TRIpure Reagent 抽提指南

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1 组织 / 细胞基因组 DNA 快速提取试剂盒 目录号 DN07 使用手册 实验室使用, 仅用于体外

2 组织 / 细胞基因组 DNA 快速提取试剂盒目录号 :DN07 目录编号 包装单位 DN 次 DN 次 DN 次 DN 次 ( 带蛋白酶 K 粉 ) DN 次 ( 带蛋白酶 K 粉 ) DN 次 ( 带蛋白酶 K 粉 ) 适用范围 : 适用于快速提取各种动植物细胞 / 组织基因组 DNA 试剂盒组成 储存 稳定性 : 试剂盒组成 保存 50 次 100 次 200 次 裂解液 TL 室温 11 ml 结合液 CB 室温 11 ml 20 ml 20 ml 40 ml 40 ml 抑制物去除液 IR 室温 25 ml 50 ml 100 ml 漂洗液 WB 室温 15 ml 25 ml 50 ml 第一次使用前按说明加指定量乙醇 洗脱缓冲液 EB 室温 15 ml 15 ml 15ml 2 蛋白酶 K 粉 ( 可选 )20mg/ml mg 2 20mg 20mg 4 20mg 吸附柱 AC 室温 50 个 100 个 200 个 收集管 (2ml 2ml) 室温 50 个 100 个 200 个 本试剂盒在室温储存 12 个月不影响使用效果 - 1 -

3 储存事项 : 1. 结合液 CB 或者抑制物去除液 IR 低温时可能出现析出和沉淀, 可以在 37 水浴几分钟帮助重新溶解, 恢复澄清透明后冷却到室温即可使用 2. 为避免降低活性 方便运输, 提供蛋白酶 K 为冻干粉状, 收到后, 可短暂离心后, 加入 1ml 灭菌水溶解, 因为反复冻融可能会降低酶活性, 因此溶解后立即按照每次使用量 (20 微升 ) 分装冻存,-20 保存 3. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发 氧化 ph 值变化, 各溶液使用后应及时盖紧盖子 产品介绍 : 独特的结合液 / 蛋白酶 K 迅速裂解细胞和灭活细胞内核酸酶, 然后基因组 DNA 在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜, 再通过一系列快速的漂洗 - 离心的步骤, 抑制物去除液和漂洗液将细胞代谢物 蛋白等杂质去除, 最后低盐的洗脱缓冲液将纯净基因组 DNA 从硅基质膜上洗脱 产品特点 : 1. 离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜, 柱与柱之间吸附 量差异极小, 可重复性好 克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端 2. 不需要使用有毒的苯酚等试剂, 也不需要乙醇沉淀等步骤 3. 快速, 简捷, 单个样品操作一般可在 30 分钟内完成 4. 多次柱漂洗确保高纯度,OD260/OD280 典型的比值达 1.7~1.9, 长度可达 30kb -50kb, 可直接用于 PCR,Southern-blot 和各种酶切反应 - 2 -

4 注意事项 1. 所有的离心步骤均在室温完成, 使用转速可以达到 13,000rpm 的传统台式离心机, 如 Eppendorf 5415C 或者类似离心机 2. 需要自备 1XPBS( 磷酸盐缓冲液 ), 和异丙醇 3. 实验前将需要的水浴先预热到 70 备用 4. 结合液 CB 和抑制物去除液 IR 中含有刺激性化合物, 操作时要戴乳胶手套, 避免沾染皮肤, 眼睛和衣服 若沾染皮肤 眼睛时, 要用大量清水或者生理盐水冲洗 5. 洗脱液 EB 不含有螯合剂 EDTA, 不影响下游酶切 连接等反应 也可以使用水洗脱, 但应该确保批 ph 大于 7.5, ph 过低影响洗脱效率 用水洗脱 DNA 应该保存在 -20 DNA 如果需要长期保存, 可以用 TE 缓冲液洗脱 (10mM Tris-HCl, 1mM EDTA,pH 8.0), 但是 EDTA 可能影响下游酶切反应, 使用时可以适当稀释 操作步骤 :( 实验前请先阅读注意事项 ) 提示 : 第一次使用前请先在漂洗液 WB 中加入指定量无水乙醇, 充分混匀, 加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇, 以免多次加入! 1. 组织培养细胞 a. 收集约 悬浮细胞到一个 1.5ml 离心管 ; 对于贴壁细胞, 应该先用胰蛋白酶消化后吹打下来收集 b. 13,000rpm 离心 10 秒, 使细胞沉淀下来 弃上清, 留下细胞团和大约 10-20μl 残留的液体 c. 加 200μl 1XPBS 重悬洗涤细胞,13,000rpm 离心 10 秒, 使细胞沉淀下来 完 - 3 -

5 全吸弃上清, 将细胞沉淀重悬于 180μl 1XPBS 中 d. 加入 20μl 蛋白酶 K (20mg/ml) 溶液, 充分混匀, 再加入 200μl 结合液 CB, 立刻涡旋振荡充分混匀, 在 70 放置 10 分钟 可选做步骤 : 如果 RNA 残留较多, 需要去除 RNA, 可以在加入 200μl 结合液 CB 前加 20μl RNase A(25mg/ml) 溶液, 振荡混匀, 室温放置 5-10 分钟 e. 冷却后加 100μl 异丙醇, 立刻涡旋振荡充分混匀, 此时可能会出现絮状沉淀 f. 将上一步混合物 ( 包括可能有的沉淀 ) 加入一个吸附柱 AC 中,( 吸附柱放入收集管中 )13,000rpm 离心 60 秒, 倒掉收集管中的废液 g. 接操作步骤项下 4 2. 动植物组织 ( 例如鼠肝脑或者植物叶片 ) a. 新鲜或者解冻的组织在液氮中研磨成细粉后或者用解剖刀切成小碎块 ( 切成微块可以提高产量 ) 后取 20-50mg, 转入装有 180μl 组织裂解液 TL 的 1.5ml 离心管中, 用大口径枪头吹打混匀 b. 加入 20μl 的蛋白酶 K 溶液 (20mg/ml), 立刻涡旋振荡充分混匀 c. 将裂解物放置在 55 水浴 1-3 小时或者直到组织消化完全, 期间轻柔的振荡几次帮助裂解 可选做步骤 : 如果 RNA 残留较多, 需要去除 RNA, 可在完成步骤 c 后加 20μl RNase A(25mg/ml) 溶液, 振荡混匀, 室温放置 5-10 分钟 d. 加入 200μl 结合液 CB, 立刻涡旋振荡充分混匀,70 放置 10 分钟 e. 冷却后加 100μl 异丙醇, 立刻涡旋振荡充分混匀, 此时可能会出现絮状沉淀 f. 用 1ml 的枪头吸取混合物, 将混合物加入一个吸附柱 AC 中,( 吸附柱放入收集管中 )13,000rpm 离心 60 秒, 倒掉收集管中的废液 - 4 -

6 如果有不溶组织物可能堵住枪头, 可将枪头在吸水纸上轻蹭去除不溶物 ; 如果吸上来的混合物少则可以将枪头和不溶物一起弃去, 该做法是为了去除不溶物, 以免堵塞离心柱 g. 接操作步骤项下 4 3. 动物组织 ( 鼠尾 ) a. 将 cm 的鼠尾巴尖 ( 即 20-50mg) 剪碎 ( 一定要剪 0-2cm 范围内的尾巴尖, 否则裂解效果不好 ), 或者在液氮中研磨组织成细粉后, 转入装有 180μl 组织裂解液 TL 的 1.5ml 离心管中, 用大口径枪头吹打混匀 b. 加入 20μl 的蛋白酶 K(20mg/ml), 立刻涡旋振荡充分混匀 c. 将裂解物放置在 55 水浴 3 小时或者直到组织消化完全, 期间轻柔的振荡几次帮助裂解 可选做步骤 : 如果 RNA 残留较多, 需要去除 RNA, 可在完成步骤 c 后加 20μl RNase A(25mg/ml) 溶液, 振荡混匀, 室温放置 5-10 分钟 d. 用一个 1ml 不带针头的一次性输液器抽打裂解物 2-3 次 e. 加入 200μl 结合液 CB 和 100μl 异丙醇, 立刻涡旋振荡充分混匀 f. 13,000rpm 离心 5 分钟, 将上清加入一个吸附柱 AC 中,( 吸附柱放入收集管中 )13,000rpm 离心 秒, 倒掉收集管中的废液 g. 接操作步骤项下 4 上述步骤中立刻涡旋或者吹打充分混匀非常重要, 混匀不充分严重降低产量, 必要时如样品粘稠不易混匀时可以涡旋振荡 15 秒混匀 4. 加入 500μl 抑制物去除液 IR,12,000rpm 离心 30 秒, 弃废液 5. 加入 700μl 漂洗液 WB( 请先检查是否已加入无水乙醇!),12,000rpm 离心 30 秒, - 5 -

7 弃掉废液 6. 加入 500μl 漂洗液 WB,12,000rpm 离心 30 秒, 弃掉废液 7. 将吸附柱 AC 放回空收集管中,13,000rpm 离心 2 分钟, 尽量除去漂洗液, 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应 8. 取出吸附柱 AC, 放入一个干净的离心管中, 在吸附膜的中间部位加 100μl 洗脱缓冲液 EB( 洗脱缓冲液事先在 水浴中预热效果更好 ), 室温放置 3-5 分钟, 12,000rpm 离心 1 分钟 将得到的溶液重新加入离心吸附柱中, 室温放置 2 分钟, 12,000rpm 离心 1 分钟 洗脱体积越大, 洗脱效率越高, 如果需要 DNA 浓度较高, 可以适当减少洗脱体积, 但是最小体积不应少于 50μl, 体积过小降低 DNA 洗脱效率, 减少 DNA 产量 9. DNA 可以存放在 2-8, 如果要长时间存放, 可以放置在

8 问题与解决方法 问题 评论与建议 * 组织块太大, 蛋白酶 K 消化不完全 - 建议 : 液氮研磨或者尽量将组 织切成小块, 或者延长蛋白酶 K 消化时间至过夜或者在原有消化 基础上另加 20μl 蛋白酶 K 消化 1-2 小时 DNA 产量低 * 蛋白酶 K 失效了 - 建议 : 收到蛋白酶 K 后, 按照每次使用量分装冻 存, 避免反复冻融 * 裂解不完全或者和异丙醇没有充分混匀 - 建议 : 加入结合液后, 和加入蛋白酶 K 后立即吹打或者涡旋混匀 ; 加入异丙醇后立即吹打或者涡旋混匀才加入吸附柱, 如果太粘稠必须涡旋振荡 15 秒充分混匀 组织 DNA 降解了未提取到 DNA 洗脱下来的 DNA 产量低 * 组织中核酸酶活性导致降解 - 建议 : 样品处理前妥善保存在 - 20, 处理量不要过量 * 漂洗液 WB 中忘记加无水乙醇 - 建议 : 第一次实验时, 在漂洗液 WB 中加入指定量无水乙醇 * 离心柱残留有较多乙醇或者底部不慎沾有乙醇 - 建议 : 确保做了步骤 7, 否则残留乙醇会影响洗脱效率 * 使用了水或者其它非最佳液体代替洗脱缓冲液 - 建议 : 仔细阅读仔细阅读注意事项 5 和步骤 8 和只使用洗脱缓冲液 EB 洗脱 A260 吸光值 异常偏高 * 一些硅基质膜成分一起洗脱下来, 干扰了吸光值 - 建议 : 将洗脱的 基因组 DNA 溶液 13,000rpm 再离心一分钟, 小心取上清使用 DNA 下游酶切 不能切开或者 酶切不完全 * 一些硅基质膜成分一起洗脱下来, 抑制了酶切反应 - 建议 : 将洗脱的基因组 DNA 溶液 13,000rpm 再离心一分钟, 小心取上清使用 * 离心柱残留有较多乙醇或者底部不慎沾有乙醇抑制了酶切反应 - 建议 : 确保做了步骤 7, 然后空气中晾几分钟, 让残留乙醇挥发 - 7 -

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