分析证书根据本说明书第 6 页的提纯方法, 使用 Thermo Scientific GeneJET 质粒小提试剂盒从大肠杆菌 E.coli 中提取 puc19 DNA 所提取 DNA 的质量已通过各种方法得到检测, 包括 DNA 纯度和浓度的分光光度检测琼脂糖凝胶电泳检测 Thermo Sci

Size: px

Start display at page:

Download "分析证书根据本说明书第 6 页的提纯方法, 使用 Thermo Scientific GeneJET 质粒小提试剂盒从大肠杆菌 E.coli 中提取 puc19 DNA 所提取 DNA 的质量已通过各种方法得到检测, 包括 DNA 纯度和浓度的分光光度检测琼脂糖凝胶电泳检测 Thermo Sci"

备董
5 years ago
Views:

1 产品信息 Thermo Scientific GeneJET 质粒小提试剂盒 #K0502, #K0503 批号有效期 1

2 分析证书根据本说明书第 6 页的提纯方法, 使用 Thermo Scientific GeneJET 质粒小提试剂盒从大肠杆菌 E.coli 中提取 puc19 DNA 所提取 DNA 的质量已通过各种方法得到检测, 包括 DNA 纯度和浓度的分光光度检测琼脂糖凝胶电泳检测 Thermo Scientific 快速限制性内切酶酶切检测以及自动测序检测质量授权人 : Jurgita Zilinskiene 2

3 目录页码试剂盒组成... 4 贮存和稳定性... 4 产品介绍... 4 基本原理... 4 重要提示... 5 缓冲液准备... 5 细菌培养... 5 提纯方法... 6 问题解决方案... 7 安全信息... 8 参考文献

4 试剂盒组成 GeneJET 质粒小提试剂盒 #K0502 #K preps 250 preps 重悬液 15 ml 70 ml 裂解液 15 ml 70 ml 中和液 * 20 ml 100 ml 洗脱液 ( 浓缩 ) 20 ml 100 ml RNase A 0.15 ml 0.7 ml 洗脱液 (10 mm Tris-HCl, ph 8.5) 4 ml 30 ml GeneJET 离心柱收集管 (2 ml) 贮存和稳定性 GeneJET 质粒小提试剂盒可在室温下 (15-25 ) 贮存 12 个月若需更长时间贮存, 建议将试剂盒贮存于 4 条件下若贮存过程中缓冲液里出现沉淀物质, 使用前需在 37 条件下进行重新溶解重悬液加入 RNase A 后, 在 4 条件下能使用 6 个月产品介绍 GeneJET 质粒小提试剂盒旨在从重组大肠杆菌 E.coli 中小规模的快速的高效的提取高质量的质粒 DNA 试剂盒使用了基于硅膜技术的离心柱每一个 GeneJET 离心柱可回收多达 20 µg 质粒 DNA 同时试剂盒能用于任何大小质粒和粘粒的高效纯化实际的质粒产量以及最优的细菌培养体积取决于质粒的拷贝数和所用的培养基基本原理细菌细胞经过重悬, 加入 SDS 碱性裂解液后, 细胞释放出质粒 DNA 中和得到的裂解液, 便形成适合质粒 DNA 结合到离心柱硅膜的条件通过离心除去细胞碎片和 SDS 沉淀物, 将含有质粒 DNA 的上清加入离心柱结合于膜上的 DNA 通过漂洗以除去污染物, 最后使用少量的洗脱液 (10 mm Tris-HCl,pH 8.5) 将膜上的质粒 DNA 洗脱出来纯化的质粒 DNA 能够即时用于各种分子生物实验, 比如常规限制性内切酶的酶切 FastDigest 快速内切酶的快速酶切 PCR 转化以及测序 4

5 重要事项缓冲液准备将提供的 RNase A 加入重悬液, 混合均匀加入 RNase A 后, 重悬液可在 4 条件下保存 6 个月漂洗液首次使用之前需加入无水乙醇 (96-100%): #K preps #K preps 漂洗液 ( 浓缩的 ) 20 ml 100 ml 乙醇 (96-100%) 35 ml 170 ml 总体积 55 ml 270 ml 每次使用前检查裂解液和中和液是否发生盐析若出现盐沉淀, 请在 37 下重新溶解, 冷却至 25 时再使用注意不要剧烈摇晃裂解液裂解液和中和液含有刺激性物质, 使用时请戴上手套详情请查看第 8 页的安全信息细菌培养从划线平板上挑取单克隆, 培养于含相应抗性的 1-5 ml LB 培养基中在 rpm 摇床中培养小时所用试管或试剂瓶的容积至少为培养基体积的 4 倍室温下将细菌培养物离心 (8000rpm/6800 g)2 分钟以收集菌体, 去除上清, 确保去除残留的培养基不要超过离心柱的吸附能力 : 对于高拷贝质粒, 所收集细菌培养物体积不要超过 5 ml 如果超过 5 ml, 将会超过 GeneJET 离心柱的吸附能力 (20 µg of dsdna), 这并不能够提高质粒的产量对于低拷贝质粒 ( 如表 1), 需要收集较大量的细菌培养物 ( 至少 10 ml), 以便能得到足量质粒 DNA 表 1 各种质粒的拷贝数高拷贝拷贝每细胞低拷贝拷贝每细胞极低拷贝最多 5 拷贝每细胞 puc vectors pbr322 and derivatives psc101 and derivatives pbluescript vectors pacyc and derivatives pgem vectors ptz vectors pjet vectors 5

6 提纯方法注 : 开始前请阅读第 5 页的重要事项所有的提纯步骤都在室温下进行所有的离心过程最好使用转速 >12000 g( rpm, 取决于离心机转子的类型 ) 的台式离心机纯化高拷贝的质粒使用 1-5 ml 大肠杆菌培养物纯化低拷贝的质粒至少使用 10 ml 的大肠杆菌培养物步骤过程 1 将收集的菌体重悬于 250 µl 重悬液中将细胞悬液转移至离心管中菌体必须充分悬浮, 可以通过涡旋及移液器枪头吹吸, 直到没有细胞团残留注 : 确保重悬液中已经加入 RNase A 2 向细胞重悬液中加入 250 µl 裂解液, 小心颠倒离心管 4-6 次以完全混匀, 直到溶液变得黏稠且部分澄清注 : 不能涡旋, 以免剪切染色体 DNA 混合时间不要超过 5 分钟, 以免超螺旋质粒 DNA 变性 3 加入 350 µl 中和液, 立即颠倒离心管 4-6 次以充分混匀注 : 加入中和液后轻轻混匀, 以避免细菌细胞碎片发生局部沉淀加入中和液后, 溶液应变浑浊 4 离心 5 分钟以除去细胞碎片和染色体 DNA 5 将上清转移至试剂盒提供的 GeneJET 离心柱中, 转移时注意不要吸入白色沉淀物质 6 离心 1 分钟, 倒掉收集管中的流穿液, 将离心柱再次放入收集管中注 : 不要在流穿液中加入漂白剂, 请见 p.8 的安全信息 7 向 GeneJET 离心管中加入 500 µl 漂洗液 ( 首次使用时加入一定量的无水乙醇 ), 离心秒, 倒掉流穿液, 将离心柱再次放入同一收集管中 8 用 500 µl 漂洗液重复步骤 7. 9 弃掉流穿液, 再次离心 1 分钟以除去残留的漂洗液该步骤在质粒制备中至为关键, 避免制备的质粒中残留乙醇 10 将 GeneJET 离心柱转移至新的 1.5 ml 离心管中 ( 试剂盒未提供 ), 向离心柱膜中心加入 50 µl 洗脱液以溶解质粒 DNA 注意枪头不要触碰离心柱膜室温下放置 2 分钟后离心 2 分钟注 : 再次用洗脱液或水洗脱 ( 可选 ) 可提高 10-20% 的质粒产量洗脱大于 20kb 的质粒或黏粒, 需将洗脱液加热至弃掉离心柱, 将提纯的质粒 DNA 贮存于 -20 6

7 问题解决方案问题可能的原因及解决方案细菌培养时间太长从过夜平板上挑取刚分离的单克隆, 在新鲜的含抗性的培养基中培养当在 LB 培养基中摇晃培养细胞时, 在 37 条件下培养时间不应超过 16 小时当用 TB 等富培养基时, 细胞培养时间应少于 12 小时质粒产量低细菌细胞的不完全裂解裂解之前, 收集的菌体必须充分重悬于重悬液中在加入裂解液之前不应看到菌块存在裂解液使用前应检查其是否出现盐沉淀若发现盐沉淀, 将试剂加热至 37 以重新溶解盐沉淀, 使用之前混合均匀推荐在 LB 培养基中培养细菌当用 TB 培养基时减少细菌培养量 DNA 没有充分洗脱洗脱液必须加到膜的中央以保证膜的充分洗脱残留乙醇严格按照提纯方案的步骤 9 RNA 污染确保首次使用重悬液时加入 RNase A 提取的 DNA 被污染基因组 DNA 污染为了避免基因组 DNA 的剪切和释放, 在裂解和中和阶段 ( 步骤 2 和 3) 请勿涡旋和剧烈摇晃细胞, 需轻柔颠倒离心管裂解细胞 ( 步骤 2) 不要超过 5 分钟细菌在 LB 培养基中培养时间不要超过 16 小时, 在 TB 培养基中培养时间不要超过 12 小时变性质粒产生多余条带相比于超螺旋 DNA, 变性质粒 DNA 迁移率较快变性质粒不适用于接下来的酶切操作, 如限制性酶切为了避免质粒变性, 裂解细胞 ( 步骤 2) 不要超过 5 分钟 7

8 安全信息裂解液 Xi 有刺激性风险术语 R36/38 对眼睛和皮肤具有刺激性安全术语 S23 请勿吸入气体 / 烟雾 / 蒸汽 / 喷雾 S26 若溅入眼睛, 立即用大量清水冲洗, 并寻求医生治疗 S37 穿戴合适的手套 S60 该物质及其容器必须作为危险废物处置 Xn 有害中和液辨别危险的成分标签 : 盐酸胍风险术语 R22 吞食有害 R36/38 对眼睛和皮肤具有刺激性安全术语 S23 请勿吸入气体 / 烟雾 / 蒸汽 / 喷雾 S26 若溅入眼睛, 立即用大量清水冲洗, 并寻求医生治疗 S36/37 穿戴合适的防护服和手套 S60 该物质及其容器必须作为危险废物处置 8

9 参考文献 1. Birnboim H.C., and Doly, J. (1979) A rapid alkaline lysis procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7, Vogelstein, B. and Gillespie, D. (1979) Preparative and analytical purification of DNA from agarose. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 产品使用限制本产品的开发设计及销售专供研究和体外试验使用本产品不得用于诊断试验或药物开发, 也不适合向人或动物注射了解本产品的材料安全数据表, 请浏览 Thermo Fisher Scientific 公司, 版权所有所有商标均归 Thermo Fisher Scientific 公司或其子公司所有 9

#K0491, #K0492 批号有效期分析证书根据本说明书提供的方法, 使用 Thermo Scientific GeneJET 质粒中提试剂盒从 250 ml 过夜培养的大肠杆菌 E.coli LB 培养物 (OD 600 =2) 中分离高拷贝的质粒 DNA 当所纯化 DNA 的 A 26

#K0491, #K0492 批号有效期分析证书根据本说明书提供的方法, 使用 Thermo Scientific GeneJET 质粒中提试剂盒从 250 ml 过夜培养的大肠杆菌 E.coli LB 培养物 (OD 600 =2) 中分离高拷贝的质粒 DNA 当所纯化 DNA 的 A 26 产品信息 Thermo Scientific GeneJET 质粒大提试剂盒 #K0491, #K0492 www.thermoscientific.com/onebio 1 #K0491, #K0492 批号有效期分析证书根据本说明书提供的方法, 使用 Thermo Scientific GeneJET 质粒中提试剂盒从 250 ml 过夜培养的大肠杆菌 E.coli LB 培养物 (OD

分析证书 根据本说明书第 6 页的提纯方法, 使用 Thermo Scientific GeneJET 质粒小提试剂盒从大肠杆菌 E.coli 中提取 puc19 DNA 所提取 DNA 的质量已通过各种方法得到检测, 包括 DNA 纯度和浓度的分光光度检测 琼脂糖凝胶电泳检测 Thermo Sci

分析证书根据本说明书第 6 页的提纯方法, 使用 Thermo Scientific GeneJET 质粒小提试剂盒从大肠杆菌 E.coli 中提取 puc19 DNA 所提取 DNA 的质量已通过各种方法得到检测, 包括 DNA 纯度和浓度的分光光度检测琼脂糖凝胶电泳检测 Thermo Sci