复旦大学于文强实验室 protocol DNA 甲基化处理及测定前言实验材料一实验材料二主要设备仪器实验方法一基因组 DNA 准备 ( 天根血液 / 细胞 / 组织基因组 DNA 提取试剂盒 ) 二基因组 DNA bisulfite 处理 (zymo research,ez DNA Met

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兵虞
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1 DNA 甲基化处理及测定前言实验材料一实验材料二主要设备仪器实验方法一基因组 DNA 准备 ( 天根血液 / 细胞 / 组织基因组 DNA 提取试剂盒 ) 二基因组 DNA bisulfite 处理 (zymo research,ez DNA Methylation- Gold Kit) 三 PCR 扩增 (PCR amplification) 四 PCR 产物纯化 ( 天根, 普通 DNA 产物纯化试剂盒 ) 五焦磷酸测序 Pyrosequencing 1

2 前言重亚硫酸盐使 DNA 中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶, 而甲基化的胞嘧啶保持不变, 用 PCR 扩增 ( 引物设计时尽量避免有 CpG, 以免受甲基化因素的影响 ) 所需片段, 则尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶最后, 对 PCR 产物进行测序, 并且与未经处理的序列比较, 判断是否 CpG 位点发生甲基化是一种可靠性及精确度很高的方法, 能明确目的片段中每一个 CpG 位点的甲基化状态在寻找有意义的关键性 CpG 位点上, 有其他方法无法比拟的优点实验材料 1. 实验材料 1) 细胞基因组 ; 2) EZ DNA Methylation-Gold Kit; 3) KAPA DNA 聚合酶 ; 4) DNA 产物纯化试剂盒 ; 2. 实验仪器 1)PCR 仪 ; 2) 离心机 ; 3) 移液器 ; 4) 琼脂糖凝胶电泳仪 ; 实验方法一基因组 DNA 准备 ( 天根血液 / 细胞 / 组织基因组 DNA 提取试剂盒 ) 操作步骤 : 使用前请先在缓冲液 GD 和漂洗液 PW 中加入无水乙醇, 加入体积请参照瓶上的标签 1. 处理材料 a) 如提取材料为血液, 可直接使用 200 μl 新鲜冷冻或加入各种抗凝剂的 2

3 血液, 不足 200 μl 可加缓冲液 GA 补足 ; 注意 : 如需处理更大体积血液, 如 300 μl-1 ml, 应按以下步骤操作 : 在样品中加入 3 倍体积红细胞裂解液 ( 例如,300 μl 血液加入 900 μl 红细胞裂解液 ), 颠倒混匀, 室温放置 5 min, 期间再颠倒混匀几次 rpm(~11,500 g) 离心 1 min( 若离心机最高转速不允许, 可 3000 rpm(~3,400 g) 离心 5 min), 吸去上清, 留下白细胞沉淀, 加 200 μl 缓冲液 GA, 振荡至彻底混匀 b) 如果处理血样为禽类鸟类两栖类或更低级生物的抗凝血液, 其红细胞为有核细胞, 因此处理量 5-20 μl, 可加缓冲液 GA 补足 200 μl 后进行下面的裂解步骤 c) 贴壁培养的细胞应先处理为细胞悬液, 然后 10,000 rpm(~11,200 g) 离心 1 min, 倒尽上清, 加 200 μl 缓冲液 GA, 振荡至彻底悬浮 ; d) 动物组织 ( 脾组织用量应少 10 mg) 应先打碎处理为细胞悬液, 然后 10,000 rpm(~11,200 g) 离心 1 min, 倒尽上清, 加 200 μl 缓冲液 GA, 振荡至彻底悬浮注意 : 如果需要去除 RNA, 可加入 4 μl RNaseA(100 mg/ml) 溶液, 振荡 15 sec, 室温放置 5 min 2. 加入 20 μl Proteinase K 溶液, 混匀 a. 提取血液基因组时, 只需加入 Proteinase K 混匀, 即可继续进行下一步 b. 提取细胞基因组时, 只需加入 Proteinase K 混匀, 即可继续进行下一步 c. 提取组织基因组时, 加入 Proteinase K 混匀后, 在 56 放置, 直至组织溶解, 简短离心以去除管盖内壁的水珠, 再进行下一步骤注意 : 不同组织裂解时间不同, 通常需 1-3 h 即可完成 ( 鼠尾需要消化过夜 ) 不会影响后续操作每小时颠倒混合样品 2-3 次, 用水浴振荡器也可 3. 加入 200 μl 缓冲液 GB, 充分颠倒混匀,70 放置 10 min, 溶液应变清亮, 简短离心以去除管盖内壁的水珠注意 : 加入缓冲液 GB 时可能会产生白色沉淀, 一般 70 放置时会消失, 不会影响 3

4 后续实验如溶液未变清亮, 说明细胞裂解不彻底, 可能导致提取 DNA 量少和提取出的 DNA 不纯当血液体积 200 μl 且没有采用红细胞裂解处理, 或是样本储存条件不佳, 水浴后颜色可能为深褐色, 注意溶液中没有团块等沉淀 4. 加人 200 μl 无水乙醇, 充分振荡混匀 15 sec, 此时可能会出现絮状沉淀, 简短离心以去除管盖内壁的水珠 5. 将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱 CB3 中 ( 吸附柱放入收集管中 ),12,000 rpm (~13,400 g) 离心 30 sec, 倒掉废液, 将吸附柱 CB3 放回收集管中 6. 向吸附柱 CB3 中加入 500 μl 缓冲液 GD ( 使用前请先检查是否已加入无水乙醇 ),12,000rpm (~13,400 g) 离心 30 sec, 倒掉废液, 将吸附柱 CB3 放入收集管中 7. 向吸附柱 CB3 中加入 600 μl 漂洗液 PW( 使用前请先检查是否已加入无水乙醇 ),12,000 rpm (~13,400 g) 离心 30 sec, 倒掉废液, 将吸附柱 CB3 放入收集管中 8. 重复操作步骤 7 9. 将吸附柱 CB3 放回收集管中,12,000 rpm(~13,400 g) 离心 2 min, 倒掉废液将吸附柱 CB3 置于室温放置数分钟, 以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液注意 : 这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除, 漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应 ( 酶切 PCR 等 ) 实验 10. 将吸附柱 CB3 转入一个干净的离心管中, 向吸附膜的中间部位悬空滴加 μl 洗脱缓冲液 TE, 室温放置 2-5 min,12,000 rpm (~13,400 g) 离心 2 min, 将溶液收集到离心管中注意 : 洗脱缓冲液体积不应少于 50 μl, 体积过小影响回收效率洗脱液的 ph 值对于洗脱效率有很大影响若用 ddh 2 O 做洗脱液应保证其 ph 值在范围内,pH 值低于 7.0 会降低洗脱效率 ; 且 DNA 产物应保存在 -20, 以防 DNA 降解为增加基因组 DNA 的得率, 可将离心得到的溶液再加入吸附柱 CB3 中, 室温放置 2 min,12,000 rpm(~13,400 g ) 离心 2 min 二基因组 DNA bisulfite 处理 (zymo research,ez DNA Methylation-Gold 4

5 Kit) 1. 在盛有 20ulDNA 样品的小管中加入 130ul CT 转换试剂 (CT Conversion Reagent) ( 如果 DNA 样品不足 20ul, 用 ddh2o 补足 ) 混匀, 瞬离 2. 将瞬离后的样品放入 PCR 仪, 设定反应程序如下 : 1) 98,10min; 2) 64,2.5h; 3) 4, ; 注意 : 对于某些特殊样品, 设定与上不同的参数亦有良好效果 ( 见附录 ); 如果你在使用本试剂盒时已采用与上不同的其他程序, 且已取得良好效果, 可以继续使用已用程序 3. 将 Zymo 柱 ( Zymo-Spin(TM)IC Column) 放入收集管 (Collection Tube) 中, 在其中加入 600ul M- 结合液 (M-Binding Buffer); 4. 在其中加入步骤 2 反应后的样品, 盖紧, 颠倒混匀 ; 5. 12,000rpm(<10,000g) 离心 30s, 弃下清 ; 6. 加入 100ul M- 清洗液 (M-Wash Buffer),12,000rpm 离心 30s, 弃下清 ; 7. 加入 200ul M- 脱磺化液 (M-Desulphonation Buffer), 室温 (20~30 ) 静置 15~20min,12,000rpm 离心 30s, 弃下清 ; 8. 加入 200ul M- 清洗液 (M-Wash Buffer),12,000rpm 离心 30s, 弃下清 ; 重复清洗一次 ; 9. 将柱子移入干净的 1.5ml EP 管中, 在柱子底部加入 10ul M- 溶解液 (M- Elution Buffer),12,000rpm 离心 30s 洗脱 DNA; 10. 收集的 DNA 可以直接进行后续实验也可以短期保存于 -20 ; 如果需要长期保存, 应保存于低于 -70 处 ; 进行后续 PCR 反应时, 我们建议每个反应用 1~4ul 溶解的 DNA, 但是, 如果需要可以每个反应用 10ul; 溶解体积根据后续实验需要可以 <10ul, 但是较小的溶解体积会使收集的 DNA 浓度升高注意 : 括号内黑体字为试剂盒中试剂英文名称! 三 PCR 扩增 (PCR amplification) 5

6 Round 1: ( 外围引物 ) 体系 :2x KAPA mix DNA Primer F Primer R H2O 10ul 1ul 0.5ul 0.5ul up to 20ul 反应条件 : 98 30s 98 10s 52 30s 30cycle 72 45s 72 3min Round 2: ( 内围引物 ) 体系 :2x KAPA mix DNA Primer F Primer R H2O 10ul 1ul 0.5ul 0.5ul up to 20ul 反应条件 : 98 30s 98 10s 52 30s 30cycle 72 45s 72 3min 注意 : 由于后续实验需要较多的 DNA 模板, 可根据需要扩大 PCR 体系四 PCR 产物纯化 ( 天根, 普通 DNA 产物纯化试剂盒 ) 1. 柱平衡步骤 : 向吸附柱 CB2 中 ( 吸附柱放入收集管中 ) 加入 500 μl 的平衡 6

7 液 BL,12,000 rpm(~13,400 g ) 离心 1 min, 倒掉收集管中的废液, 将吸附柱 CB2 重新放回收集管中 ( 请使用当天处理过的柱子 ); 2. 估计 PCR 反应液或酶切反应液的体积, 向其中加入 5 倍体积的结合液 PB, 充分混匀 ( 无需去除石蜡油或矿物油 ) 注意 : 如 PCR 反应体系为 50 μl( 不包括石蜡油体积 ), 则加入 250 μl 结合液 PB 3. 将上一步所得溶液加入一个吸附柱 CB2 中 ( 吸附柱放入收集管中 ), 室温放置 2 min,12,000 rpm (~13,400 g ) 离心 sec, 倒掉收集管中的废液, 将吸附柱 CB2 放入收集管中注意 : 吸附柱容积为 800 μl, 若样品体积大于 800 μl 可分批加入 4. 向吸附柱 CB2 中加入 600 μl 漂洗液 PW( 使用前请先检查是否已加入无水乙醇 ),12,000 rpm(~13,400 g ) 离心 sec, 倒掉收集管中的废液, 将吸附柱 CB2 放入收集管中注意 : 如果纯化的 DNA 是用于盐敏感的实验, 例如平末端连接实验或直接测序, 建议 PW 加入后静置 2-5 min 再离心 5. 重复操作步骤 4 6. 将吸附柱 CB2 放回收集管中,12,000 rpm (~13,400 g ) 离心 2 min, 尽量除去漂洗液将吸附柱 CB2 置于室温放置数分钟, 彻底地晾干, 以防止残留的漂洗液影响下一步的实验注意 : 漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应 ( 酶切 PCR 等 ) 实验 7. 将吸附柱 CB2 放入一个干净的离心管中, 向吸附膜中间位置悬空滴加 μl 洗脱缓冲液 EB, 室温放置 2 min 12,000 rpm (~13,400 g ) 离心 2 min 收集 DNA 溶液注意 : 洗脱液的体积不应少于 30 μl, 体积过少会影响回收的效率洗脱液的 ph 值对于洗脱效率有很大影响若后续做测序, 需使用 ddh 2 O 做洗脱液, 并保证其 ph 值在范围内,pH 值低于 7.0 会降低洗脱效率 ; 且 DNA 产物应保存在 -20, 以防 DNA 降解 DNA 也可以用缓冲液 (10 mm Tris-Cl, ph8.0) 洗脱为了提高 DNA 的回收量, 可将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中, 室温放置 2 min,12,000 rpm(~13,400 g) 离心 2 min, 将 DNA 溶液收集到离心管中 7

8 五焦磷酸测序 Pyrosequencing PCR 产物用 QIAGEN 的焦磷酸测序仪 (PyroMark Q96ID) 进行测序, 获得该基因的甲基化程度数据 8

产品简介本试剂盒采用可以特异性结合核酸的离心吸附柱和独特的缓冲液系统, 样品裂解后, DNA 在高盐条件下与硅胶膜结合, 在低盐高 ph 值时 DNA 从硅胶膜上洗脱下来本试剂盒用于从小剂量的血液干血点血清 / 血浆微量组织漱口水毛发微切割组织等微量样品中提取基因组 DNA, 所得基

产品简介本试剂盒采用可以特异性结合核酸的离心吸附柱和独特的缓冲液系统, 样品裂解后, DNA 在高盐条件下与硅胶膜结合, 在低盐高 ph 值时 DNA 从硅胶膜上洗脱下来本试剂盒用于从小剂量的血液干血点血清 / 血浆微量组织漱口水毛发微切割组织等微量样品中提取基因组 DNA, 所得基 Order: 010-59822688 Toll-free: 800-990-6057 /400-810-6057 TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTD 版本号 : DP121221 TIANamp Micro DNA Kit 微量样品基因组 DNA 提取试剂盒 ( 离心柱型 ) 目录号 :DP316 产品内容产品组成 DP316 (50 preps) 缓冲液 GA(Buffer

复旦大学于文强实验室 protocol DNA 甲基化处理及测定 前言实验材料一 实验材料二 主要设备仪器实验方法一 基因组 DNA 准备 ( 天根血液 / 细胞 / 组织基因组 DNA 提取试剂盒 ) 二 基因组 DNA bisulfite 处理 (zymo research,ez DNA Met

复旦大学于文强实验室 protocol DNA 甲基化处理及测定前言实验材料一实验材料二主要设备仪器实验方法一基因组 DNA 准备 ( 天根血液 / 细胞 / 组织基因组 DNA 提取试剂盒 ) 二基因组 DNA bisulfite 处理 (zymo research,ez DNA Met