FOREGENE Cell Total RNA Isolation Kit Instruction Manual Cell Total RNA Isolation Kit Cat.No.RE-03111/03112/03113 For total RNA purification from cult

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故孟
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1 Cell Total RNA Isolation Kit Cat.No.RE-03111/03112/03113 For total RNA purification from cultured cells 10 4 Cultured Cells 10 6 (96/24/12/6-well plates) For research use only Store at room temperature Copyright Foregene 2018/03. All rights reserved. 1/19

2 目录产品介绍. 3 产品特点. 3 RNA 的应用. 4 RNA 的储存. 4 产品质量控制试剂盒内容... 5 产品信息储存条件试剂盒组分信息... 6 RNA-Only Column 特性. 6 DNA-Cleaning Column 特性. 6 RNA 提取得率与纯度. 7 RNA 完整性.. 7 RNA 的 RT-qPCR 图谱... 8 注意事项操作前准备事项 10 实验材料和设备 10 自备试剂安全性操作指南材料取用说明. 12 预防样本间交叉污染 12 RNA 污染预防 12 细胞总 RNA 提取操作步骤 RNA 浓度及纯度检测.. 15 快速操作示意图 16 问题分析指南 Copyright Foregene 2018/03. All rights reserved. 2/19

3 产品介绍该试剂盒采用本公司研制的离心柱和配方, 可以高效率的从孔板培养细胞中提取得到高纯度高质量的总 RNA 试剂盒提供高效的 DNA-Cleaning Colunm, 能轻松的让上清液和细胞裂解物分离并吸附除去基因组 DNA, 操作简便省时 ; 该 RNA-only Column 能高效的结合 RNA, 搭配独特的配方, 可以同时处理大量样品全体系 RNase-Free, 使得提取的 RNA 无降解 ;Buffer RW1 Buffer RW2 缓冲液洗涤体系, 使得获得的 RNA 无蛋白无 DNA 无离子无有机化合物污染产品特点整套试剂盒全 RNase-Free, 无需担心 RNA 降解 DNA-Cleaning Column 特异结合 DNA, 使得试剂盒无需额外添加 DNase 即可去除基因组 DNA 污染 RNA 得率高 :RNA-only Column 和独特配方搭配能高效的纯化 RNA 速度快 : 操作简便, 可在 11 分钟内完成安全 : 无需有机试剂抽提质量高 : 提取得到的 RNA 纯度高, 没有蛋白和其他杂质污染, 能够满足后续各种实验 Copyright Foregene 2018/03. All rights reserved. 3/19

4 试剂盒应用适用于从孔板培养细胞总 RNA 提取纯化 RNA 的应用培养细胞总 RNA 提取试剂盒提取得到的总 RNA 可用于各种下游分子实验, 例如 :cdna 合成,RT-PCR Real Time PCR Northern Blot Dot Blot 体外翻译芯片分析 PolyA 筛选分子克隆和 RNase 保护分析等 RNA 的储存建议使用 RNase-Free ddh 2 O 洗脱 RNA, 即时用于下游实验或储存于 -80 在 -80 存储条件下,RNA 可保存一年产品质量控制按照福际生物试剂盒质量检测体系标准 ( s Total Quality Management System), 每一批次的培养细胞总 RNA 提取试剂盒都严格进行多次测试, 确保每一批次试剂盒质量的可靠性和稳定性 Copyright Foregene 2018/03. All rights reserved. 4/19

5 试剂盒内容 Cell Total RNA Isolation Kit 培养细胞总 RNA 提取试剂盒试剂盒组成 RE RE RE 次 100 次 200 次 Buffer crl1* 15ml 30ml 60ml Buffer crl2 7.5ml 15ml 30ml Buffer RW1* 28ml 56ml 110ml Buffer RW2 24ml 48ml 96ml RNase-Free ddh 2 O 10ml 20ml 40ml RNA-only Column 50 个 100 个 200 个 DNA-Cleaning Column 50 个 100 个 200 个说明书 1 份 1 份 1 份 *:Buffer crl1 Buffer RW1 中含有具刺激性的离液盐, 操作时请注意带上手套和进行相关防护措施产品信息型号离心柱型纯化组件 Foregene 离心柱试剂通量 1-24 个样品制备时间 ~11min(24 个样品 ) 离心机台式离心机细胞裂解物分离离心分离纯化柱 RNA 承载量 30μg 离心柱液体盛装量 700μl 最小洗脱体积 20μl 细胞样本处理量 cells 储存条件本试剂盒在常温 (15 25 ) 干燥条件下, 可保存 12 个月 ; 如需保存更长时间可置于 2 8 Buffer crl1 在加入 β- 巯基乙醇 ( 可选择不加 ) 后可在 4 放置 1 个月 ( 建议现做现添加 ) 注意 : 若低温保存, 溶液容易产生沉淀在使用前务必将试剂盒内的溶液在室温中放置一段时间, 必要时可在 37 水浴中预热 10 分钟, 以溶解沉淀, 混匀后再使用 Copyright Foregene 2018/03. All rights reserved. 5/19

6 试剂盒组分信息 Buffer crl1: 提供细胞裂解所需的环境 Buffer crl2: 提供 RNA 的特异上柱环境 Buffer RW1: 去除 RNA 中的蛋白质 DNA 等杂质 Buffer RW2: 去除 RNA 中残留的盐离子 RNase-Free ddh 2 O: 洗脱纯化柱膜上的总 RNA DNA-Cleaning Column: 特异吸附细胞裂解产物中的 DNA, 并过滤除去裂解产物中的固体杂质 RNA-only Column: 特异吸附上通过 DNA-Cleaning Column 滤液中的总 RNA DNA-Cleaning Column 特性原理 ( Mechanism) 功能 (Function) 裂解物最大载量体积 (Maximum loading volume) 特异吸附 DNA 去除 DNA 污染, 过滤分离裂解物 700μl RNA-Only Column 特性 RNA 最大结合能力 (Maximum binding capacity) 上清最大载量体积 (Maximum loading volume) RNA 片段大小分布 (RNA size distribution) 最小洗脱体积 (Minimum elution volume) 1* 最佳样本选取 (Selection of samples) 样本最大初始量 (Maximum amount of starting material) 2* 30μg 700μl RNA 200nt 20μl Cultured cell 10 6 cells 1*:20μl 的最小洗脱体系是在细胞量较少时, 兼顾 RNA 回收率及浓度给出的比较合理的建议体积如果为了提高 RNA 的产量, 可以适当增加洗脱液体积, 比如采用 30-50μl 的洗脱体系, 以期得到更多量的 RNA 2*: 更大的样本量, 请使用动物组织 / 细胞总 RNA 提取试剂盒 (Animal Total RNA Isolation Kit) 进行 RNA 纯化 Copyright Foregene 2018/03. All rights reserved. 6/19

RNA 提取得率与纯度使用 Cell Total RNA Isolation Kit 纯化得到的 RNA, 其产量与细胞初始量新鲜程度细胞保存时间以及操作相关以下是使用该试剂盒提取 RNA, 几种培养细胞 RNA 得率与纯度, 实际操作中, 可能与该数据有些许出入细胞类型 RNA 得率 (10 6 ) OD260/280 OD260/230 MKN-74 15-20μg 1.8-2.

7 RNA 提取得率与纯度使用 Cell Total RNA Isolation Kit 纯化得到的 RNA, 其产量与细胞初始量新鲜程度细胞保存时间以及操作相关以下是使用该试剂盒提取 RNA, 几种培养细胞 RNA 得率与纯度, 实际操作中, 可能与该数据有些许出入细胞类型 RNA 得率 (10 6 ) OD260/280 OD260/230 MKN μg T 14-18μg SKBR μg 注 : 硅胶膜会吸附少量的液体, 洗脱后所得的 RNA 产物体积会有所偏差 RNA 的完整性 RNA 的质量可以通过变性琼脂糖凝胶电泳, 溴化乙锭染色之后在紫外光下分析在凝胶上, 核糖体 RNA 的带型应明显并清晰如果任何泳道的核糖体 RNA 或者特定的样品条带显示不明显不清晰, 弥散成小片段 RNA 或者消失, 则可能是样本在处理之前已经发生 RNA 降解或者在纯化过程中造成了 RNA 降解下图为福际生物培养细胞总 RNA 提取试剂盒处理不同数量的细胞样本, 获得的 RNA 电泳图 Copyright Foregene 2018/03. All rights reserved. 7/19

9 注意事项 :( 请务必在使用试剂盒前仔细阅读注意事项 ) 样品应避免反复冻融, 否则会导致提取的 RNA 降解且提取量也会下降试剂盒使用前, 请在 Buffer crl1 中加入 β- 巯基乙醇每 1ml Buffer crl1 加入 10μl β- 巯基乙醇, 建议现配现用,Buffer crl1 在加入 β- 巯基乙醇后可在 4 放置 1 个月如提取的 RNA 不用于克隆全长 cdna, 仅用于 qpcr 或测序分析等其他下游操作, 可以选择不加 β- 巯基乙醇, 不会影响提取效果试剂盒使用前, 请在 Buffer crl2 中添加无水乙醇, 加入量请参照试剂瓶上标签不同规格的试剂盒无水乙醇的添加量见下表 : 产品规格 RE RE RE 无水乙醇添加量 15ml 30ml 60ml 试剂盒使用前, 请在 Buffer RW2 中添加无水乙醇, 加入量请参照试剂瓶上标签不同规格的试剂盒无水乙醇的添加量见下表 : 产品规格 RE RE RE 无水乙醇添加量 60ml 120ml 240ml RNA 产率和质量与细胞样本用量和洗脱体积有关, 建议每 250μl Buffer crl1 使用使用细胞的最大量为 10 6 洗脱体积 : 洗脱液体积不应少于 20μl, 否则会影响 RNA 回收效率所有实验步骤若非特别指出, 均在常温 (15-25 ) 进行请检查试剂盒中的 Buffer crl1 和 Buffer RW1 是否有晶体析出现象, 若低温存放后有晶体析出, 可将 Buffer 放置于室温或 37 一段时间, 将晶体溶解后混匀再使用 Copyright Foregene 2018/03. All rights reserved. 9/19

10 操作前准备事项使用本试剂盒前, 请务必仔细阅读说明书培养细胞总 RNA 提取试剂盒操作简单方便快速, 说明书提供了整个试剂盒的正确使用方法请在使用前准备好必要的实验材料和设备实验材料和设备个培养动物细胞 1.5ml RNase-Free EP 管台式离心机 ( 13,400 g) 移液器等自备试剂无水乙醇 β- 巯基乙醇 ( 选用 ) 安全性本产品仅供科研使用, 请勿用于医药临床医疗食品及化妆品等用途在使用该试剂盒时, 请穿戴实验服一次性乳胶手套一次性口罩等以保护自身 ; 并最大程度上避免人为引入的 RNase 污染 Buffer crl1 含有离液盐 : 变性剂, 刺激性 Buffer crl2 含有无水乙醇 : 易燃 Buffer RW1 含有离液盐 : 变性剂, 刺激性 Buffer RW2 含有无水乙醇 : 易燃 Copyright Foregene 2018/03. All rights reserved. 10/19

11 操作指南请根据自己的样本材料选择相应的裂解方式进行细胞裂解操作样本选取和保存样本的选择及保存很大程度上决定着 RNA 的产量应尽可能的采用新鲜细胞进行 RNA 提取当样本采集之后,RNA 很快会发生降解 ; 如果采集的样本来不及提取 RNA, 请尽快妥善保存我们建议新采集的样本应立即放入液氮中速冻, 之后长期保存于 -80 并避免样本的反复冻融 ; 或者将样本立即浸泡在本试剂盒的 Buffer crl1 溶液中, 在室温条件下可保存约 24h, 在 4 中保存约 1 周, 更长时间保存请存放于 -80, 使用时将溶液在室温或 37 溶解即可为了避免 RNA 的降解, 样本的采集与保存应尽可能迅速的进行样品在 Buffer crl1 中保存 RNA 在 Buffer crl1 不会受到 RNase 的降解, 如果细胞加入 Buffer crl1 裂解后如不即时使用, 在室温条件下可保存约 24h, 在 4 中保存约 1 周, 更长时间保存请存放于 -80, 使用时将溶液在室温或 37 溶解即可样本初始用量正确的样本的初始取用量对于 RNA 的最佳产量及纯度十分必要, 样本的最大取用量与下面因素相关 : 样本本身的类型以及样本 RNA 的丰度 ; Buffer crl1 的用量决定了样本的有效裂解 ; RNA-Only Column 的 RNA 结合能力根据上述因素, 参照 10 6 细胞样本 RNA 得率表, 我们推荐细胞的初始用量不宜超过 10 6 如果样本用量过多,Buffer crl1 对细胞裂解不完全, 导致纯化获得的 RNA 纯度不高 ; 同时可能会超过 RNA-Only Column 的最大承载量而浪费珍贵样本 Copyright Foregene 2018/03. All rights reserved. 11/19

12 细胞裂解在 Buffer crl1 条件下, 使用移液器反复吹打混匀细胞样本破碎要彻底, 直到见不到细胞团为止, 以完全破坏细胞膜及细胞器以释放 RNA, 否则将影响 RNA 的产量以及在下步进行裂解物分离操作 ( 见操作步骤第二步骤 ) 容易发生离心柱堵塞材料取用说明培养细胞 : 单次处理, 用量请勿超过 10 6 预防样本间交叉污染为了避免样本间交叉污染, 每次取样后都需要将取样器材的刃口或与样本直接接触的部位浸入 2% 次氯酸钠溶液中, 反复洗刷数次进行清洗, 然后用干净的纸巾擦干残余液体后再进行使用为了试验方便, 也可准备多个取样器材, 在使用完后进行统一清洗, 确保每一单独样本均使用的是无污染的取样器材 RNase 污染预防人体接触是重要的 RNase 污染源, 且部分试剂中可能带有刺激性气味, 请在操作过程中经常更换手套, 并佩戴一次性口罩请使用无 RNase 的枪头和其他塑料制品 RNA 在 Buffer crl1 中时不会被 RNase 污染, 但提取后继续处理过程中应使用不含 RNase 的塑料和玻璃器皿玻璃器皿可在 150 烘烤 4 小时, 塑料制品可在 0.5M NaOH 中浸泡 10 分钟, 然后用水彻底清洗, 高压灭菌, 即可去除 RNase 配制溶液应使用无 RNase 的水 ( 将水加入处理过不含 RNase 的玻璃瓶中, 加入 DEPC 至终浓度 0.01%(v/v), 混匀后放置过夜, 高压灭菌 ) 基因组 DNA 污染及清除培养细胞总 RNA 提取试剂盒主要是为了从动物培养细胞中获得可观的 RNA, 并且有独特的 DNA-Cleaning Column 可有效的除去体系中大部分 DNA 污染, 纯化获得的 RNA 通常无需使用 DNase 处理即可用于下游操作 Copyright Foregene 2018/03. All rights reserved. 12/19

13 操作步骤使用前请先在 Buffer crl2 和 Buffer RW2 中加入无水乙醇, 加入体积请参照瓶上的标签如提取的 RNA 不用于克隆全长 cdna, 仅用于 qpcr 或测序分析等其他下游操作, Buffer crl1 可以选择不加 β- 巯基乙醇, 不会影响提取效果 1. 根据不同来源按以下说明进行细胞裂解 a 贴壁细胞 : 将培养皿中的液体彻底吸干净, 直接用 Buffer crl1 进行消化裂解 ; 或者离心收集细胞后加入 Buffer crl1, 个细胞加入 250μl Buffer crl1, 用移液器反复吹打混匀 ( 直到看不到细胞团为止 ) 注意 : 务必将细胞培养皿中的液体彻底吸干净, 否则会影响 RNA 的得率和纯度 b 悬浮细胞 : 直接离心收集细胞, 加入 Buffer crl1, 个细胞加入 250μl Buffer crl1, 用移液器反复吹打混匀 ( 直到看不到细胞团为止 ) 注意 :RNA 在 Buffer crl1 不会受到 RNase 的污染, 如果细胞在加入 Buffer crl1 裂解后不即时使用, 在室温条件下可保存约 24h, 在 4 中保存约 1 周, 更长时间保存请存放于 -80, 使用时将溶液在室温或 37 溶解即可 2. 将裂解好的细胞混合液转移至 DNA-Cleaning Column 中 (DNA-Cleaning Column 放入收集管中 ),12,000 rpm (~13,400 g ) 离心 2min 移除 DNA-Cleaning Column, 保留收集管内上清液注意 : 如果 DNA-Cleaning Column 收集管底部有沉淀产生, 请将上清液转移至干净离心管中再进行步骤 3, 切勿将其吸入上清液中 3. 向上述上清液 ( 体积应约为 250μl) 中加入 1.6 倍体积 Buffer crl2( 使用前请确认已按照说明加入无水乙醇 ), 轻柔混匀注意 : Buffer crl2 加入量请按照实际操作过程中上清液的体积进行比例换算加入例如 :250μl 上清液中加入 400μl Buffer crl2( 已加入无水乙醇 ) 如果混合液出现浑浊或絮状沉淀, 请直接进行步骤 4 即可 4. 将混合液 ( 约 650μl) 全部转移至 RNA-only Column 中 ( 纯化柱放入收集管中 ),12,000 rpm (~13,400 g ) 离心 1min, 弃掉收集管中的废液注意 : 如果混合液中出现絮状沉淀, 请将沉淀一并转移至纯化柱中 5. 向纯化柱中加入 500μl Buffer RW1,12,000 rpm (~13,400 g ) 离心 1min, 弃掉收集管中的废液 Copyright Foregene 2018/03. All rights reserved. 13/19

14 6. 向纯化柱中加入 700μl Buffer RW2( 使用前请确认已按照说明加入无水乙醇 ), 12,000 rpm (~13,400 g ) 离心 1min, 弃掉收集管中的废液 7. 重复步骤 6 8. 将纯化柱放回收集管中,12,000 rpm (~13,400 g ) 空管离心 2min, 去掉离心柱中残余的 Buffer RW2 9. 将纯化柱转移至新的 RNA 收集管中, 向纯化柱的膜中央滴加 20-50μl 已于 65 预热的 RNase-Free ddh 2 O( 切勿将洗脱液添加到压圈上, 否则会损失较大体积的洗脱液 ), 室温放置 2min 12,000 rpm (~13,400 g ) 离心 1min 收集 RNA 溶液注意 : 硅胶膜会吸附少量的液体, 洗脱后所得的 RNA 产物体积会有所偏差增加洗脱体积可提高 RNA 产量,RNase-Free ddh 2 O 加入体积不应低于 20μl, 体积过小会影响洗脱效率得到的 RNA 溶液可直接用于下游实验或置于 -80 保存由于本试剂盒对 RNA 二级结构保护较好, 建议凝胶电泳之前, 先将得到的 RNA 溶液置于 72 变性处理 5-10min 10. 将离心得到的 RNA 溶液重新加至纯化柱中, 重复步骤 9( 如对 RNA 得率要求不高, 可忽略此步骤 ) Copyright Foregene 2018/03. All rights reserved. 14/19

15 RNA 浓度及纯度检测得到的 RNA 的质量与操作过程中的多种因素有关 RNA 可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度由于本试剂盒对 RNA 二级结构保护较好, 建议凝胶电泳之前, 先将得到的 RNA 溶液置于 72 变性处理 5-10min 用分光光度计测定 RNA 浓度, OD260 值为 1 相当于大约 40μg/ml 的 RNA 当细胞量过低导致 RNA 的产量低, 分光光度计不能准确的测定其 OD 值, 请使用 RT-qPCR 进行 RNA 的检测 RNA 的 OD260/280 比值通常用作核酸纯度的衡量指标, 一般情况下, 纯 RNA 的 OD260/280 比值在 OD260/280 比值会受测定所用溶液的 ph 值的影响, 例如, 纯化 RNA 在 ph 7.5 的 10mM Tris 缓冲液中 OD260/280 读数在之间, 而在中性的水溶液中比值会变低, 可能只有 , 这并不意味着 RNA 的质量变差 DNA 污染及检测目前没有有效的纯化方法能保证纯化得到的 RNA 中完全没有 DNA 的污染, 即便在凝胶电泳时检测不到 DNA 条带, 也可能存在微量的 DNA 而 RNA 提取试剂盒能除去 RNA 中的绝大部分 DNA, 然而微量的 DNA 依然可能存在于样品中, 它的存在量与样本的用量及其本身性质有关对于纯化得到的 RNA 中的微量 DNA 的检测, 可以通过不经逆转录进行实时荧光定量 PCR 检测我们建议, 可以设计引物, 其退火匹配区域位于基因组 DNA 的内含子中如果 RNA 中不含有任何基因组 DNA, 基于这对引物的 PCR 是不会扩增出相应的 PCR 产物 Copyright Foregene 2018/03. All rights reserved. 15/19

17 问题分析指南以下针对细胞 RNA 提取中可能遇到的问题进行分析, 希望能对您的实验有所帮助另外, 对于在操作说明和问题分析以外的其他实验或技术上的问题, 我们设有专门的技术支持帮助您如有任何需要可联系我们 : 或 E-mali: 提取不到 RNA 或者 RNA 产量低通常会有多种因素影响回收效率, 比如 : 样本 RNA 含量操作方法洗脱体积等 1. 样本保存不当或样本保存时间过久建议 : 样本保存于 -80 或冻存于液氮中, 并避免反复冻融使用 ; 尽量采用新鲜培养的细胞进行 RNA 提取操作 2. 样本裂解不充分建议 : 在细胞裂解时, 请保证细胞完全裂解 3. 洗脱液添加不正确建议 : 确认 RNase-Free ddh 2 O 滴加到了纯化柱膜中间位置 4. Buffer crl2 或 Buffer RW2 中没有添加正确体积的无水乙醇建议 : 请按照说明书, 在试剂盒使用前,Buffer crl2 和 Buffer RW2 中添加正确体积的无水乙醇并混匀 5. 细胞样本用量不合适建议 : 每 250μl Buffer crl1 最多使用 10 6 个细胞, 细胞量过多会导致 RNA 提取得率及纯度降低 6. 洗脱体积不合适或洗脱不彻底建议 : 纯化柱的洗脱液体积为 20-50μl; 若洗脱效果并不理想, 建议在加入预热的 RNase-Free ddh 2 O 后, 延长室温放置的时间, 例如放置 5-10min 7. 纯化柱在 Buffer RW2 洗涤之后有乙醇残留建议 : 如果在 Buffer RW2 洗涤, 空管离心 1min 后还有乙醇残留, 可以将空管离心操作的时间增加至 2min, 或将纯化柱置于室温 5min, 以充分除去残留乙醇 Copyright Foregene 2018/03. All rights reserved. 17/19

18 纯化获得的 RNA 有降解纯化得到的 RNA 的质量和样本的保存 RNase 污染操作等因素有关 1. 细胞样本没有及时保存建议 : 细胞在收集后若不及时使用, 请立即低温保存于 -80 或者液氮中提取 RNA 请尽量使用新近采取的细胞样本 2. 细胞样本反复冻融建议 : 样本保存时, 最好分成小份保存, 使用时取出其中一份即可, 避免样本的反复冻融导致 RNA 的降解 3. 操作间有 RNase 引入或没有佩戴一次性手套口罩等建议 :RNA 提取实验最好在单独的 RNA 操作间进行, 并在实验前清理好实验桌, 实验时佩戴一次性手套口罩, 最大程度上避免 RNase 引入导致的 RNA 降解 4. 试剂在使用过程中被 RNase 污染建议 : 更换新的 Cell Total RNA Isolation Kit 进行相关实验 5. RNA 操作时所用的离心管枪头等有 RNase 污染建议 : 确认 RNA 提取时所用到的离心管枪头移液器等都是 RNase-Free 纯化获得的 RNA 影响下游实验经纯化柱纯化的 RNA, 如果盐离子蛋白质含量过多会影响下游实验, 比如 : 逆转录 Northern Blot 等 1. 洗脱后的 RNA 有盐离子残留建议 : 确认 Buffer RW2 中添加了正确体积的乙醇, 并按操作说明的离心转速进行 2 次纯化柱洗涤 ; 如果还有盐离子残留, 可在纯化柱加入 Buffer RW2 后, 室温放置 5min, 再进行离心操作, 以最大程度上去除盐离子污染 2. 洗脱后的 RNA 有乙醇残留建议 : 确认 Buffer RW2 洗涤后, 按操作说明的离心转速进行空管离心操作 ; 如果还有乙醇残留, 可以将空管离心操作的时间增加至 2min, 或者在空管离心后在室温放置 5min, 以最大程度上去除乙醇残留 Copyright Foregene 2018/03. All rights reserved. 18/19

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foregene Viral RNA Isolation Kit Cat.No.RE-02011/02012/02014 For purification of viral RNA from plasma,serum,cell-free body fluids,cell-culture supernatants For research use only Store at room temperature Copyright