TRIpure Reagent 抽提指南

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娠司马
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1 EASYspin Plus 微量样品 RNA 快速提取试剂盒目录号 RN39 使用手册实验室使用, 仅用于体外

2 EASYspin Plus 微量样品 RNA 快速提取试剂盒目录号 :RN RN39 目录编号包装单位 RN 次适用范围 : 适用于快速提取微量动物细胞微切割组织和易裂解动物组织等样品总 RNA, 使用独有基因组 DNA 清除柱技术确保有效清除 gdna 残留, 不需要使用 DNase 消化,RNA 可直接用于 PCR, 荧光定量 PCR. 试剂盒组成储存稳定性 : 试剂盒组成保存 50 次裂解液 RLT Plus 室温 20 ml 去蛋白液 RW1 室温 40 ml 漂洗液 RW 室温 10ml 第一次使用前按说明加指定量乙醇 RNase-free H2O 室温 10 ml 70% 乙醇室温 9ml RNase-free H2O 第一次使用前按说明加指定量乙醇 Carrier RNA μg 基因组 DNA 清除柱和收集管 RNase-free 吸附柱 RA 和收集管室温 50 套室温 50 套微量研磨杵室温 3 根本试剂盒在室温储存 6 个月不影响使用效果 - 1 -

3 储存事项 : 1. 所有的溶液应该是澄清的, 如果环境温度低时溶液可能形成沉淀, 此时不应该直接使用, 可在 37 水浴加热几分钟, 即可恢复澄清 2. 不合适的储存于低温 (4 或者 -20 ) 会造成溶液沉淀, 影响使用效果, 因此运输和储存均在室温下 (15-25 ) 进行 3. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发氧化 PH 值变化, 各溶液使用后应及时盖紧盖子产品介绍 : 本公司独家推出 EASYspin 无苯酚氯仿 RNA 快速提取技术基础上, 又独家研发成功基因组 DNA 清除柱技术确保有效清除 gdna 残留, 得到的 RNA 不需要 DNase 消化, 可直接用于 PCR 荧光定量 PCR 等实验独特的裂解液迅速裂解微量样品的细胞和灭活细胞 RNA 酶, 然后裂解混合物通过一个基因组 DNA 清除柱, 基因组 DNA 被清除而 RNA 穿透滤过滤过的 RNA 用乙醇调节结合条件后,RNA 在高离序盐状态下选择性吸附于特制离心柱内硅基质膜, 再通过一系列快速的漂洗 - 离心的步骤, 去蛋白液和漂洗液将细胞代谢物, 蛋白等杂质去除, 最后低盐的 RNase free H20 将纯净 RNA 从硅基质膜上洗脱产品特点 : 1. 完全不使用有毒的苯酚, 氯仿等试剂, 也不需要乙醇沉淀等步骤 2. 快速, 简捷, 单个样品操作一般可在 30 分钟内完成 3. 独家研发成功基因组 DNA 清除柱技术确保有效清除 gdna 残留, 得到的 RNA 不需要 DNase 消化, 可直接用于 PCR 荧光定量 PCR 等实验 4. 多次柱漂洗确保高纯度,OD260/OD280 典型的比值达 1.9~2.0, 基本无 DNA 残留, 可用于 RT-PCR,Northern-blot 和各种实验 - 2 -

4 注意事项 1. 所有的离心步骤均在室温完成, 使用转速可以达到 13,000 rpm 的传统台式离心机, 如 Eppendorf 5415C 或者类似离心机 2. 样品处理量绝对不要超过基因组吸附柱 DA 和和 RNA 吸附柱 RA 处理能力, 否则造成 DNA 残留或者产量降低如细胞处理量不超过 5x10 5, 组织不超过 5mg 3. 一般本试剂盒最小处理量可以处理 10 个以上的组织细胞 4. 裂解液 RLT Plus 和去蛋白液 RW1 中含有刺激性化合物, 操作时要戴乳胶手套, 避免沾染皮肤, 眼睛和衣服若沾染皮肤眼睛时, 要用大量清水或者生理盐水冲洗 5. Carrier RNA 储存液的配制 : 在第一次使用 Carrier RNA 时, 将 Carrier RNA(310 μg) 溶解在 1 ml RNase-free H2O 中, 将溶液分装后储存于 -20, 此时该溶液的浓度为 310 μg/ ml(310 ng/μl); 该储存液应避免反复冻融, 冻融次数不能超过 3 次 ( 当处理的细胞量小于 5000 个或者处理组织量小于 10μg 时, 请在裂解液中加入 20ng Carrier RNA ) 6. Carrier RNA 工作溶液的配制 ( 以配制 10 次用量为例 ): 将 5μl Carrier RNA 储存溶液加入 34μl 裂解液 RL 中, 用移液器混匀, 将混匀后的溶液 6μl 加入 54μl 裂解液 RL 中, 此时 Carrier RNA 终浓度为 4 ng/μl, 取 5μl 终浓度为 4 ng/μl 的 Carrier RNA 加入裂解液中 7. 预防 RNase 污染, 应注意以下几方面 : 1) 经常更换新手套因为皮肤经常带有细菌, 可能导致 RNase 污染 2) 使用无 RNase 的塑料制品和枪头避免交叉污染 3) RNA 在裂解液 RLT Plus 中时不会被 RNase 降解但提取后继续处理过程中应使用不含 RNase 的塑料和玻璃器皿玻璃器皿可在 150 烘烤 4 小时, 塑料器皿可在 0.5 M NaOH 中浸泡 10 分钟, 然后用水彻底清洗, 再灭菌, 即可去除 RNase - 3 -

5 4) 配制溶液应使用无 RNase 的水 ( 将水加入到干净的玻璃瓶中, 加入 DEPC 至终浓度 0.1%( v/v),37 放置过夜, 高压灭菌 ) 8. 关于 DNA 的微量残留 : 一般说来任何总 RNA 提取试剂在提取过程中无法完全避免 DNA 的微量残留 (DNase 消化也无法做到 100% 无残留 ), 本公司的 EASYspin Plus RNA 提取产品, 由于采取了本公司独特的缓冲体系和基因组 DNA 清除柱技术, 绝大多数 DNA 已经被清除, 不需要 DNase 消化, 可直接用于反转录 PCR 和荧光定量 PCR 个别特殊情况如 DNA 含量过于丰富造成残留或者要进行严格的 mrna 表达量分析荧光定量 PCR, 我们建议在进行模板和引物的选择时 : 1) 选用跨内含子的引物, 以穿过 mrna 中的连接区, 这样 DNA 就不能作为模板参与扩增反应 2) 选择基因组 DNA 和 cdna 上扩增的产物大小不一样的引物对 3) 将 RNA 提取物用 RNase-free 的 DNase I 处理以提高效果本试剂盒还可以用于 DNase I 处理后的 RNA 清洁 (cleanup), 请联系我们索取具体操作说明书 4) 在步骤去蛋白液 RW1 漂洗前, 直接在吸附柱 RA 上进行 DNase I 处理请联系我们索取具体操作说明书 - 4 -

6 操作步骤 :( 实验前请先阅读注意事项 ) 提示 : 第一次使用前请先在漂洗液 RW 瓶和 70% 乙醇瓶中加入指定量无水乙醇! 如果处理的细胞量小于 5000 个或者处理组织量小于 10μg 时, 匀浆前请在裂解液中加入 20ng Carrier RNA( 按照注意事项 4 和 5 指示 ) 1. 组织培养细胞 a. 收集 <5x10 5 悬浮细胞到一个 1.5ml 离心管, 对于贴壁细胞, 孔板培养可以直接裂解, 细胞瓶培养应该先用胰蛋白酶消化后吹打下来收集 b. 13,000rpm 离心 10 秒 ( 或者 300g 离心 5 分钟 ), 使细胞沉淀下来完全吸弃上清, 留下细胞团, 注意不完全弃上清会稀释裂解液导致产量纯度降低 c. 轻弹管壁将细胞沉淀完全松散重悬, 加 350μl(<5x10 5 细胞 ) 裂解液 RLT Plus, 吹打混匀后用手剧烈振荡 20 秒充分裂解 d. 匀浆 :( 处理细胞量极少时 <1x10 5 一般不需要, 涡旋振荡一分钟匀浆 ) 用带钝针头的一次性 1 ml( 配 0.9mm 针头 ) 注射器抽打裂解物 5-10 次或直到得到满意匀浆结果 ( 或者电动匀浆 30 秒 ), 可以剪切 DNA, 降低粘稠度防堵塞柱子和提高产量 e. 将裂解混合物或匀浆混合物全部加到 DNA 清除柱上 ( 清除柱放在收集管内 ) f. 接操作步骤项下 3 2. 动物组织 ( 例如鼠肝脑 ) a. 电动匀浆 : <5mg 组织加入 350μl 裂解液 RLT Plus 后电动彻底匀浆秒 b. 研磨杵 + 匀浆 :1.5ml 离心管内, 加入 100μl 裂解液 RLT Plus, 加入 <5mg 组织立刻用微量研磨杵研磨匀浆完全补足裂解液 RLT Plus 到 350μl 用带钝针头的一次性 1 ml( 配 0.9mm 针头 ) 注射器抽打裂解物 10 次或直到得到满意匀浆结 - 5 -

7 果 ( 或者电动匀浆 30 秒 ), 可以剪切 DNA, 降低粘稠度防堵塞柱子和提高产量 c. 液氮研磨 + 匀浆 : 在液氮中研磨组织成细粉后, 取适量组织细粉 (<5mg ) 转入装有 350μl 组织裂解液 RLT Plus 的 1.5ml 离心管中, 用手剧烈振荡 20 秒, 充分裂解用带钝针头的一次性 1 ml( 配 0.9mm 针头 ) 注射器抽打裂解物 10 次或直到得到满意匀浆结果 ( 或者电动匀浆 30 秒 ), 可以剪切 DNA, 防堵塞柱子和提高产量 d. 将匀浆后裂解物 13,000rpm 离心 3 分钟, 沉淀可能存在的裂解困难的碎片或者不溶物, 将裂解物上清全部加到 DNA 清除柱上 ( 清除柱放在收集管内 ) e. 接操作步骤项下 ,000 rpm 离心 30 秒, 保留滤过液 (RNA 在滤过液中 ) 4. 用微量移液器较精确估计滤过液体积 ( 通常为 350μl, 滤过时候损失体积应该减去 ), 加入等体积的 70% 乙醇 ( 请先检查是否已加入无水乙醇!), 此时可能出现沉淀, 但是不影响提取过程, 立即吹打混匀, 不要离心 5. 立刻将混合物 ( 每次小于 700μl, 多可以分两次加入 ) 加入一个吸附柱 RA 中,( 吸附柱放入收集管中 )13,000 rpm 离心 30 秒, 弃掉废液 6. 加 700μl 去蛋白液 RW1, 室温放置 1 分钟,12,000rpm 离心 30 秒, 弃掉废液 7. 加入 500μl 漂洗液 RW( 请先检查是否已加入无水乙醇!),12,000 rpm 离心 30 秒, 弃掉废液加入 500μl 漂洗液 RW, 重复一遍 8. 将吸附柱 RA 放回空收集管中,13,000 rpm 离心 2 分钟, 尽量除去漂洗液, 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应 9. 取出吸附柱 RA, 放入一个 RNase free 离心管中, 在吸附膜的中间部位加 15-20μl RNase free water( 事先在水浴中加热可提高产量 ), 室温放置 1 分钟, 12,000 rpm 离心 1 分钟减少洗脱体积可以提高 RNA 浓度, 但是 RNA 产量会降低, 用户根据需要选择 - 6 -

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