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浒于幸
5 years ago
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1 目录目录... 1 产品说明. 2 重要说明储存条件及产品稳定性... 3 使用前注意事项试剂盒成分安全事项. 5 EZgene TM 无内毒素质粒大提沉淀法操作步骤低拷贝质粒和科斯质粒的纯化. 9 疑难问题指南 Page 1

2 产品说明本试剂盒采用独特的缓冲液系统, 将碱裂解法和异丙醇沉淀法结合起来, 从大量的培养菌中提取高纯度的质粒 DNA, 可直接用于各种常规实验操作, 如酶切 PCR 测序连接转化实验, 转染内毒素敏感性细胞株, 原代细胞及用于微注射该试剂盒可以用来从 100 ml 以上的大肠杆菌菌液中快速, 高效地提取质粒 DNA 方法简单, 无需过柱, 不用酚氯仿抽提 ; 质粒损失率少, 质粒损伤小, 质粒提取量在 1 mg 以上, 最高可以达到 5 mg 菌液使用量灵活, 高拷贝质粒可使用 100 ml 菌液, 中低拷贝质粒可使用更多的菌液纯化过程约需 1~1.5 小时重要说明 : 质粒拷贝数 : 质粒 DNA 的产品决定于质粒 DNA 大小和拷贝数针对高拷贝的质粒, 本试剂盒的操作流程进行了优化如果是低拷贝的质粒, 则菌液体积和所用的溶液都需要加倍如需要进一步了解我们的产品信息, 请联系我们的客户服务, 表 1 列出了常用的质粒的相关特性表 1 常用的质粒及其预期产量质粒来源拷贝数预期产量 (µg 每 1 ml) psc101 psc pacyc P15A psupercos pmb pbr322 pmb pgem R Muted pmb pbluescript R ColE puc Muted pmb 宿主菌 : 菌株对质粒的扩增繁殖有着显著的影响,TOP10 和 DH5a 宿主菌能产生高拷贝质粒 DNA, 而诸如 JM101, JM110, HB101, TG1 及其衍生株系等 enda+ 菌株, 质粒 DNA 产率一般比较低, 这是由于在裂解的时候, enda+ 株系会释放内源的核酸内切酶和以及很多糖类物质因此当质粒产量不符合要求时, 我们建议将质粒转进 enda- 菌株表 2 列出了一些 enda 株系的分类 Page 2

3 表 2 大肠杆菌的 enda 株系分类 EndA- Strains of E. Coli DH5α DH1 DH21 JM106 JM109 SK2267 SRB XLO TOP10 DH10B JM103 JM107 SK1590 MM294 Stbl2 XL1- Blue BJ5182 DH20 JM105 JM108 SK1592 Select96 Stbl4 XL10- Gold EndA+ Strains of E. Coli C600 JM110 RR1 ABLE C CJ236 KW251 P2392 BL21(DE3) HB101 TG1 TB1 ABLE K DH12S LE392 PR700 BL21(DE3) plyss JM101 JM83 TKB1 HMS174 ES1301 M1061 Q358 BMH 所有的 NM 株系所有的 Y 株系生物量优化 (Cell Mass)(OD 600 菌液 ml 数 ): 本操作流程的最佳条件为 : 在 LB 培养基中培养了个小时后,OD 600 值在 2.0 至 3.0 的菌液中的质粒如果使用富集培养基比如 TB 培养基和 2 YT 培养基, 则菌液的 OD 600 值不能超过 3.0 如果细胞数目过多, 可以适当降低生物量或者按比例提高 A1, B1 和 C1 的用量菌液体积 : 培养菌液的培养液的体积应不大于摇菌瓶或者摇菌管总体积的 1/5, 不要超过操作手册中建议的最大的菌液量由于菌液体积过多造成的裂解不充分会降低纯度和产量储存条件及产品稳定性 Buffer A1 在加入 RNase A 后, 需放在 4 C 保存,Buffer ER* 也需于 4 C 保存其他所有试剂成分可置于常温下保存 (22-25 C ), 本试剂盒自购买之日起可保存 12 个月 Page 3

4 使用前注意事项仔细查阅本操作指南, 确保所有的试剂成分以及其他材料都已经准备好, 并熟悉操作请特别注意以下几点 : 重要说明 RNaseA:20 mg/ml, 可以在室温下保存半年使用前, 请将 RNase A 管瞬间离心使用前, 请将 RNaseA 加入到 Buffer A1 中 Buffer B1 在低于正常室温下会形成沉淀, 在使用前请将 Buffer B1 置于 50 C 加热溶解 ( 这一步十分重要 ) Buffer B1 使用后请旋紧瓶盖所有的离心操作在室温下进行实验前需自行准备的材料与试剂 70% 酒精高速离心机 50 ml 圆锥形管异丙醇 3M NaAC(pH=5.2) 或者 3M KAC(pH=5.2) Page 4

5 试剂盒成分 Catloga# PD PD PD Preps Buffer A1 22 ml 110 ml 270 ml Buffer ER* 1.2 ml 5.5 ml 13 ml Buffer B1 22 ml 110 ml 270 ml Buffer D1 2.5 ml 11 ml 27 ml Buffer N3 27 ml 135 ml 330 ml EndoClean Buffer 5 ml 25 ml 60 ml Buffer KB 22 ml 110 ml 270 ml RNase A (20 mg/ml) 2.2 mg (110 µl) 11 mg (550 µl) 27 mg (1.35 ml) Endofree Elution Buffer 6 ml 30 ml 60 ml User menu 安全事项 Buffer N3 含有酸性物质, 操作时请带手套和眼罩 ; Buffer N3 和 Buffer KB 含有离液盐, 当与漂白剂结合时, 会发生反应不要将漂白剂或者酸性溶液直接加到预备的废液桶中 Page 5

6 EZgene TM 无内毒素质粒大提异丙醇沉淀法操作步骤 (PD1516) 注 : 本试剂盒中提供的溶液量及操作步骤是根据 OD 600 在的高拷贝质粒的 200 ml 菌液提供, 如需更多溶液, 请联系 Biomiga 公司当使用的菌液量大于 200 ml, 相应溶液的使用量请参考下表 : Culture Volume < 200 ml 300 ml 400 ml 500 ml Ratio Buffer A1/RNaseA 10 ml 15 ml 20 ml 25 ml 1 V Buffer ER 0.5 ml 0.75 ml 1.0 ml 1.25 ml 0.05 V Buffer B1 9 ml 13.5 ml 18 ml 22.5 ml 0.9 V Buffer D1 1 ml 1.5 ml 2 ml 2.5 ml 0.1 V Buffer C1 3 ml 4.5 ml 6 ml 7.5 ml 0.3 V EndoClean Buffer 0.1V of Supernatant 0.1V of Supernatant 0.1V of Supernatant 0.1 V of Supernatant 0.1 V of Supernatant 1. 将初摇的 100 µl 加入到 ml 的 LB 培养基 ( 含适量抗生素 ),37 o C 震荡培养小时注 : 建议大肠杆菌的培养时间不要超过 16 个小时, 因为超过 16 个小时后, 大肠杆菌的开始降解, 这样可能会降低质粒产量注 : 不要直接从甘油保存的菌种中取菌液培养 2. 室温下 5,000 x g 离心 10 min, 收集菌体, 将上清倒掉, 并将收集管倒扣在纸巾上以除去残留在菌体表明的培养基, 将上清完全去除注 : 残留的液体培养基将会导致菌液裂解不充分, 质粒 DNA 产量下降第 6 步离心后沉淀较松, 不能有效吸取上清 3. 加入 10 ml Buffer A1( 确保已加入 RNase A), 用移液枪或涡流震荡充分悬浮细菌细胞再向悬浮的菌液中加入 0.5 ml 的 Buffer ER, 反转 5-10 次, 混合均匀 37 C 温育 10min 注 : 细菌细胞的充分悬浮均匀对后续的菌体裂解和裂解液中和十分重要 4. 加入 9 ml Buffer B1, 温和地反转 5-10 次以混合均匀, 然后静置 2-5 min 至溶液粘稠而澄清, 加入 1 ml Buffer D1, 温和地反转 5 次, 静止 5 min Page 6

7 注 : 静置时间不超过 5 min, 时间过长会导致基因组 DNA 污染或质粒受到损伤注 :Buffer B1 在低于室温下会形成云状的沉淀, 使用前请在 Buffer B1 置于 50 C 加热溶解 5. 加入 2.4 ml Buffer N3, 立即反转多次, 至溶液充分混匀, 此时出现白色絮状沉淀注 : 裂解液必须充分混合, 如果混合物仍然呈现圆球状, 褐色或者比较粘稠, 则需继续混合以完全中和裂解液 6. 将离心管转至高速离心机, 在室温下 >14,000 x g 离心 10 min 注 : 若上清中仍然有白色沉淀, 可以将上清吸取置于一新的离心管中, 离心 5 min 注 : 如果转子是冷的, 将裂解液在室温下放置 10 min, 然后在按照上述步骤离心 7. 小心吸取离心后的上清液至 50 ml 离心管中 ( 避免吸起沉淀 ), 加入 0.1 倍体积的 EndoClean Buffer,, 用手迅速颠倒混匀混匀后冰浴 10 min, 其间不时摇匀 ( 若 EndoClean Buffer 粘稠难吸, 可将枪头剪掉头后再吸取 ) 注 : 加入 EndoClean Buffer 后溶液变红并浑浊, 冰浴后变清亮 8. 取出后 65 o C 温浴 5 min 左右, 使溶液变浑浊, 室温下 ( 务必使溶液温度恢复到 23 o C 以上, 否则离心后溶液不分层 ),10,000 x g 离心 5 min( 也可在 2,500 x g 离心 15 min) 此时溶液分为两层, 上层水相含有质粒, 下层红色有机相含有内毒素注 : 若离心后上层水相漂浮部分红色小珠, 可静止几分钟, 待红色小珠自然沉淀上层残留的红色液体在洗涤时会被一并洗去, 将不影响实验结果也可在加入经温育后的 200 µl Chloroform (>37oC), 混匀后再重复步骤 7, 将有利于分层注 : 此时可去除 99% 的无内毒素, 再重复第 7-8 步可使内毒素含量低于 0.1 EU (Endotoxin)/ µg DNA. 9. 小心将上层水相转移至一个新的 50 ml 管中 ( 避免吸取下层红色有机相 ), 加入 0.1 倍体积的 3M NaAC (ph=5.2) 或者 3M KAC(pH=5.2) 和倍体积的异丙醇, 用手迅速颠倒混匀 C, 大于 14,000 x g 离心 20 min,, 这时候将出现质粒 DNA 沉淀, 小心倒去上清, 沉淀上残留的上清用枪头吸干注 : 数百微克高纯度的质粒 DNA 离心后沉淀在管的侧壁上, 可能无法看到明显团块 Page 7

8 11. 加入 5 ml Buffer KB, 将沉淀轻轻弹起, 室温放置约 5 min, 4 C 10,000~12,000 x g 离心 5 min, 小心倒去上清, 沉淀上残留的上清用枪头吸干注 : 这时候白色的沉淀将变得透明或者半透明, 倾倒沉淀要小心, 不要将沉淀倒出 12. 加入 5 ml 70% 乙醇, 将沉淀轻轻弹起, 室温放置约 5 min, 4 C 10,000~12,000 x g 离心 5 min, 将上清小心倒出, 沉淀上残留的上清用枪头吸干, 重复步骤 10 注 : 这时候透明的沉淀将重新变成白色的沉淀 C 5,000 x g 离心 1 min, 用枪头将残留的上清吸干 14. 将离心管在空气中风干, 或者置于 55 C 烘箱中 5 min, 以彻底去除残留酒精注 : 不要过分干燥, 否则质粒 DNA 沉淀不容易溶解 15. 加入 ml Endofree Elution Buffer 或者 ddh2o, 可置于 65 C 水浴或用宽口吸管轻轻吹打辅助溶解 16. DNA 浓度计算如下 : DNA 浓度 = 50 μg/ml OD260 { 稀释倍数 } 注 : 纯化的质粒的 OD 260/OD 280 的比值在之间, 如果用水溶解, OD 260/OD 280 会偏低, 但并表示 DNA 纯度低, 因为 ph 值和离子存在会影响 OD 比值 Page 8

9 纯化低拷贝质粒 / 科斯质粒从过夜的培养物中得到低拷贝质粒浓度一般为 ug/ml, 如果要纯化低拷贝和中等拷贝的质粒, 请参照下面的指南操作 : 1 菌液体积 : 使用 2 倍体积的菌液, 使用的菌液体积为高拷贝质粒的菌液体积的 2 倍 2 使用 2 倍体积的 Buffer A1,B1,N3, 如需额外的 A1,B,C1, 可向 Biomiga 购买纯化 > 12Kb 的质粒如果纯化的质粒大于 12 Kb, 请参照下面的指南操作 : 1 菌液体积 : 使用 2 倍的菌液体积, 使用的菌液体积为高拷贝质粒的菌液体积的 2 倍 2 使用 2 倍体积的 Buffer A1,B1,N3, 如需额外的 A1,B1,N3, 可向 Biomiga 购买 3 Endofree Elution Buffer 加入前在 C 中预热 Page 9

10 问题指南问题可能的原因建议产量低细胞裂解不充分加入 B1 前, 用枪头或者涡旋振荡器充分悬浮细胞团 Buffer B1 如果没盖紧会降低裂菌的效果按照 0.2 M NaOH,1% SDS 准备新鲜的 Buffer B1 产量低菌液生长过度或者菌液不新鲜菌液培养不要超过 16 小时如果暂时不做, 不要将菌液放 4 C 保存, 将菌液离心去上清后放 -20 C 保存产量低质粒拷贝数低. 按照第 8 页的建议增加菌液用量和 A1,B1 和 N3 的用量没有 DNA 基因组 DNA 污染 RNA 污染质粒在大肠杆菌宿主菌中丢失加入 B1 后放置时间过长或者动作过于剧烈 RNase A 没有加入到 Buffer A1 使用新鲜的菌液加入 B1 后不要涡旋或者剧烈摇晃加入 B1 后放置时间不要超过 5 分钟将 RNase A 添加到 Buffer A1 中 Page 10

11 Related Products Catalog # Product Name Preps Price RMB PD EndoFree plasmid mini kit PD EndoFree plasmid mini kit PD EndoFree plasmid midi kit PD EndoFree plasmid midi kit PD EndoFree plasmid ezfilter midi kit PD EndoFree plasmid ezfilter midi kit PD EndoFree plasmid maxi kit PD EndoFree plasmid maxi kit PD EndoFree plasmid ezfilter maxi kit PD EndoFree plasmid ezfilter maxi kit PD EndoFree plasmid ezfilter mega 3 kit PD EndoFree plasmid ezfilter mega 3 kit PD EndoFree plasmid ezfilter mega 6 kit PD EndoFree plasmid ezfilter mega 6 kit PD EndoFree plasmid ezfilter mega 10 kit PD EndoFree plasmid ezfilter mega 10 kit Page 11

12 Limited Use and Warranty This product is warranted to perform as described in its labeling and in Biomiga s literature when used in accordance with instructions. No other warranties of any kind, express or implied, including, without limitation, implied warranties of merchantability or fitness for a particular purpose, are provided by Biomiga. Biomiga s sole obligation and purchaser s exclusive remedy for breach of this warranty shall be, at the option of Biomiga, to replace the products, Biomiga shall have no liability for any direct, indirect, consequential, or incidental damage arising out of the use, the results of use, or the inability to use it product. For technical support or learn more product information, please contact us at or visit our website at *FOR RESEARCH USE ONLY. Page 12

实验前需准备的材料离心机已灭菌的 1.5 ml 离心管水浴锅无水乙醇异丙醇不同体积样品 DNA 的收获量材料来源样品量收获量人全血 (DNA 收获量会因为白细胞的量而有差别 ) 300 μl 5-15 μg 5 ml μg 10 ml μg 12 ml

实验前需准备的材料离心机已灭菌的 1.5 ml 离心管水浴锅无水乙醇异丙醇不同体积样品 DNA 的收获量材料来源样品量收获量人全血 (DNA 收获量会因为白细胞的量而有差别 ) 300 μl 5-15 μg 5 ml μg 10 ml μg 12 ml VER:1010 盐析法血液基因组 DNA 提取试剂盒 (GD2516 EZgene TM SQ Blood gdna Kit) 产品组成成分 GD2516-00 GD2516-01 GD2516-02 GD2516-03 Total Blood Volume 10 ml 50 ml 150 ml 300 ml 4 x Buffer ML* 15 ml 75 ml 225 ml 450 ml Buffer