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3 3 287

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6 monocrotophos 0.40 ppm % 6

7 ppm

8 DNA (HPLC) DNA DNA DNA DNA hybridization PCR product sequencing PCR-restriction 8

9 fragment length polymorphism (PCR-RFLP) species-specific primers PCR PCR-SSCP random amplified polymorphic DNA (RAPDs) real-time PCR TaqMan real-time PCR real-time PCR PCR product sequencing PCR-RFLP GMO 92 8 PCR real-time PCR 酶 (Polymerase chain reaction, PCR) ( ) DNA PCR PCR ( 1) ( ) nm 280 nm 2. (Vortex mixer) 3. DNA ,000 g 酶 ABI PRISM 9700 Sequence Detector 8. 酶 ( 2) ABI PRISM 7700 Sequence Detector Roche LightCycler 9. DNA nm 365 nm ph

10 17. 2,000 g 0.1 g mg ( ) 1. DNA RNase (96-100%) DNeasy Tissue 2. 酶 (PCR) ( 3) (1) i myostatin ) F MYF 5 -TTGTGCAAATCCTGAGACTCAT-3 R MYR 5 -ATACCAGTGCCTGGGTTCAT-3 97 bp ii growth hormone) F SWF 5 -TCAGTTTACACTCACCTGATAGCATCT-3 R SWR 5 - GGGTGGTGGAGAGGGGTGAATT bp ( 4) (2) i myostatin ) F MYF 5 -TTGTGCAAATCCTGAGACTCAT-3 R MYR 5 -ATACCAGTGCCTGGGTTCAT-3 P MYP 5 -(FAM)-CCCATGAAAGACGGTACAAGGTATACTG -(TAMRA)-3 97 bp ii growth hormone) F SWF 5 -TCAGTTTACACTCACCTGATAGCATCT-3 R SWR 5 - GGGTGGTGGAGAGGGGTGAATT-3 P SWP 5 -(FAM)-CCTCAATACTCCAGAACCCCTCATT TTCCTC-(TAMRA) bp

11 carboxy-fluorescein (FAM) 3 6-carboxytetramethyl-rhodamine (TAMRA) (3) 苷 (deoxyribonucleotside triphosphate, dntp) 苷 (deoxyadenosine triphosphate, datp) 苷 (deoxycytidine triphosphate, dctp) 苷 (deoxyguanosine triphosphate, dgtp) 苷 (deoxythymidine triphosphate, dttp) 2.5 mm (4) 酶 Taq DNA polymerase (2 U/µL) (5) TaqMan Universal PCR Master Mix ( ABI PRISM 7700) PCR 苷 酶 DNA (6) LightCycler-FastStart DNA Master Hybridization Probes Roche LightCycler) PCR 苷 酶 DNA 3. (ethidium bromide) (agarose) (bromophenol blue) (xylene cyanol FF) (ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt, Na 2 -EDTA) (tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris)) DNA (DNA molecular weight marker) 100-bp DNA Ladder Marker 4. pidm1 ( 5) ( ) 1. (Pipette) 10 µl 20 µl 100 µl 200 µl 1000 µl (Pipette tips) 10 µl 20 µl 200 µl 1000 µl µl 600 µl 1.5 ml 2 ml 5. PCR 200 µl 500 µl 11

12 6. PCR ( 6) Roche LightCycler ml 100 ml 250 ml 500 ml 1000 ml 2000 ml ml µm nitro-cellulose 5 DNase 6 Roche LightCycler ( ) 1. 5 TBE (Tris-borate-EDTA) 54.0 g 27.5 g 0.5 M ph 8.0 EDTA 20.0 ml TBE % 2.0 g 0.5 TBE ml 3. 6 (6 gel loading buffer) 25.0 g 0.25 g 30 ml 100 ml g 10.0 ml 10 mg/ml) 1 µg/ml ( 7) 5. PCR 12

13 (1) 10 PCR ( 15 mm MgCl 2 ) Taq DNA polymerase (2 U/µL) mm dntp µm F µm R DNA ( 100 ng) µl (2) ABI PRISM 7700 Sequence Detector 5 µm F µm R µm P TaqMan Universal PCR Master Mix DNA ( 100 ng) µl (3) Roche LightCycler 5 µm F µm R µm P LightCycler-FastStart DNA Master Hybridization Probes mm MgCl DNA ( 100 ng) µl 7 PCR ( ) DNA 13

14 1. ( ) 2. DNA DNeasy Tissue (ATL proteinase K AL (DNeasy spin column) AW1 AW2 AE ) (1) 25 mg ( 8) 2 ml (2) ATL 180 µl proteinase K 20 µl (3) 55 (4) AL 200 µl (5) (6) (96-100%) 200 µl (7) 6,000 g (8,000 rpm) 1 (8) AW1 500 µl 6,000 g (8,000 rpm) 1 (9) AW2 500 µl 20,000 g (14,000 rpm) 3 (10) 1.5 ml (11) AE 100 µl 1 6,000 g (8,000 rpm) 1 (12) AE 100 µl 1 6,000 g (8,000 rpm) 1 (13) 200 L 1.5 ml DNA (14) ( )3. DNA DNA 10 mg RNA DNA ( ).2.(4). RNase (100 mg/ml) 4 L 2 3. DNA (1) DNA 14

15 (2) DNA 260 nm 280 nm (O.D.) DNA O.D ng/µl DNA DNA O.D. 260 / O.D ( 9) ( ) 1. PCR PCR DNA PCR ( )5.1. PCR 10 PCR dntp DNA polymerase DNA PCR ( )2. PCR 2. PCR min sec sec sec sec min 3. 6 ( ) PCR 2% DNA PCR nm DNA 15

16 4. DNA PCR DNA DNA DNA PCR DNA PCR 108 bp 9 PCR PCR DNA PCR DNA PCR DNA PCR ABI PRISM 9700 ( ) 1. PCR (1) 酶 (Real-time PCR) ABI PRISM 7700 Sequence Detector DNA ( )5.2. Master Mix 20 µl PCR DNA 5 µl PCR 200 g (1,500 rpm) 酶 C 2 min C 10 min C 15 sec C 1 min 54 C 1 min C 45 sec 16

17 (2) 酶 (Real-time PCR) Roche LightCycler PCR DNA ( )5.3. PCR LightCycler-FastStart DNA Master Hybridization Probes 15 µl DNA 5 µl 800 g (3,000 rpm) 酶 C 10 min C 5 sec sec sec C 8 sec C 45 sec 2. 酶 DNA 酶 酶 3. DNA PCR DNA PCR PCR % 2. DNA DNA 17

18 酶 (Polymerase chain reaction, PCR) ( ) 12S ribosomal RNA) F BF 5 -ACATTCTCTACCCAAGAGAATCAAGC-3 R BR 5 -TCCTCTCATGTAGCTAGTGCGTTTA bp 12S ribosomal RNA) F BF 5 -ACATTCTCTACCCAAGAGAATCAAGC-3 R BR 5 -TCCTCTCATGTAGCTAGTGCGTTTA-3 P BP 5 -(FAM)-CCCTCCTCAAATAGATTCAGTGCATCTAACCCT-(TAMRA) bp 酶 (Polymerase chain reaction, PCR) ( ) satellite) F SGF 5 -CCTCTCCAGTGCTGACTTGGA-3 R SGR 5 -AAGCATGACATTGCTGCTAAGTTC bp satellite) F SGF 5 -CCTCTCCAGTGCTGACTTGGA-3 R SGR 5 -AAGCATGACATTGCTGCTAAGTTC-3 P SGP 5 -(FAM)-CACGTGCATGCCCCCTCTCGA-(TAMRA) bp 酶 (Polymerase chain reaction, PCR) 18

19 ( ) 12S ribosomal RNA) F HosF1 5 -GTTATCCAAGTACACCTTCCGGTAT-3 R HosR1 5 -CGTCACCCTCCTTAAATATCACAAA bp 12S ribosomal RNA) F HosF2 5 -GATGGAGAGAAATGGGCTACATTTT-3 R HosR2 5 -ACTGCTAAATCCTCCTTTAGTCTCCAG-3 P HosP 5 -(FAM)-ACCCTAAGAACAAGAACTTTAACCC GGACGA-(TAMRA)-3 99 bp 酶 (Polymerase chain reaction, PCR) ( ) mitochondrial cytochrome b) F DeerF 5 -CATTTATTATCGCAGCACTCGCT-3 R DeerR 5 -AGGTCTGGTACGAATAATACTAGTGAT bp mitochondrial cytochrome b) F DeerF 5 -CATTTATTATCGCAGCACTCGCT-3 R DeerR 5 -AGGTCTGGTACGAATAATACTAGTGAT-3 P DeerP 5 -(FAM)-CCACTTACTCTTCCTCCACGAAACAGGA-(TAMRA) bp 酶 (Polymerase chain reaction, PCR) 19

20 ( ) 12S ribosomal RNA) F KanF 5 -GAGCTTAATTGAAACAGGCA-3 R KanR 5 -ACTTTTCTCCTCTTTTGTATTCC bp 12S ribosomal RNA) F KanF 5 -GAGCTTAATTGAAACAGGCA-3 R KanR 5 -ACTTTTCTCCTCTTTTGTATTCC-3 P KanP 5 -(FAM)-TCCTCGACAAAACCTTAC-(TAMRA) bp (TaqMan ) : DOH92-FD Meyer, R. Candrian, U. and Luthy, J Detection of pork in heated meat products by the polymerase chain reaction. J. AOAC Int. 77: Laube, I., Butschke, A., Zagon, J., Spiegelberg, A., Schauzu, M., Bögl, K. W., Kroh, L. W. and Broll, H Detection method to identify beef in foods by the TaqMan TM technology. Bundesgesundheitsblatt Gesundheitsforsch. Gesundheitsschutz. pp Chikuni, K., Tabata,T., Kosugiyama, M., Monma M. and Saito, M Polymerase chain reaction assay for detection of sheep and goat meats. Meat science. 37:

21 10 1 GMP TGA Mr. Paul Humphrey 30 Dr. Calux

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