#K0491, #K0492 批号有效期分析证书根据本说明书提供的方法, 使用 Thermo Scientific GeneJET 质粒中提试剂盒从 250 ml 过夜培养的大肠杆菌 E.coli LB 培养物 (OD 600 =2) 中分离高拷贝的质粒 DNA 当所纯化 DNA 的 A 26

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忘匏韩
5 years ago
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1 产品信息 Thermo Scientific GeneJET 质粒大提试剂盒 #K0491, #K

2 #K0491, #K0492 批号有效期分析证书根据本说明书提供的方法, 使用 Thermo Scientific GeneJET 质粒中提试剂盒从 250 ml 过夜培养的大肠杆菌 E.coli LB 培养物 (OD 600 =2) 中分离高拷贝的质粒 DNA 当所纯化 DNA 的 A 260/280 比值在之间, 且通过琼脂糖凝胶电泳检测到超螺旋质粒 DNA 的条带, 该试剂盒才能通过 QC 的要求纯化 DNA 的功能质量以限制性酶切的方法评估质量授权人 : Jurgita Zilinskiene 2

3 目录页码试剂盒组分... 4 贮存和稳定性... 4 产品介绍... 4 基本原理... 4 重要提示... 5 所需额外试剂和仪器... 5 提纯方法... 7 方法 A: 低速离心法纯化质粒 DNA... 7 方法 B: 高速离心法纯化质粒 DNA... 8 方法 C: 真空法纯化质粒 DNA... 9 问题解决方案安全信息

4 试剂盒组分 GeneJET 质粒大提试剂盒 #K0491 #K preps 25 preps 重悬液 72 ml 180 ml 裂解液 72 ml 180 ml 中和液 72 ml 180 ml 内毒素结合液 9.6 ml 24 ml 漂洗液 Ⅰ( 浓缩 ) 75 ml 180 ml 漂洗液 Ⅱ( 浓缩 ) 75 ml 180 ml RNase A 溶液 ml ml 洗脱液 (10 mm Tris-HCl, ph 8.5) 18 ml 45 ml GeneJET 质粒大提纯化柱, 预装入收集管中 (50 ml) 收集管 (50 ml) 贮存和稳定性将内毒素结合液存储于 4,, 试剂盒其它组分在室温下 (15-25 ) 贮存 RNase A 溶液未打开时, 在室温下是稳定的一旦打开后, 请将其贮存于 -20 重悬液中加入 RNase A 后, 应将重悬液于 4 保存, 可保存 6 个月为了更长时间的储存, 推荐将纯化柱储存于 4 注 : 每次使用后, 请紧密封闭装有 GeneJET 中提纯化柱的包装袋! 若贮存过程中缓冲液里出现沉淀物质, 使用前需在 37 条件下重新溶解, 冷却至室温后再使用产品介绍 GeneJET 质粒大提试剂盒旨在从重组大肠杆菌 E.coli 中大规模的提取高质量的质粒 DNA 试剂盒使用基于硅膜技术的离心柱每个 GeneJET 离心柱可回收多达 750 µg 高拷贝质粒 DNA 纯化的质粒 DNA 可以广泛应用于下游各种分子生物学实验, 如限制性内切酶酶切 PCR 克隆转化自动测序体外转录和强健细胞系的转染基本原理收集的细菌细胞经过重悬, 加入 SDS 碱性裂解液后, 释放出质粒 DNA 中和得到的裂解液, 使得变性的质粒 DNA 重新退火, 而细胞残留物, 如蛋白染色质 DNA 和 SDS 沉淀物析出溶液通过离心除去细胞碎片和 SDS 沉淀物将含有质粒 DNA 的上清加入离心柱裂解液中的高盐浓度为质粒 DNA 结合于离心柱硅膜提供了合适的条件, 吸附于膜上的 DNA 通过漂洗以除去污染物, 之后通过洗脱缓冲液将其洗脱出来 4

5 重要事项缓冲液准备将随试剂盒提供的 RNase A 溶液加入重悬液, 混合均匀加入 RNase A 后, 重悬液可在 4 条件下保存 6 个月如果不经常使用试剂盒, 将重悬液进行分装分装后向其中一个分包装中按照 1 ml 重悬液中加入 40 µl RNase A 的比例加入 RNase A, 得到工作溶液将剩余的 RNase A 贮存于 -20 工作溶液也可以通过向分装的重悬液里加入 RNase A 的方式来配制首次使用时, 按照下面推荐的体积, 向漂洗液 Ⅰ( 浓缩的 ) 中加入异丙醇, 向漂洗液 Ⅱ( 浓缩的 ) 中加入无水乙醇 (96-100%): 10 preps(#k0491) 25 preps(#k0492) 漂洗液 Ⅰ 漂洗液 Ⅱ 漂洗液 Ⅰ 漂洗液 Ⅱ 浓缩的漂洗液 75 ml 75 ml 180 ml 180 ml 异丙醇 25 ml - 60 ml - 乙醇 (96-100%) ml ml 总体积 100 ml 200 ml 240 ml 480 ml 每次使用前检查裂解液和中和液是否发生盐析若出现盐沉淀, 请在 37 下重新溶解, 冷却至 25 时再使用注意不要剧烈摇晃裂解液裂解液和漂洗液 Ⅰ 含有刺激性物质, 当接触皮肤或吸入吞食对人体有害 ( 见第 13 页安全信息 ), 使用时请戴上手套所需额外试剂和仪器移液器和枪头涡旋仪转速可达到 ~20000 rpm(~48000 g) 的离心机, 且转头大小适合离心管转速可达到 2000~5000 g 的水平转头离心机真空管 ( 用于真空法提取 ) 一次性手套乙醇 (96-100%) 异丙醇菌株从各种大肠杆菌 E.coli 菌株 ( 包括 DH10B DH5α XL1-Blue JM109 JM107 TOP10) 均可提取获得高质量的质粒 DNA 培养基本手册中提供的 GeneJET 质粒大提方案适于使用 LB 培养基进行细菌培养, 至细菌浓度约为 2-3(OD 600 =2-3) 不推荐使用富营养生长培养基 5

6 细菌培养从划线平板上挑取单克隆, 培养于含相应抗性的 1-5 ml LB 培养基中在 rpm 摇床中培养约 8 小时将起始培养物用 LB 培养基按 1:1000 到 1:10000 的比例进行稀释, 在 rpm 摇床中培养小时 ( 过夜 ) 用于质粒 DNA 提取的细菌培养物推荐浓度为 2-3 (OD 600 =2-3) 将细菌培养物离心 (5000 g)10 分钟以收集菌体, 去除上清收集的菌体可直接使用或贮存于 -20 培养体积一般来说,250 ml 过夜培养的细菌 LB 培养物足够提取出高产量的高拷贝或低拷贝质粒 DNA 但是, 请注意不要超过推荐的细菌细胞量 ( 培养物体积 OD 600 ), 可能会造成所分离 DNA 的质量下降使用细菌培养物的最大体积可以按如下公式进行计算 : 最大培养物体积 (V), ml = 750/OD 600 表 1 各种质粒的拷贝数高拷贝拷贝每细胞低拷贝拷贝每细胞极低拷贝最多 5 拷贝每细胞 puc vectors pbr322 and derivatives psc101 and derivatives pbluescript vectors pacyc and derivatives pgem vectors ptz vectors pjet vectors 6

7 提纯方法 GeneJET 质粒大提试剂盒提供三种用于质粒 DNA 提纯的优化方案 : 低速离心法 (5000 g) 高速离心法 (48000 g) 和真空提取法方法 A. 低速离心法纯化质粒 DNA 步骤过程按照第 6 页的说明, 培养 250 ml 细菌培养物至其 OD 600 为 2~3 为了得到更好的结果, 请参照第 6 页的培养体积计算出所需 1 培养物的最大体积离心 (5000 g,10 分钟 ) 收集菌体细胞, 弃掉上清将收集的菌体细胞重悬于 6 ml 重悬液中通过涡旋或者移液器吹 2 吸重悬菌体细胞, 直至无残留菌块注 : 确保重悬液中已加入 RNase A 溶液加入 6 ml 裂解液, 轻柔颠倒反应管 4-6 次将其混匀, 直至溶液变得黏稠清亮室温条件下孵育 3 分钟 3 注 : 请勿涡旋混匀, 避免染色质 DNA 断裂孵育时间不要超过 3 分钟, 以避免超螺旋质粒 DNA 的变性 4 加入 6 ml 的中和液, 立即颠倒反应管 5-8 次以混合均匀加入 0.8 ml 内毒素结合液, 立即颠倒反应管 5-8 次以混合均匀室温孵育 5 分钟 5 注 : 加入中和液和内毒素结合液后, 请注意将其轻柔混匀, 以避免细菌细胞碎片的局部沉淀中和后的细菌裂解液浑浊且含有白色沉淀 6 加入 6 ml 96% 乙醇, 立即颠倒反应管 5-6 次进行混匀离心 ( g,40 分钟 ) 以沉淀细胞碎片和染色质 DNA ( 如 7 果需要, 参看第 9 页继续采用真空法提取 ) 注 : 请使用推荐的离心速度将上清转移至 50 ml 反应管 ( 未提供 ) 中, 避免转移白色沉淀或使 8 其浑浊加入 6 ml 96% 乙醇, 立即颠倒反应管 5-6 次进行混匀将部分上清 (~20 ml) 转移至试剂盒提供的纯化柱中请注意不要将纯化柱加样过满使用水平转头 2000 g 离心 3 分钟弃掉流穿 9 液, 将纯化柱放回同一收集管中注 : 使用后请封闭装有纯化柱的包装袋! 10 重复步骤 9 将剩余的上清经纯化柱处理向纯化柱中加入 8 ml 漂洗液 Ⅰ( 按照第 5 页的描述用异丙醇进行 11 稀释 ) 使用水平转头 3000 g 离心 2 分钟弃掉流穿液, 将纯化柱放回同一收集管中向纯化柱中加入 8 ml 漂洗液 Ⅱ( 按照第 5 页的描述用异丙醇进行 12 稀释 ) 使用水平转头 3000 g 离心 2 分钟弃掉流穿液, 将纯化柱放回同一收集管中 7

8 13 使用漂洗液 Ⅱ 重复清洗一次纯化柱 ( 步骤 12) 使用水平转头 3000 g 离心 5 分钟以除去残留的漂洗液, 弃掉含有 14 流穿液的收集管将纯化柱转移至新的 50 ml 收集管中 ( 已提供 ) 向纯化柱膜中心加入 1 ml 洗脱缓冲液室温孵育 2 分钟, 使用水平转头 3000 g 离心 5 分钟以洗脱质粒 DNA 注 : 为了增加所洗脱 DNA 的浓度, 洗脱缓冲液的体积可减少至 ml 但需要注意的是, 洗脱缓冲液体积的减少会降低所洗脱 DNA 的产量若使用洗脱缓冲液 (0.5 ml) 再次进行洗脱 ( 可选 ),DNA 的总回收率可提高 20-30% 6 弃掉纯化柱将纯化的质粒 DNA 用于下游实验或贮存于 -20 方法 B. 高速离心法纯化质粒 DNA 步骤过程按照第 6 页的说明, 培养 250 ml 细菌培养物至其 OD 600 为 2~3 为了得到更好的结果, 请参照第 6 页的培养体积计算出所需 1 培养物的最大体积离心 (5000 g,10 分钟 ) 收集菌体细胞, 弃掉上清将收集的菌体细胞重悬于 6 ml 重悬液中通过涡旋或者移液器吹 2 吸重悬菌体细胞, 直至无残留菌块注 : 如第 3 页的描述, 确保重悬液中已加入 RNase A 溶液加入 6 ml 裂解液, 轻柔颠倒反应管 4-6 次将其混匀, 直至溶液变得黏稠清亮室温条件下孵育 3 分钟 3 注 : 请勿涡旋混匀, 避免染色质 DNA 断裂孵育时间不要超过 3 分钟, 以避免超螺旋质粒 DNA 的变性 4 加入 6 ml 的中和液, 立即颠倒反应管 5-8 次以混合均匀加入 0.8 ml 内毒素结合液, 立即颠倒反应管 5-8 次以混合均匀室温孵育 5 分钟 5 注 : 加入中和液和内毒素结合液后, 请注意将其轻柔混匀, 以避免细菌细胞碎片的局部沉淀中和后的细菌裂解液浑浊且含有白色沉淀离心 (20000 rpm/48000 g,20 分钟 ) 以沉淀细胞碎片和染色质 6 DNA ( 如果需要, 参看第 8 页继续采用真空法提取 ) 注 : 请使用推荐的离心速度将上清转移至 50 ml 反应管 ( 未提供 ) 中, 避免转移白色沉淀或使 7 其浑浊加入 1 体积的 96% 乙醇, 立即颠倒反应管 5-6 次进行混匀 8

9 将部分上清 (~20 ml) 转移至试剂盒提供的纯化柱中请注意不要将纯化柱加样过满使用水平转头 2000 g 离心 3 分钟弃掉流穿 8 液, 将纯化柱放回同一收集管中注 : 使用后请封闭装有纯化柱的包装袋! 9 重复步骤 8 将剩余的上清经纯化柱处理向纯化柱中加入 8 ml 漂洗液 Ⅰ( 按照第 5 页的描述用异丙醇进行 10 稀释 ) 使用水平转头 3000 g 离心 2 分钟弃掉流穿液, 将纯化柱放回同一收集管中向纯化柱中加入 8 ml 漂洗液 Ⅱ( 按照第 5 页的描述用异丙醇进行 11 稀释 ) 使用水平转头 3000 g 离心 2 分钟弃掉流穿液, 将纯化柱放回同一收集管中 12 使用漂洗液 Ⅱ 重复清洗一次纯化柱 ( 步骤 11) 使用水平转头 3000 g 离心 5 分钟以除去残留的漂洗液, 弃掉含有 13 流穿液的收集管将纯化柱转移至新的 50 ml 收集管中 ( 已提供 ) 向纯化柱膜中心加入 1 ml 洗脱缓冲液室温孵育 2 分钟, 使用水平转头 3000 g 离心 5 分钟以洗脱质粒 DNA 注 : 为了增加所洗脱 DNA 的浓度, 洗脱缓冲液的体积可减少至 ml 但需要注意的是, 洗脱缓冲液体积的减少会降低所洗脱 DNA 的产量若使用洗脱缓冲液 (0.5 ml) 再次进行洗脱 ( 可选 ),DNA 的总回收率可提高 20-30% 15 弃掉纯化柱将纯化的质粒 DNA 用于下游实验或贮存于 -20 方法 C. 真空法提取质粒 DNA 步骤过程按照第 7 页方法 A 的步骤 1-8 或第 8 页方法 B 的步骤 1-7, 进行细 1 菌细胞收集裂解和溶解产物澄清步骤按照供应商的说明书准备真空歧管将 GeneJET 质粒中提纯化柱放 2 于歧管上将部分上清 (~20 ml) 转移至纯化柱中请注意不要将纯化柱加样过满使用真空抽吸使溶液流穿纯化柱待溶液完全流穿纯化柱后 3 关闭真空注 : 使用后请封闭装有纯化柱的包装袋! 4 重复步骤 3, 抽吸残留溶液向纯化柱中加入 8 ml 漂洗液 Ⅰ( 按照第 5 页的描述用异丙醇进行 5 稀释 ) 使用真空抽吸使溶液流穿纯化柱待溶液完全流穿纯化柱后关闭真空向纯化柱中加入 8 ml 漂洗液 Ⅱ( 按照第 5 页的描述用异丙醇进行 6 稀释 ) 使用真空抽吸使溶液流穿纯化柱待溶液完全流穿纯化柱后关闭真空 9

10 7 使用漂洗液 Ⅱ 重复清洗一次纯化柱 ( 步骤 6) 为了使纯化柱干燥, 可用真空抽吸 10 分钟, 或将纯化柱转移至一 8 个新的 50 ml 收集管 ( 已提供 ) 中, 使用水平转头 3000 g 离心 5 分钟将纯化柱转移至新的 50 ml 收集管中 ( 已提供 ) 向纯化柱膜中心加入 1 ml 洗脱缓冲液室温孵育 2 分钟, 使用水平转头 3000 g 离心 5 分钟以洗脱质粒 DNA 注 : 为了增加所洗脱 DNA 的浓度, 洗脱缓冲液的体积可减少至 ml 但需要注意的是, 洗脱缓冲液体积的减少会降低所洗脱 DNA 的产量若使用洗脱缓冲液 (0.5 ml) 再次进行洗脱 ( 可选 ),DNA 的总回收率可提高 20-30% 10 弃掉纯化柱将纯化的质粒 DNA 用于下游实验或贮存于

11 问题解决方案问题质粒产量低 A260/280 未达标准基因组 DNA 污染 RNA 污染纯化的质粒中含有多余条带下游酶促反应被抑制体外转录反应产物很少或没有可能的原因及解决方案细菌细胞的不完全裂解裂解之前, 收集的菌体必须充分重悬于重悬液中在加入裂解液之前不应看到菌块存在裂解液使用前应检查其是否出现盐沉淀若发现盐沉淀, 将试剂加热至 37 以重新溶解盐沉淀, 混合均匀并冷却至 25 后再使用不要使用超过推荐的最大菌液量, 参照第 6 页的培养体积漂洗液 Ⅰ 中未加入异丙醇确保使用前向漂洗液 Ⅰ 中加入异丙醇参照第 3 页的说明准备漂洗液 Ⅰ 漂洗液 Ⅱ 中未加入乙醇确保使用前向漂洗液 Ⅱ 中加入乙醇参照第 3 页的说明准备漂洗液 Ⅱ 纯化过程中纯化柱堵塞减少每个纯化柱所处理的细菌培养物体积当向纯化柱中加入溶菌液时, 避免将细胞碎片加入纯化柱中细菌培养体积未经优化使用下面的公式计算最大的细菌培养体积 : 最大培养体积 (V), ml=750/od600 接种细菌太老准备新的起始培养物, 将新分离的单个菌落在含抗生素的生长培养基中培养, 按照第 6 页的细菌培养培养细菌离心速度不合适请确保在纯化过程中使用推荐的离心速度, 严格按照提供的离心方案操作对于实验的成功非常重要质粒 DNA 未经有效纯化减少细菌培养体积, 按照第 6 页细菌培养的推荐量在细菌裂解和中和步骤中, 样本经剧烈涡旋或摇晃为了避免基因组 DNA 污染, 轻柔颠倒离心管 4-8 次以将溶液混匀 ( 步骤 3 和 4) 裂解细胞 ( 步骤 3) 不要超过 3 分钟细菌在 LB 培养基中培养时间不要超过 16 小时可以使用 T7 聚合酶 (#EP0081) 除去所纯化 DNA 中残留的基因组 DNA 首次使用前, 重悬液中未加入 RNase A 参照第 5 页的说明, 确保使用前向重悬液中加入 RNase A 细菌裂解中质粒 DNA 变性相比于超螺旋 DNA, 变性质粒 DNA 迁移率较快变性质粒不适用于接下来的酶切操作, 如限制性酶切为了避免质粒变性, 裂解细胞 ( 步骤 3) 不要超过 3 分钟纯化的质粒 DNA 中含有乙醇洗脱 DNA 前将纯化柱彻底干燥 ( 离心法的第 13 步或真空法的第 14 步 ) 纯化的质粒 DNA 中含有 RNase A 如果纯化的质粒 DNA 用于体外转录, 可使用 GeneJET PCR 纯化试剂盒 (#K0701) 或酚氯仿抽提方法重新纯化线性化的质粒 DNA 11

12 参考文献 1. Birnboim H.C., and Doly, J. (1979) A rapid alkaline lysis procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7, Vogelstein, B. and Gillespie, D. (1979) Preparative and analytical purification of DNA from agarose. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 产品使用限制本产品的开发设计及销售专供研究和体外试验使用本产品不得用于诊断试验或药物开发, 也不适合向人或动物注射了解本产品的材料安全数据表, 请浏览 Thermo Fisher Scientific, 版权所有所有商标均归 Thermo Fisher Scientific 公司或其子公司所有 12

13 安全信息裂解液 C 具有腐蚀性辨别危险的成分标签 : 氢氧化钠风险术语 R34 引起灼伤安全术语 S20 使用时, 不得进食, 饮水 S23 请勿吸入气体 / 烟雾 / 蒸汽 / 喷雾 S26 若溅入眼睛, 立即用大量清水冲洗, 并寻求医生治疗 S36/37/39 穿戴适当的防护服手套和眼睛 / 面保护 S45 发生事故时或感觉不适时, 立即求医 ( 可能时出示标签 ) S60 该物质及其容器必须作为危险废物处置中和液 Xi 有刺激性辨别危险的成分标签 : 乙酸风险术语 R36/38 对眼睛和皮肤具有刺激性安全术语 S23 请勿吸入气体 / 烟雾 / 蒸汽 / 喷雾 S26 若溅入眼睛, 立即用大量清水冲洗, 并寻求医生治疗 S37 戴适当手套 S45 发生事故时或感觉不适时, 立即求医 ( 可能时出示标签 ) S60 该物质及其容器必须作为危险废物处置漂洗液 Ⅰ Xi 有害辨别危险的成分标签 : 盐酸胍风险术语 R22 吞食有害 R36/38 对眼睛和皮肤具有刺激性安全术语 S23 请勿吸入气体 / 烟雾 / 蒸汽 / 喷雾 S26 若溅入眼睛, 立即用大量清水冲洗, 并寻求医生治疗 S36/37 穿戴适当的防护服和手套 S60 该物质及其容器必须作为危险废物处置 13

分析证书根据本说明书第 6 页的提纯方法, 使用 Thermo Scientific GeneJET 质粒小提试剂盒从大肠杆菌 E.coli 中提取 puc19 DNA 所提取 DNA 的质量已通过各种方法得到检测, 包括 DNA 纯度和浓度的分光光度检测琼脂糖凝胶电泳检测 Thermo Sci

分析证书根据本说明书第 6 页的提纯方法, 使用 Thermo Scientific GeneJET 质粒小提试剂盒从大肠杆菌 E.coli 中提取 puc19 DNA 所提取 DNA 的质量已通过各种方法得到检测, 包括 DNA 纯度和浓度的分光光度检测琼脂糖凝胶电泳检测 Thermo Sci 产品信息 Thermo Scientific GeneJET 质粒小提试剂盒 #K0502, #K0503 批号有效期 www.thermoscientific.com/fermentas 1 分析证书根据本说明书第 6 页的提纯方法, 使用 Thermo Scientific GeneJET 质粒小提试剂盒从大肠杆菌 E.coli 中提取 puc19 DNA 所提取 DNA 的质量已通过各种方法得到检测,

#K0491, #K0492 批号 有效期 分析证书 根据本说明书提供的方法, 使用 Thermo Scientific GeneJET 质粒中提试剂盒从 250 ml 过夜培养的大肠杆菌 E.coli LB 培养物 (OD 600 =2) 中分离高拷贝的质粒 DNA 当所纯化 DNA 的 A 26

#K0491, #K0492 批号有效期分析证书根据本说明书提供的方法, 使用 Thermo Scientific GeneJET 质粒中提试剂盒从 250 ml 过夜培养的大肠杆菌 E.coli LB 培养物 (OD 600 =2) 中分离高拷贝的质粒 DNA 当所纯化 DNA 的 A 26