bioteke

Size: px

Start display at page:

Download "bioteke"

泉云齐
5 years ago
Views:

1 一般实验室使用, 仅用于体外目录超纯总 RNA 快速提取试剂盒 ( 离心柱型 ) 用于快速提取各种动植物细胞 / 组织高纯度总 RNA 一试剂盒组成储存稳定性 1 二原理简介 2 目录号 :RP5611(20 次 ) RP5612(50 次 ) 三试剂盒特点 2 使用手册 2014 年 4 月, 第 1 版四注意事项 2 五操作步骤 4 六疑难解答 6 北京百泰克生物技术有限公司 Bioteke Corporation

2 一试剂盒组成储存稳定性试剂盒组成保存 20 次 (RP5611) 50 次 (RP5612) 裂解液 RL 4 避光 25 ml 55 ml 去蛋白液 RE 室温 15ml 30ml 漂洗液 RW 4 ( 一个月 )-20 ( 长期 ) 6 ml 15 ml 第一次使用前按说明加指定量乙醇 RNase-free H 2 O 室温 10 ml 15ml 4ml RNase-free H 2O 9ml RNase-free H 2O 70% 乙醇室温第一次使用前按说明加指定量乙醇 RNase-free 吸附柱 RA 室温 20 个 50 个收集管 (2ml) 室温 20 个 50 个 gdnase ul 100ul 10 Buffer ul 100ul 注意事项 1. 第一次使用前请先在漂洗液 RW 瓶和 70% 乙醇瓶中加入指定量乙醇, 加入后请及时打钩标记已加入乙醇, 以免多次加入! 2. 所有的溶液应该是澄清的, 如果环境温度低时溶液可能形成沉淀, 此时不应该直接使用, 可在 37 水浴加热几分钟, 即可恢复澄清 3. 不适合储存于低温的溶液 (4 或者 -20 ) 会造成溶液沉淀, 影响使用效果, 因此在使用时要先把溶液恢复室温后使用裂解液 RL 可以常温运输, 收到后 4 避光保存 4. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发氧化 PH 值变化, 各溶液使用后应及时盖紧盖子二原理简介改进的异硫氰酸胍 / 酚一步法裂解细胞和灭活 RNA 酶, 然后总 RNA 在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜, 再通过一系列快速的漂洗 - 离心的步骤, 去蛋白液和漂洗液将细胞代谢物蛋白等杂质去除, 最后低盐的 RNase free water 将纯净 RNA 从硅基质膜上洗脱三试剂盒特点 1. 离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜, 柱与柱之间吸附量差异极小, 可重复性好克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端 2. 结合了异硫氰酸胍 / 酚一步法试剂稳定性好, 纯度高和离心柱方便快捷的优点, 不需要异丙醇沉淀和乙醇洗涤过程,RNA 可以直接从离心柱上洗脱避免了过度干燥不易溶解问题 3. 独有的 RL 裂解液配方, 可以有效的消除基因组污染消化液的增加, 更高效率的去除了 DNA 的污染, 确保 RNA 的完整性 4. 多次漂洗去蛋白过程, 提取 RNA 纯度更高 5. 有效的去除了无用的 5S 在总 RNA 中含量, 提高了纯度四注意事项 ( 实验前必须首先阅读这部分!) 1. 为防止 RNA 降解, 所有离心步骤如未加说明, 均在 4 低温进行使用转速可以达到 13,000 rpm 的传统台式离心机, 如 Eppendorf 5415C 或者类似离心机 2. 裂解液 RL 和去蛋白液 RE 中含有刺激性有害化合物, 操作时要戴乳胶手套, 避免沾染皮肤眼睛和衣服若沾染皮肤眼睛时, 要用大量清水或者生理盐水冲洗

3 3. 预防 RNase 污染, 在实际的操作中应遵循以下指南 ( 参见分子克隆 ) * 全程佩戴一次性手套皮肤经常带有细菌和霉菌, 可能污染 RNA 的抽提并成为 RNA 酶的来源培养良好的微生物实验操作习惯预防微生物污染 * 使用灭菌的一次性的塑料器皿和自动吸管抽提 RNA, 避免使用公共仪器所导致的 RNA 酶交叉污染 * 使用无 RNA 酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿玻璃器皿可以在 150 C 的烘箱中烘烤 4 小时, 塑料器皿可以在 0.5 M NaOH 中浸泡 10 分钟, 用水彻底漂洗干净后高压灭菌备用 4. 考虑到环保问题, 本试剂盒不含有实验室常用试剂氯仿, 用户使用前需要自备氯仿 5. 常规的琼脂糖凝胶电泳和变性胶电泳均可以用来分析 RNA 的质量好的 RNA 产物在电泳后应该可以看到明显的二条优势核糖体 RNA 带, 分别为 ~5Kb(28S),~2Kb(18S), 条带亮度比值约为 2:1 有时候也可以看到 ~0.1kb 和 0.3Kb(5S,tRNA) 带但有时候根据不同的物种如某些植物组织可以看到 4,5 条带也属于正常现象, 如果 RNA 未成熟的前体或者不均一核 RNA 小核 RNA 提取出来也可能看到介于 7Kb 和 15Kb 之间的不连续的高分子量条带 6. 检测 OD 260 /OD 280 吸光度比值时,RNA 样品应该溶于 TE 后检测, 如果用水稀释后检测, 由于一般水离子强度和 PH 值低, 会使 OD 280 升高, 从而使比值降低 7. 加入裂解液 RL 匀浆后, 加氯仿前, 样品可在保存一个月以上五操作步骤 * 第一次使用前请先在漂洗液 RW 瓶和 70% 乙醇瓶中加入指定量乙醇! 1. 匀浆处理 a. 组织用玻璃或强力匀浆器搅匀组织样品, 保存于液氮内样品需要用研钵磨碎, 每 50~100mg 组织加 1ml 的裂解液 RL 后匀浆组织样品容积不能超过 RL 容积的 10% b. 单层生长的细胞直接往直径 3.5 cm 的培养板中加入 1ml 的 RL 溶解细胞, 并用移液枪轻轻吹打混匀依据培养板的面积而不是依据细胞的数量来决定所需的 RL 量 ( 每 10cm 2 加 1ml) 一般情况下, 普通大小的细胞培养瓶, 加入 1ml 的 RL, 迅速轻摇使 RL 充分和瓶底所有细胞接触裂解细胞并灭活 RNA 酶, 轻轻用移液枪反复吹打混匀当 RL 量不足时可导致抽提的 RNA 中污染有 DNA c. 悬浮生长的细胞通过离心来沉淀细胞在 RL 试剂中用移液枪反复吹打来裂解细胞每 5~ 的动物细胞, 植物或酵母菌细胞或每细菌加 1ml 的 RL 在加入 RL 前应避免洗涤细胞, 否则会增加 mrna 降解的可能性破裂某些酵母菌和细菌可能需要使用匀浆器 2. 将匀浆样品剧烈震荡混匀, 在 C 条件下孵育 5 分钟以使核蛋白体完全分解 3. 可选步骤 :4 C 的条件下 12,000rpm 离心 10 分钟, 小心取上清转入一个新的 RNase free 的离心管中当样品富含蛋白质脂肪多糖或是细胞外物质例如肌肉脂肪组织或植物的块茎部分时可能需要一额外的分离步骤匀浆化后在 2~8 C 的条件下以 12,000rpm 离心 10 分钟, 移除匀浆中不溶解的物质, 余下的沉淀中包含有细胞外膜多糖以及高分子量 DNA, 而上层的超浮游物含有 RNA 4. 每 1mlRL 加 0.2ml 氯仿盖紧样品管盖, 剧烈振荡 15 秒并将其在室温下孵育 3 分钟 5. 于 4 12,000rpm 离心 10 分钟, 样品会分成三层 : 下层有机相, 中间层和上层无色的水相,RNA 存在于水相中水相层的容量大约为所

4 加 RL 体积的 60%, 把水相转移到新管中, 进行下一步操作 6. 加入 1 倍体积 70% 乙醇 ( 请先检查是否已加入无水乙醇!), 颠倒混匀 ( 此时可能会出现沉淀 ) 得到的溶液和可能沉淀一起转入吸附柱 RA 中 ( 吸附柱套在收集管内 ) 7.10,000rpm 离心 45 秒, 弃掉废液, 将吸附柱重新套回收集管 8. 加 500μl 去蛋白液 RE,12,000rpm 离心 45 秒, 弃掉废液 9. 加入 700μl 漂洗液 RW( 请先检查是否已加入无水乙醇!),12,000 rpm 离心 60 秒, 弃掉废液 10. 加入 500μl 漂洗液 RW,12,000 rpm 离心 60 秒, 弃掉废液然后空甩 1min, 尽量去除乙醇残留, 影响 DNA 的消化 11. 取出 gdnase 和 10 Buffer free 水按照的比例配置 20ul 消化液, 将消化液加入吸附柱 RA 中 42 水浴 5min 然后取出继续步骤 8 和 9 然后接步骤将吸附柱 RA 放回空收集管中,12,000 rpm 离心 2 分钟, 尽量除去漂洗液, 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应 13. 取出吸附柱 RA, 放入一个 RNase free 离心管中, 根据预期 RNA 产量在吸附膜的中间部位加 50-80μl RNase free water( 事先在水浴中加热效果更好 ), 室温放置 2 分钟, 12,000 rpm 离心 1 分钟如果需要较多 RNA, 可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中, 离心 1 分钟, 或者另外再加 30μl RNase free water, 离心 1 分钟, 合并两次洗脱液洗脱体积越大, 洗脱效率越高, 如果需要 RNA 浓度较高, 可以适当减少洗脱体积, 但是最小体积最好不少于 30μl, 体积过小降低 RNA 洗脱效率, 减少 RNA 产量六疑难解答 (Trouble shooting) 出现的问题可能的原因建议解决方法 RNA 产量低样品裂解或者匀浆不彻底液氮研磨的时候尽量研磨完全, 加入裂解液 RL 后剧烈震荡或者用枪头吹打帮助裂解匀浆步骤可以提高产量新鲜组织或者植物组织可以不需液氮,SK 在干净研钵内加入适量裂解液 RL 直接研磨使用的样品或者裂解物在 -20 或者 -70 存放太久存放时间过长可能降低 RNA 产量, 应尽快的处理样品或者裂解物组织本身含 RNA 少不同类型的组织和细胞含有不同量的 RNA, 对于含量少的组织应该适当提高起始处理量超过了吸附柱的最大吸附能力同一个样品使用多个吸附柱, 然后合并得到 RNA 去蛋白液 RE 和漂洗液 RW 内忘记加乙醇第一次实验时, 漂洗液 RW 瓶和 70% 乙醇瓶中加入指定量无水乙醇 OD 260/OD 280 吸光度比值 <1.6 分光光度计检测吸光度时,RNA 样品不是溶于 TE, 而是溶于水低离子浓度和低 ph 条件下, OD 280 值会较高, 造成比值低检测时用 TE 稀释样品

5 接前表出现的问题可能的原因建议解决方法污染了蛋白或者苯酚做步骤 5 吸取取上清水相的时候小心不要吸取到中间相和下层有机相, 确保做了步骤 8 基因组 DNA 污染起始样品量超出了裂解液选择合适的起始处理量 RL 的处理范围样品中含有有机溶剂 ( 如避免这些可以改变裂解液 RL 性质乙醇,DMSO 等 ), 强缓或者 PH 值的物质冲液或碱性溶液吸取上清时吸入了中间相做步骤 5 吸取取上清水相的时候小心不要吸取到中间相 RNA 降解, 完整性不 RNA 提取所用各种物品按照注意事项准备 RNA 提取的各种佳和试剂没有灭活 RNA 酶用品组织取出后没有马上处理组织应该尽量立刻处理, 不能及时处或冷冻, 提取前已经降解理的应该尽快保存于液氮或者 - 70 提取的 RNA 样品没有保尽可能的将 RNA 保存在 -70 的低存在 -20 或 -70 低温温下游的 RT-PCR 实验不成功样品提取过程中降解忘记做步骤 11, 或者将吸附柱取出时下端碰到了收集管里面的漂洗液, 造成洗脱下来的 RNA 含有乙提取动作应该尽可能的快, 离心应该低温进行, 取用 RNA 时尽量冰上进行确保做了步骤 11, 然后小心取出吸附柱, 可以在空气中晾几分钟, 让残留乙醇挥发北京百泰克生物技术有限公司 BioTeke Corporation 地址 : 北京海淀区留学人员创业园电话 : 传真 : 网址 : info@bioteke.com 醇, 乙醇抑制了逆转录反应百泰克生物定货热线 : info@bioteke.com 百泰克生物定货热线 : info@bioteke.com

一试剂盒组成储存稳定性试剂盒组成保存 50 次 (RP5301) 100 次 (RP5302) 裂解液 MRL 4 避光 55 ml 55 ml 2 漂洗液 RW 4 ( 一个月 ) 15 ml 2 25 ml 2-20 ( 长期 ) 第一次使用前按说明加指定量乙醇 RNase-free

一试剂盒组成储存稳定性试剂盒组成保存 50 次 (RP5301) 100 次 (RP5302) 裂解液 MRL 4 避光 55 ml 55 ml 2 漂洗液 RW 4 ( 一个月 ) 15 ml 2 25 ml 2-20 ( 长期 ) 第一次使用前按说明加指定量乙醇 RNase-free 一般实验室使用, 仅用于体外目录 microrna 快速提取试剂盒 ( 离心柱型 ) 用于快速提取各种动植物细胞 / 组织基高纯度 microrna 目录号 : RP5301(50 次 ) RP5302(100 次 ) 一试剂盒组成储存稳定性 1 二原理简介 2 三试剂盒特点 2 四注意事项 2 使用手册 2006 年 9 月, 第 3 版五操作步骤 4 六疑难解答 6 北京百泰克生物技术有限公司