TRIpure Reagent 抽提指南

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和幸秉甘
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1 无内毒素高纯度质粒小提中量试剂盒目录号 PL10 使用手册实验室使用, 仅用于体外

2 无内毒素高纯度质粒小提中量试剂盒目录号 :PL1001 适用范围 : 适用于 5-15ml 中等规模无内毒素质粒制备 (mind preparations) 试剂盒组成储存稳定性 : 试剂盒组成保存 50 次 RNase A(10mg/ml 10mg/ml) µl 溶液 P ml 溶液 P2 室温 25 ml 溶液 PIII 室温 35 ml 结合液 PB 室温 45ml 去蛋白液 PE 漂洗液 WB 内毒素清除剂室温室温 4 (1 个月 ) -20 ( 长期 ) 16ml 第一次使用前按说明加指定量乙醇 15 ml 第一次使用前按说明加指定量乙醇 10 ml 洗脱缓冲液 EB 室温 10ml 吸附柱 AC 室温 50 个收集管 (2ml 2ml) 室温 50 个本试剂盒在室温储存 6 个月不影响使用效果 - 1 -

3 储存事项 : 1. 第一次使用时, 将试剂盒所带的全部 RNase A 加入溶液 P1 后 ( 终浓度 100ug/ml) 置于 2-8 保存如果溶液 P1 中 RNase A 失活, 提取的质粒可能会有微量 RNA 残留, 在溶液 P1 中补加 RNase A 即可 2. 环境温度低时溶液 P2 中 SDS 可能会析出浑浊或者沉淀, 可在 37 水浴加热几分钟, 即可恢复澄清, 不要剧烈摇晃, 以免形成过量的泡沫 3. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发氧化 ph 值变化, 各溶液使用后应及时盖紧盖子产品介绍 : 本试剂盒采用改进 SDS- 碱裂解法裂解细胞, 通过独特的内毒素清除剂选择性结合离心除去内毒素, 然后离心吸附柱内的硅基质膜在高盐低 ph 值状态下选择性地结合溶液中的质粒 DNA, 再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除, 最后低盐高 ph 值的洗脱缓冲液将纯净质粒 DNA 从硅基质膜上洗脱产品特点 : 1. 离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜, 柱与柱之间吸附量差异极小, 可重复性好克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端 2. 独有的去蛋白液配方, 可以高效去除核酸酶即使是核酸酶含量丰富的菌株如 JM 系列 HB101 也可以轻松去除有效防止了质粒被核酸酶降解 3. 独特内毒素清除配方, 清除内毒素效果一般小于 <0.1 EU/ug 4. 快速方便, 不需要使用有毒的苯酚氯仿等试剂, 也不需要乙醇沉淀获得的质粒产量高纯度好, 直接可以用于转染酶切转化 PCR 体外转录测序等各种分子生物学实验 - 2 -

4 注意事项 1. 所有的离心步骤如未加说明均在室温完成, 使用转速可以达到 13,000rpm 的传统台式离心机, 如 Eppendorf 5415C 或者类似离心机 2. 溶液 PⅢ 和去蛋白液 PE 中含有刺激性化合物, 操作时要戴乳胶手套, 避免沾染皮肤, 眼睛和衣服若沾染皮肤眼睛时, 要用大量清水或者生理盐水冲洗 3. 提取质粒的量与细菌培养浓度质粒拷贝数等因素有关一般高拷贝质粒建议接种单菌落于 ml 加合适抗生素的 LB 培养基, 过夜培养个小时, 可提取出多达 20µg 的纯净质粒如果所提质粒为低拷贝质粒或大于 10kb 的大质粒, 应适当加大菌体使用量, 使用 5-10 ml 过夜培养物, 同时按比例增加 P1 P2 PⅢ 的用量, 其它步骤相同 4. 得到的质粒 DNA 可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度 OD260 值为 1 相当于大约 50μg/ml DNA 电泳可能为单一条带, 也可能为 2 条或者多条 DNA 条带, 这主要是不同程度的超螺旋构象质粒泳动位置不一造成, 与提取物培养时间长短提取时操作剧烈程度等有关本公司产品正常操作情况下基本超螺旋可以超过 90% 5. 质粒 DNA 确切分子大小, 必须酶切线性化后, 对比 DNA 分子量 Marker 才可以知道处于环状或者超螺旋的质粒, 泳动位置不确定, 无法通过电泳知道其确切大小 6. 洗脱液 EB 不含有螯合剂 EDTA, 不影响下游酶切连接等反应也可以使用水洗脱, 但应该确保 ph 大于 7.5,pH 过低影响洗脱效率用水洗脱, 质粒应该保存在 -20 质粒 DNA 如果需要长期保存, 可以用 TE 缓冲液洗脱 (10mM Tris-HCl, 1mM EDTA,pH 8.0), 但是 EDTA 可能影响下游酶切反应, 使用时可以适当稀释 7. 无内毒素清除剂清除内毒素后, 质粒产量会有损失, 根据不同的宿主菌株会损失 10%-40% 不等的质粒产量 - 3 -

5 操作步骤 :( 实验前请先阅读注意事项 ) 提示 : 第一次使用前请先在漂洗液 WB 瓶和去蛋白液 PE 瓶中加入指定量无水乙醇, 充分混匀, 加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇, 以免多次加入! 将 RNase A 全部加入溶液 P1 中, 混匀, 每次使用后置于 2-8 保存将溶液 PⅢ 放在冰上预冷 1. 取 5-15 ml 毫升过夜培养的菌液,9,000rpm 离心 1-2 分钟, 尽可能的倒干上清, 收集菌体 2. 用 500μl 溶液 P1 重悬菌体沉淀, 涡旋振荡至彻底悬浮, 全部转入一个 2ml 离心管如果有未彻底混匀的菌块, 会影响裂解, 导致提取量和纯度偏低 3. 加 500μl 的溶液 P2, 温和地上下翻转 4-7 次使菌体充分裂解, 室温放置 4 分钟温和地混合, 不要剧烈震荡, 以免基因组 DNA 剪切断裂! 所用时间不应超过 5 分钟! 以免质粒受到破坏此时菌液应变得清亮粘稠, 如果菌体少, 很快清亮粘稠后就可以做下一步, 不是一定要准确的 5 分钟 4. 加 700μl 溶液 PⅢ, 立即温和地上下翻转 4-7 次, 充分混匀, 此时会出现白色絮状沉淀冰上静置 3-5 分钟,13,000rpm 离心 10 分钟, 小心取上清至一个 1.5 毫升的离心管, 冰上预冷加入溶液 PⅢ 后应该立即混匀, 以免产生 SDS 的局部沉淀, 如果上清中还有微小白色沉淀, 可再次离心后取上清 5. 加入 0.1 体积冰预冷的内毒素清除剂到上一步所得上清, 颠倒旋转混匀 7-10 次, 冰浴或者冰上放置 >=5 分钟, 中间偶尔颠倒混匀几次内毒素清除剂加入上清后, 上清可能会变得浑浊, 但是冰浴后应恢复清亮水浴, 溶液又会变为浑浊, 颠倒混匀后,42 温育 5 分钟 - 4 -

6 7. 室温 16,000 x g 离心 10 min 分相 ( 温度低时, 内毒素清除剂无法分相, 因此必须至少 20 C 以上室温离心 ) 8. 溶液必须分为上下两相, 否则应重复步骤 6-7 上层水相含 DNA, 下层蓝色油状相含内毒素和其它杂质将含 DNA 的上层水相转移到新管 ( 注意不要吸到蓝色油状层, 里面含内毒素等杂质 ), 弃油状层 9. 向上一步所得上层水相中加入 0.5 体积结合液 PB 后, 充分混匀, 分几批转入吸附柱 AC 中 ( 吸附柱放入收集管中 ),13,000rpm 离心秒, 倒掉收集管中的废液, 重复直到全部混合液通过离心柱子 10. 可选步骤 : 加入 500μl 去蛋白液 PE,13,000rpm 离心秒, 弃废液此步骤为了去除痕量核酸酶等杂质, 如所用菌株为 JM 系列 HB101 等 enda 菌株或野生型菌株, 核酸酶含量丰富, 应加此步骤 ; 如所用菌株为 XL-1 Blue 和 DH5α 等缺陷型菌株, 核酸酶含量低, 则可略过此步骤 11. 加入 700μl 漂洗液 WB( 请先检查是否已加入无水乙醇!),13,000rpm 离心秒, 弃掉废液 12. 加入 500μl 漂洗液 WB,13,000rpm 离心秒, 弃掉废液 13. 将吸附柱 AC 放回空收集管中,13,000rpm 离心 2 分钟, 尽量除去漂洗液, 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应 14. 取出吸附柱 AC, 放入一个干净的离心管中, 在吸附膜的中间部位加 100μl 洗脱缓冲液 EB( 洗脱缓冲液事先在水浴中加热效果更好 ), 室温放置 2 分钟, 13,000rpm 离心 1 分钟如果需要较多量质粒, 可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中, 离心 1 分钟洗脱体积越大, 洗脱效率越高如果需要质粒浓度较高, 可以适当减少洗脱体积, 但是最小体积不应少于 50μl, 体积过小降低质粒洗脱效率, 减少质粒产量 - 5 -

7 问题与解决方法问题评论与建议 * 忘加抗生素, 非质粒转化细胞过度生长 - 建议 : 确保固体液体培养基中都加入了适当的抗生素 * 细菌培养时间太长, 老化细菌开始裂解 - 建议 : 接种过夜培养的新鲜单菌落于加了合适抗生素的培养基中, 培养个小时 * 使用了低拷贝数质粒 - 建议 : 使用高拷贝数质粒, 低拷贝数质粒应该适当加大处理体积质粒 DNA 产量低 * 细菌培养时间过短, 细菌浓度过低 - 建议 : 细菌培养到 [A600] 吸光值为 2-4 时, 收集菌体 * 细菌细胞裂解不完全 - 建议 : 使用建议的菌体处理量, 不要过量 ; 涡旋或者吹打, 确保菌体充分重悬于溶液 P1 中, 不应该见到未散开的细菌团块 ; 加入裂解液 P2 后, 应该是粘稠和透明的 * 质粒 DNA 产量使用分光光度计定量不准确 - 建议 : 分光光度计定量常常偏高, 使用琼脂糖电泳 /EB 染色定量 * 洗脱效率不高 - 建议 : 请阅读实验步骤 13 和注意事项 6 * 漂洗液 WB 中忘加无水乙醇 - 建议 : 第一次实验时, 在漂洗液 WB 中未提取到质粒 DNA 加入指定量无水乙醇 * 质粒洗脱液含有较多乙醇, 琼脂糖电泳 /EB 染色定量时质粒 DNA 漂出上样孔 - 建议 : 确保已经做了步骤 9, 将离心吸附柱的残留乙醇去除 ; 或者适当提高上样缓冲液浓度质粒 DNA 下游酶切不能切开或者酶切不完全 * 忘记做步骤 13, 乙醇抑制了酶切反应 - 建议 : 做步骤 14, 然后空气中晾几分钟, 让残留乙醇挥发 * 一些硅基质膜成分一起洗脱下来, 抑制了酶切反应 - 建议 : 将洗脱的 - 6 -

8 回收 DNA 溶液 13,000rpm 再离心 1 分钟, 小心取上清使用质粒 DNA 降解或者无质粒 DNA * 核酸酶活性太高 - 建议 : 确保已经做了步骤 10, 使用去蛋白液 PE 去除核酸酶基因组 DNA 污染 * 裂解时基因组 DNA 被剪切打断了 - 建议 : 做步骤 3 时, 轻柔颠倒混匀, 不要涡旋或者剧烈震荡质粒 DNA 缺口或者电泳时超螺旋带前出 * 步骤 3 裂解时间过长 - 建议 : 裂解时间不要超过 5 分钟现变性质粒带 * 第一次做实验时, 忘记将 RNase A 加入 P1 溶液,RNase A 失活或者产物中含有 RNA 污染起始处理量过量 - 建议 : 第一次实验前确保将 RNase A 加入了溶液 P1;P1 溶液超过 3 个月的, 可加入一些新 RNase A; 处理量不要过量 ; 菌体重悬于 P1 溶液后可放置几分钟让 RNase A 充分作用后再进行下一步 - 7 -

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TRIpure Reagent 抽提指南高纯度质粒小提中量试剂盒目录号 PL18 使用手册实验室使用, 仅用于体外高纯度质粒小提中量试剂盒目录号 :PL1801 适用范围 : 适用于 5-15ml 中等规模质粒制备 (mind preparations) 试剂盒组成储存稳定性 : 试剂盒组成保存 50 次 RNase A(10mg/ml 10mg/ml) -20 20 250 50µl 溶液 P1 4 25 ml 溶液 P2 室温