HF121-新型广谱植物RNA快速提取试剂盒.doc

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事市鱼
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1 您最好的产品供应商全球性商业合作伙伴选择原平皓收获成功新型广谱植物 RNA 快速提取试剂盒目录号 HF121 使用手册实验室使用, 仅用于体外

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3 新型广谱植物 RNA 快速提取试剂盒目录号 :YPH101 目录编号 HF HF 包装单位 20 次 50 次适用范围 : 适用于快速提取多种植物组织 RNA 试剂盒组成储存稳定性 : 试剂盒组成保存 20 次 50 次 PR Lysis Solution 室温 20 ml 50 ml PR Binding Solution 室温 20 ml 50 ml 漂洗液 WS1 室温 20ml 50ml 漂洗液 WS2(concentrate) 室温 5 ml 15ml 第一次使用前按说明加指定量乙醇 RNase-free H 2O 室温 10 ml 10 ml RNase-free 吸附柱 RA 和收集管室温 20 套 50 套本试剂盒在室温储存 12 个月不影响使用效果 - 1 -

4 储存事项 : 1. 所有的溶液应该是澄清的, 如果环境温度低时溶液可能形成沉淀, 此时不应该直接使用, 可在 37 水浴加热几分钟, 即可恢复澄清 2. 不合适的储存于低温 (4 或者 -20 ) 会造成溶液沉淀, 影响使用效果, 因此运输和储存均在室温下 (15-25 ) 进行 3. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发氧化 PH 值变化, 各溶液使用后应及时盖紧盖子产品描述 : 植物具有丰富的次级代谢许多植物富含多酚或者是单宁酸, 还有一些富含多糖等, 这些次级代谢产物经常会干扰 RNA 的分离纯化以及抑制下游的实验该试剂盒采用独特的化学纯化方法, 能够克服次级代谢产物的干扰独特的裂解液 /β- 巯基乙醇迅速裂解细胞和灭活细胞 RNA 酶, 配方独特的结合液有效的阻止了多糖和基因组 DNA 的结合, 把 RNA 选择性吸附于离心柱内玻璃纤维膜, 再通过两次漂洗液的漂洗, 将细胞代谢物和蛋白等杂质去除, 最后低盐的 RNase free H 2 0 将纯净 RNA 从玻璃纤维膜上洗脱使用该试剂盒可从云杉红枫松树棉花葡萄马铃薯块茎玉米种子以及拟南芥西红柿等植物中分离纯化高质量的总 RNA 该试剂盒通过调整结合液的使用量还可用来分离 micro RNA si RNA t RNA 等产品特点 : 1. 离心吸附柱内玻璃纤维膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜, 柱与柱之间吸附量差异极小, 可重复性好克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端 2. 不需要使用有毒的苯酚, 氯仿等试剂, 也不需要乙醇沉淀等步骤 3. 快速, 简捷, 单个样品操作一般可在 30 分钟内完成 4. 独有的结合液可以有效阻止多糖多酚的干扰 5. 多次柱漂洗确保高纯度,OD 260 /OD 280 典型的比值达 1.9~2.0, 基本无 DNA 残留, 可用于 RT-PCR,Northern-blot 和各种实验 - 2 -

5 注意事项 1. 所有的离心步骤均在室温完成 2. 需要自备乙醇,β- 巯基乙醇, 研钵等 3. PR Lysis Solution 中含有刺激性化合物, 操作时要戴乳胶手套, 避免沾染皮肤, 眼睛和衣服若沾染皮肤眼睛时, 要用大量清水或者生理盐水冲洗 4. 关于 DNA 的微量残留 : 一般说来任何总 RNA 提取试剂在提取过程中无法完全避免 DNA 的微量残留, 该试剂盒由于采取了本公司独特的缓冲体系和选择了特殊吸附能力的吸附膜, 在大多数 RT-PCR 扩增过程中极其微量的 DNA 残留 ( 一般电泳 EB 染色紫外灯下观察不可见 ) 影响不是很大, 如果要进行严格的 mrna 表达量分析如荧光定量 PCR, 我们建议在进行模板和引物的选择时 : 1) 选用跨内含子的引物, 以穿过 mrna 中的连接区, 这样 DNA 就不能作为模板参与扩增反应 2) 选择基因组 DNA 和 cdna 上扩增的产物大小不一样的引物对 3) 将 RNA 提取物用 RNase-free 的 DNase I 处理 4) 在步骤漂洗液 WS1 漂洗前, 直接在吸附柱 RA 上进行 DNase I 处理请联系我们索取具体操作说明书 5. RNA 纯度及浓度检测 : 完整性 : RNA 可用普通琼脂糖凝胶电泳 ( 电泳条件 : 胶浓度 1.2%;0.5 TBE 电泳缓冲液 ;150v,15 分钟 ) 检测完整性由于细胞中 70%-80% 的 RNA 为 rrna, 电泳后 UV 下应能看到非常明显的 rrna 条带动物 rrna 大小分别约为 5 kb 和 2kb, 分别相当于 28S 和 18S rrna 动物 RNA 样品中最大 rrna 亮度应为次大 rrna 亮度的倍, 否则表示 RNA 样品的降解出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解纯度 :OD260/OD280 比值是衡量蛋白质污染程度的指标高质量的 RNA, OD260/OD280 读数 (10mM Tris, ph7.5) 在之间 OD260/OD280 读数受测定所用溶液的 ph 值影响同一个 RNA 样品, 假定在 10mM - 3 -

6 Tris,pH7.5 溶液中测出的 OD260/OD280 读数之间, 在水溶液中所测读数则可能在之间, 但这并不表示 RNA 不纯浓度 : 取一定量的 RNA 提取物, 用 RNase-free 水稀释 n 倍, 用 RNase-free 水将分光光度计调零, 取稀释液进行 OD260, OD280 测定, 按照以下公式进行 RNA 浓度的计算 : 终浓度 (ng/μl)= (OD260) ( 稀释倍数 n) 40 操作步骤 :( 实验前请先阅读注意事项 ) 提示 : 第一次使用前请先在漂洗液 WS2 瓶加入指定量无水乙醇! 操作前在裂解液 PR Lysis Solution 中加入 β- 巯基乙醇至终浓度 1%, 如 1 ml PR Lysis Solution 中加入 10μl β- 巯基乙醇此裂解混合液最好现用现配使用超过一天的裂解混合液可能会降低效果 1. 植物样品的液氮研磨 : a. 取 500μl PR Lysis Solution ( 已经加入 β- 巯基乙醇 ), 转入 1.5ml 离心管中, 混匀备用 b. 液氮中研磨适量植物组织成细粉后, 取 100mg 细粉转入上述装有 PR Lysis Solution 的离心管, 立即用手剧烈振荡 30 秒注 : 对于较难提取的植物材料如柑橘类红枫叶等可能包含油质或胶状物, 起始材料的量不要超过 50mg 2. 在 56 温育 3-5 分钟有助于裂解植物, 但是淀粉含量高的植物不能温育, 因为提高的温度可能导致淀粉膨胀 3. 12,000rpm 离心 5min, 以沉淀不能裂解的细胞残渣一些植物组织如脂质类的储藏组织, 由于会产生粘性的裂解液, 除去细胞残渣离心时间需要长点 4. 吸取上清液到一个干净的 1.5ml 离心管中, 尽量不要碰到细胞残渣假如上清液有一层漂浮的物质, 拨开漂浮物, 把枪头伸到液面下取上清尽量不要取到漂浮物如果必要, 可以再 12,000rpm 离心 2min, 去除残渣 - 4 -

7 5. 由于不同植物组织中水分含量和溶解度差异很大, 根据不同类型的组织有两种方案可供选择方案 1: a. 适用于根茎花果实未成熟的种子水分含量高的叶子或者是任何高水分含量的肉质组织, 这些材料产生较少的核提取物 b. 适用于 RNA 丰度较低以及较难提取的材料柑橘类植物 c. 适用于分离小分子 RNA, 如 micro RNA si RNA t RNA 以及 5S RNA 5a. 取 500μl PR Binding Solution 加入到所得上清液中, 涡旋混匀, 不要离心注 : 假如 RNA 水平预期是低的, 或者是为了获得更多的 micro RNA, 增加 PR Binding Solution 的量为 750μl 如果提取的材料是柑橘类的叶片, 要求增加 PR Binding Solution 的量为 750μl 接操作步骤项下 6 方案 2: 适用于松针正常水分含量的叶子 ( 比如葡萄和西红柿叶子 ) 以及淀粉储藏组织注 : 如果不确定所提植物组织的特性, 采用方案 1. 5b. 取 250μl PR Binding Solution 加入到所得上清液中, 涡旋混匀, 不要离心接操作步骤项下 6 6. 将混合物 ( 每次小于 700μl, 多可以分两次加入 ) 加入一个吸附柱 RA 中,( 吸附柱放入收集管中 )12,000 rpm 离心 60 秒, 弃掉废液 7. 加 500μl 漂洗液 WS1, 室温放置 30 秒,12,000rpm 离心 30 秒, 弃掉废液 8. 加 500μl 漂洗液 WS2( 请先检查是否已加入无水乙醇!),12,000 rpm 离心 30 秒, 弃掉废液 9. 加入 500μl 漂洗液 WS2, 重复一遍将吸附柱 RA 放回空收集管中,12,000 rpm 离心 2 分钟, 尽量除去漂洗液, 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应 10. 取出吸附柱 RA, 放入一个 RNase free 离心管中, 根据预期 RNA 产量在吸附膜的中间部位加 30-50μl RNase free water( 事先在水浴中加热效果更好 ), 室 - 5 -

8 温放置 1 分钟,12,000 rpm 离心 1 分钟 11. 如果预期 RNA 产量 >30μg, 加 30-50μl RNase free water 重复步骤 10, 合并两次洗脱液, 或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍 ( 如果需要 RNA 浓度高 ) 洗脱两遍的 RNA 洗脱液浓度高, 分两次洗脱合并洗脱液的 RNA 产量比前者高 15 30%, 但是浓度要低, 用户根据需要选择 For Research Use Only. Not Intended for any animal or human therapeutic or diagnostic use

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