 % 宜蘭縣 % 花蓮縣 % 台東縣 % 小計 % 桃園縣 % 台中縣 % 高雄屏東縣 % 小計 % 總計 % *spleen, liver or kidney PCR positive 104

105 表十九 鼠類內臟 Rickettsia 屬立克次體 PCR 檢測 ( 以鼠種別 ) 鼠種 離島陽性率 (%) ( 陽性數 / 檢測數 ) 東部陽性率 (%) ( 陽性數 / 檢測數 ) 西部陽性率 (%) ( 陽性數 / 檢測數 ) 總陽性率 (%) ( 陽性數 / 檢測數 ) R. losea 66.2(47/71) 55.7(39/70) 35.0(14/40) 55.3(100/181) M. caroli 45.5(5/11) 100(12/12) 66.7(14/21) 70.5(31/44) S. murinus 37.5(3/8) 75.0(6/8) 45.0(9/20) 50.0(18/36) B. indica (5/6) 72.7(8/11) 76.5(13/17) A. agrarius 0 100(6/6) 40.0(2/5) 72.7(8/11) R. exulans 0 100(6/6) 0 100(6/6) M. musculus 0 100(3/3) 100(3/3) 100(6/6) R (2/2) 25.0(1/4) 50.0(3/6) norvegicus N. coxingi 0 100(2/2) 0 100(2/2) 總計 61.1(55/90) 70.4(81/115) 49.0(51/104) 60.5(187/309) *spleen, liver or kidney PCR positive 105

106 表二十 鼠蜱 Rickettsia 屬立克次體 PCR 檢測 縣市 蜱種 檢測數目 Total PCR(+)* 陽性率 連江縣 I. granulatus % R. haemaphysaloides % 金門縣 I. granulatus % H. formosensis 2 0 0% 澎湖縣 I. granulatus % 小計 % 花蓮縣 I. granulatus % 台東縣 I. granulatus % 小計 % 桃園縣 I. granulatus % R. haemaphysaloides 7 0 0% 台中縣 H. bandicota % I. granulatus % 高雄屏東縣 H. bandicota % 小計 % 總數 % *OmpB PCR(+) or glta PCR(+) 106

107 表二十一 鼠類恙蟲 Rickettsia 屬立克次體 PCR 檢測 縣市 檢測池數 Total PCR(+)* 陽性率 連江縣 % 金門縣 % 澎湖縣 % 小計 % 宜蘭縣 % 花蓮縣 % 台東縣 % 小計 % 總計 % * OmpB PCR(+) or glta PCR(+) 107

108 表二十二 鼠類跳蚤 Rickettsia 屬立克次體 PCR 檢測 縣市 蚤種 檢測數目 Total PCR(+)* 陽性率 連江縣 N. nicanus % 金門縣 N. nicanus % 澎湖縣 N. nicanus % 小計 % 花蓮縣 S. aporus % X. cheopis % 小計 % 桃園縣 N. nicanus % X. cheopis % 台中縣 X. cheopis % 高雄屏東 A. girshami 5 0 0% X. cheopis % 小計 % 總數 % *OmpB PCR(+) or glta PCR(+) 108

109 表二十三 鼠類厲蟎 Rickettsia 屬立克次體 PCR 檢測 縣市 檢測池數 Total PCR(+)* 陽性率 連江縣 % 金門縣 % 澎湖縣 % 小計 % 宜蘭縣 8 0 0% 花蓮縣 % 台東縣 % 小計 % 桃園縣 % 台中縣 7 0 0% 高雄屏東 7 0 0% 小計 % 總計 % OmpB PCR(+) or glta PCR(+) 109

110 表二十四 99 年 1-10 月金門大學吳尹文助理教授送檢鼠數統計 月份 鼠隻數目小黃腹鼠 錢鼠 家鼷鼠 溝鼠 赤腹松鼠 合計 比率 87.88% 8.33% 1.52% 1.52% 0.76% 110

111 表二十五 外寄生節肢動物及鼠類脾肝腎臟 Rickettsia 屬立克次體分佈情形 ± ² ³ µ ¹ º» ¼ º ½ ¾ À Chigger R. con R. ric R. aus R. jap IG-1 I. granulatus R. con R. ric R. aus R. typhi R. con R. ric R. aus R. felis R. typhi R. ric R. felis TwKM01 R. con R. ric R. felis R. aus R.typhi R. jap TwKM01 IG-1 R. con R. typhi TwKM01 R. con R. jap TwKM01 IG-1 R. con R. ric MB74-1 R. typhi R. typhi IG-1 R. con R. ric R. jap R. typhi IG-1 MB74-1 TwKM02 R. con IG-1 R. haemaphysaloides R. con R. ric R. typhi TwKM01 H. bandicota R. jap X. cheopis R. jap R. ric N. nicanus R. con R. ric R. ric TwKM01 R. jap S. aporus R. ric Lealaps spp. R. con R. ric R. con R. ric TwKM01 R. jap IG-1 R. jap Spleen R. con R. ric IG-1 R. con R. ric R. typhi R. ric R. typhi R. felis R. con R. typhi R. ric R. jap IG-1 R. con R. typhi R. felis R. jap R. ric R. R. jap Liver Kidney R. con R. ric R. felis R.con R. ric R. ric R. felis R. typhi R. con R. felis R. con R. ric R. typhi R. con R. ric R. typhi R. con R. felis R. typhi R. con TwKM02 TwKM01 R. ric R. jap R. typhi IG-1 TwKM01 TwKM01 R. typhi R. felis IG-1 R. typhi R. con R. ric IG-1 *R. con: R. conorii, R. ric: R. rickettsii, R. aus: R. australis, R. jap: R. japonica, MB74-1: Rickettsia sp. MB74-1, TwKM01: Rickettsia sp. TwKM01, TwKM02: Rickettsia sp. TwKM02, IG-1: Rickettsia sp. IG-1., R. jap R. felis jap R. jap R. ric R. jap 111