产品简介康为二代测序快速 DNA 建库试剂盒 (Ion torrent) 提供了构建 DNA 文库需要的酶预混体系及反应缓冲液, 包含除接头以外的所有成分, 制备的文库可用于 Ion torrent PGM Ion Proton 二代测序平台的测序和常规建库方法相比, 该试剂盒将多个步骤进行了合并

Size: px

Start display at page:

Download "产品简介康为二代测序快速 DNA 建库试剂盒 (Ion torrent) 提供了构建 DNA 文库需要的酶预混体系及反应缓冲液, 包含除接头以外的所有成分, 制备的文库可用于 Ion torrent PGM Ion Proton 二代测序平台的测序和常规建库方法相比, 该试剂盒将多个步骤进行了合并"

顶都
5 years ago
Views:

1 微信订购 : 扫一扫右侧二维码网站订购 : 服务热线 : 版本号 :10/2016 NGS Fast DNA Library Prep Set for Ion Torrent 目录号 :CW2639S (24 rxns) CW2639M (96 rxns) 保存条件 :-20 保存, 干冰运输产品内容 Component CW2639S 24 rxns CW2639M 96 rxns 10 End Repair Buffer 200 μl 800 μl End Repair Enzyme Mix 48 μl 192 μl Ligation and Nick Repair Buffer 400 μl μl T4 DNA Ligase 48 μl 192 μl Bst DNA Polymerase 48 μl 192 μl 2 HiFidelity PCR Mix 600 μl ml 10 Primer Mix (5 μm each) 150 μl 600 μl

2 产品简介康为二代测序快速 DNA 建库试剂盒 (Ion torrent) 提供了构建 DNA 文库需要的酶预混体系及反应缓冲液, 包含除接头以外的所有成分, 制备的文库可用于 Ion torrent PGM Ion Proton 二代测序平台的测序和常规建库方法相比, 该试剂盒将多个步骤进行了合并, 省略了多个纯化步骤, 因此显著降低了起始模板 DNA 的最少需求量, 缩短了文库构建时间另外, 试剂盒采用高保真 DNA 聚合酶进行文库富集, 无偏好的 PCR 扩增, 扩大了序列的覆盖区域, 可高效的制备用于 Ion torrent 二代测序平台的 DNA 文库自备仪器试剂和耗材 1. 磁力架 : 建议使用 Life 公司磁力架 2.DNA 纯化回收试剂盒 : 建议使用康为磁珠法 DNA 纯化回收试剂盒 (CW2508) 3. 样本接头引物试剂盒 4. 无水乙醇,EB (10 mmtris-hcl, ph 8.0), 去离子水 (ph 在之间 ) 5. 反应管 : 建议使用低吸附的 PCR 管与 1.5 ml 离心管 ; 枪头 : 建议使用高质量过滤枪头防止试剂盒文库样本污染实验前准备及重要注意事项 1. 避免试剂盒中 Buffer 的反复冻融, 建议首次使用时将 Buffer 进行分装保存酶在使用完应尽快放回 -20 保存, 2.PCR 产物因操作不当极易产生污染, 导致实验结果不准确, 建议将 PCR 反应体系配制区与 PCR 产物纯化区隔离, 并使用专门的移液器, 定期对各实验区域进行清洁 1

3 DNA 建库流程示意图 : 2 小时 15 分得到 DNA 文库起始材料 :5 ng-1 μg 打断的双链 DNA, 溶于 EB(10 mm Tris-HCl ph 8.0) 或去离子水中, DNA 纯度要求 :OD260/OD 280= DNA 末端修复反应 : 1. 向 200 μl PCR 管中加入以下成分, 用枪头将上述溶液轻轻混匀, 瞬时离心使所有组分收集到管底试剂名称 10 End Repair Buffer End Repair Enzyme Mix fragmented DNA RNase-Free Water 体积 6 μl 2 μl X (10 ng-1 μg) Up to 60 μl 2. 将管子置入 PCR 仪中, 热盖打开, 反应程序如下 : Hold on 4 2

4 Adaptor 连接 : 建议使用康为 adaptor 进行连接, 也可选择使用 Life Kapa 公司的 adaptor, 具体连接方法可参考各公司的产品使用说明书以下为使用康为 adaptor 进行连接的操作步骤 : 1. 向上述反应液中直接加入以下试剂, 用枪头将上述试剂混匀, 短暂离心, 使溶液收集到管底试剂名称 Ligation and Nick Repair Buffer T4 DNA Ligase Bst DNA Polymerase Adaptor A Adaptor P1 RNase-Free Water Total volume 体积 10 μl 2 μl 2 μl 7 μl 7 μl 12 μl 40 μl 注 : 建议 Adaptor 的加入量与 DNA 片段的摩尔比为 10:1-20:1, 具体 Adaptor 的使用浓度请参照下表如果 DNA 量为 ng, adaptor 建议使用浓度为 1 μm( 小于 260 bp) 或 0.5μM( bp) 不同大小 DNA 建议 Adaptor 使用浓度插入 DNA 量 / 反应 130 bp 260 bp 320 bp 410 bp 1 μg 10 μm 10 μm 5 μm 5 μm 500 ng 5 μm 5 μm 2.5 μm 2.5 μm 100 ng 1 μm 1 μm 0.5 μm 0.5 μm 2. 反应步骤 Hold on 4 3

5 Adaptor 连接 DNA 片段的选择性回收构建不同大小的 DNA 文库时, 需进行 DNA 片段的选择性回收若起始样本量低于 50ng, 不建议进行 DNA 片段选择性回收可参考另一种方案, 直接进行 DNA 片段的纯化建议使用康为世纪磁珠法 DNA 纯化回收试剂盒 (CW2508) 进行 DNA 片段选择性回收若使用除康为以外厂家的磁珠, 需自行摸索最佳磁珠用量以下操作步骤采用康为世纪磁珠法 DNA 纯化回收试剂盒, 可选择回收 DNA 片段长度范围为 bp( 读长为 200bp), 反应起始体积为 100 μl 1. 涡旋振荡 CMPure20 秒, 使其彻底混匀为均一溶液 ; 2. 将 100μl adaptor 连接反应缓冲液转移至一新的 1.5ml 离心管中 ; 3. 加入 60 µl 混合均匀的 CMPure, 涡旋震荡 5 秒钟后室温静置 5 分钟 ; 4. 短暂离心, 将离心管置于磁力架上, 使磁珠和上清溶液分离, 直至溶液澄清 ( 约需 5 分钟 ), 小心地将上清溶液转移至新的 1.5ml 离心管中, 并弃去磁珠 ; 注意 : 不要弃除上清 5. 向上清中加入 20µl 混合均匀的 CMPure, 涡旋震荡 5 秒钟后室温放置 5 分钟 ; 6. 短暂离心, 将离心管放于磁力架上, 使磁珠和上清溶液分离, 直至溶液澄清 ( 约需 5 分钟 ), 小心移取上清并弃除, 期间避免接触结合目标 DNA 的磁珠 ; 注意 : 不要弃除磁珠 7. 继续保持离心管固定于磁力架上, 向离心管中加入 250 µl 新配置的 80% 乙醇, 室温放置 30 秒, 待悬起的磁珠完全吸附后, 小心弃除上清 ; 8. 重复步骤 7; 为彻底移除残留液体, 可将离心管短暂离心后, 再次移除残留液体 9. 保持离心管固定于磁力架上, 室温静置 5 分钟, 使磁珠在空气中干燥 ; 10. 将离心管从磁力架上取下, 加入 25 µl 10 mmtris-hcl(ph 8.0) 或去离子水 ( 自备 ), 涡旋振荡使磁珠完全重悬于洗脱液中, 室温静置 5 分钟 ; 11. 短暂离心, 将离心管放于磁力架上直至溶液澄清 ( 约需 5 分钟 ), 将 25 μl 洗脱液转移至一个新的 PCR 管中 ; 4

6 另一种方案 :Adaptor 连接 DNA 片段的全部回收 1. 涡旋振荡 CMPure20 秒, 使其彻底混匀为均一溶液 2. 将 adaptor 连接反应液转移至一新的 1.5 ml 离心管中 3. 加入 1 倍样品体积的 CMPure, 涡旋震荡 5 秒钟后, 室温静置 5 分钟 4. 短暂离心, 将离心管放于磁力架上, 使磁珠和上清溶液分离, 直至溶液澄清 ( 约需 5 分钟 ), 小心吸取上清并弃除, 期间避免接触已结合目标 DNA 的磁珠注意 : 不要弃除磁珠 5. 继续保持离心管固定于磁力架上, 向离心管中加入 250 μl 新鲜配置的 80% 乙醇, 室温放置 30 秒, 待悬起的磁珠完全吸附后, 小心弃除上清 6. 重复步骤 5 为彻底移除残留液体, 可将离心管短暂离心后, 再次移除残留液体 7. 保持离心管固定于磁力架上, 室温静置 5 分钟, 使磁珠在空气中干燥 8. 将离心管从磁力架上取下, 加入 25 μl EB( 自备 ) 或去离子水, 涡旋振荡使磁珠完全重悬于洗脱液中, 室温静置 5 分钟 9. 短暂离心, 将离心管放于磁力架上直至溶液澄清 ( 约需 5 分钟 ), 将 25 μl 洗脱液转移至一个新的 PCR 管中 PCR 富集 1. 在 PCR 管中加入以下试剂并混匀试剂体积连接 adaptor 后的 DNA 片段 20 μl 2 HiFidelity PCR Mix 25 μl 10 Primer Mix (5 μm each) 5 μl 总体积 50 μl 5

7 2.PCR 反应条件步骤温度时间预变性 98 30s 变性 98 10s 退火 s 延伸 s 终延伸 72 5min 4-12 cycles 注 : 样本量为 1ug 时,4-6 个 cycles, 样本量 100ng 时 6-8 个 cycles, 样本量为 10ng 时个 cycles PCR 循环数可根据实验进行优化 PCR 产物的纯化 1. 涡旋振荡 CMPure20 秒, 使其彻底混匀为均一溶液 ; 2. 将 PCR 反应液转移至一新的 1.5 ml 离心管中 ; 3. 加入 1 倍样品体积的 CMPure, 涡旋震荡 5 秒钟后室温静置 5 分钟 ; 4. 短暂离心, 将离心管放于磁力架上, 使磁珠和上清溶液分离, 直至溶液澄清 ( 约需 5 分钟 ) 小心移取上清并弃除, 期间避免接触结合目标 DNA 的磁珠 ; 注意 : 不要弃除磁珠 5. 继续保持离心管固定于磁力架上, 向离心管中加入 250 µl 新鲜配置的 80% 乙醇, 室温放置 30 秒, 待悬起的磁珠完全吸附后, 小心弃除上清 6. 重复步骤 5; 为彻底移除残留液体, 可将离心管短暂离心后, 再次移除残留液体 7. 保持离心管固定于磁力架上, 室温静置 5 分钟, 使磁珠在空气中干燥 8. 将离心管从磁力架上取下, 加入 25 µl EB( 自备 ) 或去离子水, 涡旋振荡使磁珠完全重悬于洗脱液中, 室温静置 5 分钟, 短暂离心, 将离心管放于磁力架上直至溶液澄清 ( 约需 5 分钟 ), 将 25 μl 洗脱液转移至一个新的 PCR 管中,DNA 文库在 -20 保存 6 本产品仅供科研使用, 请勿用于临床诊断及其他用途技术支持 :service@cwbiotech.com 网址 :

产品简介本试剂盒提供了 DNA 文库构建所需要的酶预混体系及反应缓冲液, 包含除接头与 PCR 引物外的所有成分, 用于 illumina 二代测序平台 DNA 文库构建和一般建库方法相比, 该试剂盒操作简单方便, 极大地缩短了文库构建时间另外, 试剂盒采用高保真 DNA 聚合酶进行文库富集,

产品简介本试剂盒提供了 DNA 文库构建所需要的酶预混体系及反应缓冲液, 包含除接头与 PCR 引物外的所有成分, 用于 illumina 二代测序平台 DNA 文库构建和一般建库方法相比, 该试剂盒操作简单方便, 极大地缩短了文库构建时间另外, 试剂盒采用高保真 DNA 聚合酶进行文库富集, 微信订购 : 扫一扫右侧二维码网站订购 :www.cwbiotech.com 服务热线 :4006-222-360 版本号 :04/2017 NGS Fast DNA Library Prep Set for Illumina 二代测序快速 DNA 建库试剂盒 (Illumina) 目录号 :CW2585S(24 rxns) CW2585M(96 rxns) 保存条件 :-20 保存, 干冰运输