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1 常规操作方法 通往质粒纯化的成功之路 2011 年 11 月 24 日

2 主要内容 质粒的特性 宿主细菌培养 质粒提取方法 质粒 DNA 检测

3 主要内容 质粒的特性 宿主细菌培养 质粒提取方法 质粒 DNA 检测

4 什么是质粒? 生物运载媒介. 质粒 细菌内独立于染色体并能自我复制的小环状 DNA 分子 可以自然编码附加基因, 提供选择性的优势 在生物实验中作为基因或蛋白表达的工具 1952 年由 Lederburg 正式命名. 载体. 质粒可以携带外源基因进入到细菌中. 一个基因载体通常包含以下特征 复制起始点 (ORI) 启动子 多克隆位点 (MCS) 抗生素抗性基因

5 质粒的拷贝数 质粒拷贝数不是固定的 拷贝数主要取决于复制起始点 ORI 受质粒大小影响 也会受到嵌入片断的影响 质粒 复制起始点 拷贝数 类别 puc 载体 pmb 高拷贝数 pbluescript 载体 ColE 高拷贝数 pbr322 载体及其衍生物 pmb 低拷贝数 psc101 载体及其衍生物 psc101 ~5 极低拷贝数 经验法则 : 质粒拷贝数随着质粒片段增大而降低

6 如何选择载体? 克隆载体须具备以下几点要求» 十分适合 DNA 片断嵌入 表达载体的要求» 载体自身的限制酶切点有限, 但多数存在于多克隆位点 (MCS)» 可自身复制» 适合重组蛋白表达和纯化» 具有合适的转录和翻译因子 载体类型 描述 特性 最大嵌入片断 质粒环状双链 DNA 最常用, 便于操作, 种类多样 ~10 kb 噬菌体载体感染细菌的一类病毒 (M13 或 λ) 操作复杂, 价格昂贵 ~25 kb 柯斯质粒 同时具有质粒和 λ 噬菌体的特性 适合较大 DNA 片断嵌入, 操作相对噬菌体载体更方便 ~40 kb BAC 细菌人工染色体适合大片断 DNA 嵌入, 结构稳定, 拷贝数低 ~300 kb 根据下游应用以及嵌入片断大小选择合适的载体

7 主要内容 质粒的特性 宿主细菌培养 质粒提取方法 质粒 DNA 检测

8 细菌培养 : 宿主菌种 质粒制备中最常用到的菌种是大肠杆菌衍生物 E. coli K12, 该菌种专门为适应实验室操作而进行人工构建的, 在实验室外不能存活 高质量菌种 DH1, DH5α, C600, XL1-Blue 低质量菌种 HB101 and derivatives (e.g., TG1 and JM100) JM101, JM110, and HB101 Top10 and derivatives Composition of E. coli (% dry weight) Proteins RNA gdna pdna Lipids Others 如果您的质粒纯化结果不理想, 请考虑更换菌种

9 细菌培养 : 培养基 富养培养基例如 TB 或 2xYT 并不能生产更多的质粒 DNA, 相反 可以引起细菌不完全裂解或者菌体凝结 当纯化柱达到饱和水平后, 多余的质粒 DNA 将随溶液流出 QIAGEN 操作手册是建立在使用标准 LB 培养基的基础上的 标准 LB 培养基的成份表 : Tryptone 10 g/l Yeast extract 5 g/l 可以 NaCl 10 g/l 使用标准培养基或者小量培养可达到更好的质粒提取结果 QIAGEN 质粒制备产品推荐使用菌量大概 3g/l 的干重, 即 1 升 LB 培养基过夜培养大肠杆菌, 所得细菌扩增浓度约 3-4 x 10 9 /ml

10 细菌培养 : 抗生素 细菌培养全程都需要添加抗生素, 防止质粒的丢失 不同的抗生素, 其稳定性有差异, 实验开始前需要选择合适的抗生素 常用的抗生素及储存 工作条件 : 抗生素 储存浓度 工作浓度 ( 稀释比例 ) Ampicillin 50 mg/ml in water 100 µg/ml (1/500) Chloramphenicol 34 mg/ml in ethanol 170 µg/ml (1/200) Kanamycin 10 mg/ml in water 50 µg/ml (1/200) Streptomycin 10 mg/ml in water 50 µg/ml (1/200) Tetracycline 5 mg/ml in ethanol 50 µg/ml (1/100) 制备抗生素储存液时, 按单次使用量分装, 抗生素不可重复使用 培养基在高压灭菌后, 温度冷却到 50 C 以下, 再添加抗生素

11 细菌培养 : 接种 目标细菌繁殖最好从新接种的平板中挑选单菌落进行培养 非新鲜甘油可以导致质粒缺失 非新鲜琼脂平板也可导致质粒丢失或变异 将甘油储存的细菌原液用划线法分散在新鲜制备的琼脂平板上, 随后挑选单菌落进行繁殖培养 单菌落 (CFU) 接种到 2 10 ml 选择性 LB 培养基中, 培养大约 8 小时 当进行液液接种时, 需将原液稀释 500 至 1000 倍 细菌培养液需要持续强力震动 ( 大约 300 rpm)12 至 16 小时, 直至饱和 建议通常在上午进行固液小量接种培养, 随后开始液液大量过夜培养, 第二日上午进行质粒提取

12 细菌培养 : 细菌生长曲线 大肠杆菌通常的生长阶段有 : 迟缓期 (Lag phase) 对数期 (Logarithmic (log) phase) 稳定期 (Stationary phase) 衰亡期 (Phase of decline) 质粒提取最好在由对数期到稳定期过渡期间完成 ( 培养大约 12 至 16 小时后 ), 因为这个时期 : 质粒 DNA 对 RNA 的比例较高 DNA 还未降解 Cell Cell density (OD 600 ) Time (h) Time (h) Growth curve of E. coli in LB medium. Host strain: DH5α; plasmid: puc21. 培养器皿体积要足够大, 至少四倍于所用培养基的体积

13 主要内容 质粒的特性 宿主细菌培养 质粒提取方法 质粒 DNA 检测

14 质粒制备 : 为什么产品会种类繁多? 满足不同规格要求 : 根据产量分类 Mini < 20 µg Maxi < 1 mg Giga < 10 mg 小规格质粒制备适用于克隆和高通量测序实验 大规格质粒制备适用于蛋白表达和细胞培养实验 满足不同质粒纯度要求 : 根据下游应用对质粒纯度的需要 根据下游应用, 选择合适的质粒制备方案

15 质粒 DNA 制备方法 根据您的下游实验需要, 选择适合的质粒提取产品

16 内毒素 细菌内毒素是一种脂多糖 (LPS) 它存在于革兰氏阴性细菌细胞外膜, 带有大量的负电荷 每个革兰氏阴性细菌包含大概 6 百万个 LPS 分子 因其带有负电荷, 它可以同 DNA 一起与质粒纯化树脂相结合 对进行以下实验有毒性作用 转染 基因治疗 DNA 显微注射 基因沉默 对光学密度无影响 在琼脂糖凝胶上不显形 检测方法是 LAL 测试 Schematic diagram of the envelope of E. coli 使用 EndoFree Plasmid Kits 可有效去除内毒素, 适合下游敏感细胞实验应用

17 质粒制备 : 细菌裂解 所有质粒制备方法的第一步是细胞裂解 细胞裂解最常用的方法是碱裂解 细胞裂解的程度决定了 DNA 的产量 因此, 细胞的充分裂解是质粒制备中最关键的一步 充分混合裂解液和细菌样本, 彻底完成碱裂解步骤

18 质粒制备 :LyseBlue LyseBlue 裂解蓝溶液 LyseBlue 裂解蓝溶液可直观观测裂解效果, 防止以下常见操作错误发生 细胞裂解不充分 SDS 细胞碎片和基因组 DNA 不能充分沉淀 A B 当样本中加入裂解液 (Buffer P2), 样本液即刻变蓝 : A 图显示 : 混合完全 B 图显示 : 混合不均 C D 加入中和液 (Buffer P3 或 N3), 样本液转为无色 : C 图显示 : 混合充分 D 图显示 : 混合不均 使用 LyseBlue 可监测并确保实验操作正确进行

19 主要内容 质粒的特性 宿主细菌培养 质粒提取方法 质粒 DNA 检测

20 检测质粒 DNA: 质粒提取的产物有什么? 分光光度计定量分析 : 浓度 [µg/µl] = A 260 x 稀释因子 x 50 µg 1000 µl 浓度乘以洗脱体积可得到质粒 DNA 总量 分光光度计定性分析 : OD 260 /OD 280 = 不能显示是否混有有苯酚,RNA 或者 gdna Standard deviation (%) Mean A 260 value 分光光度计分析法并不是最精确的方法

21 检测质粒 DNA: 质粒 DNA 总量不能被精确检测 分光光度法测量计算所得的质粒 DNA 总量偏高, 因为该方法不能排除 RNA 和 gdna 对其的影响 : QIAprep Spin Mini Competitor S Genomic DNA Plasmid DNA RNA A 260 检测的是所有种类核酸的吸光值 gdna RNA 和质粒 DNA 在此波长下的吸光效应没有差别 为了避免质粒 DNA 产量被错误估算, 最好对质粒 DNA 的纯度进行电泳分析

22 电泳法检测提取的质粒 DNA: 电泳检测结果 质粒 DNA 的构型 : 开环结构 超螺旋 线型 电泳结果示例 : 1 超螺旋和开环结构 2 多聚形式的超螺旋质粒 DNA 3 2# 道质粒的线性结构 4 样品中混有 gdna 5 当样本中混有 gdna 进行限制型酶切后 M Marker: Lambda DNA digested with HindIII 电泳检测可以提供质粒 DNA 质量的相关信息

23 电泳法检测提取的质粒 DNA: 质粒提取流程分析 将 QIAGEN 阴离子交换柱制备的质粒, 进行琼脂糖电泳分析 L F W1 W2 E 裂解清液流出液组分第一次洗脱组分第二次洗脱组分终洗脱产物 M Marker: Lambda DNA digested with HindIII 当质粒提取出现问题时, 可以将不同步骤中的液体样本进行电泳实验分析, 从而找出问题的出处

24 总结 影响质粒制备以及下游应用的成败因素主要有 : 载体的设计 菌种的选择及内毒素影响 培养基 抗生素的选择应用以及接种方法 细菌接种条件 纯化方法及规格 细菌裂解是否充分, 可通过使用 LyseBlue 来提高裂解结果 纯化后质粒 DNA 的分析手段 当您在提取质粒 DNA 时, 综合考量以上因素可以保证您的实验成功进行

25 感谢您的观看! 最新的许可证信息和产品免责声明, 请参见各 QIAGEN 试剂盒操作手册 QIAGEN 试剂盒操作手册和用户手册可在 下载, 或向 QIAGEN 技术支持或当地分销商索取

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