HF106-EASYspin全血RNA快速提取试剂盒.doc

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阳贡
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1 您最好的产品供应商全球性商业合作伙伴选择原平皓收获成功 EASYspin 全血 RNA 快速提取试剂盒目录号 HF106 使用手册实验室使用, 仅用于体外

2 感谢您选择和使用原平皓生物的产品我们将陪伴您踏上发现与探索之旅! Thank You for Choosing YPH products Partner to Your Research Exploration!

3 EASYspin 全血 RNA 快速提取试剂盒目录号 :HF106 目录编号 HF HF 包装单位 20 次 50 次适用范围 : 适用于快速提取全血总 RNA 试剂盒组成储存稳定性 : 试剂盒组成保存 20 次 50 次 10X 红细胞裂解液 RLB 室温 10 ml 25 ml 裂解液 RLT 室温 15 ml 30 ml 去蛋白液 RW1 室温 15 ml 40 ml 漂洗液 RW 室温 5 ml 10 ml 第一次使用前按说明加指定量乙醇 RNase-free H 2O 室温 10 ml 10 ml 70% 乙醇室温 4ml RNase-free H 2O 9ml RNase-free H 2O 第一次使用前按说明加指定量乙醇 RNase-free 吸附柱 RA 和收集管室温 20 套 50 套本试剂盒在室温储存 12 个月不影响使用效果 - 1 -

4 储存事项 : 1. 所有的溶液应该是澄清的, 如果环境温度低时溶液可能形成沉淀, 此时不应该直接使用, 可在 37 水浴加热几分钟, 即可恢复澄清 2. 不合适的储存于低温 (4 或者 -20 ) 会造成溶液沉淀, 影响使用效果, 因此运输和储存均在室温下 (15-25 ) 进行 3. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发氧化 ph 值变化, 各溶液使用后应及时盖紧盖子产品介绍 : 红细胞裂解液选择性裂解红细胞, 然后独特的裂解液 /β- 巯基乙醇迅速裂解白细胞和灭活细胞 RNA 酶, 然后用乙醇调节结合条件后,RNA 在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内玻璃纤维膜, 再通过一系列快速的漂洗 - 离心的步骤, 去蛋白液和漂洗液将细胞代谢物, 蛋白等杂质去除, 最后低盐的 RNase free H20 将纯净 RNA 从玻璃纤维膜上洗脱产品特点 : 1. 离心吸附柱内玻璃纤维膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜, 柱与柱之间吸附量差异极小, 可重复性好克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端 2. 不需要使用有毒的苯酚, 氯仿等试剂, 也不需要乙醇沉淀等步骤 3. 反复优化的红细胞裂解液配方, 裂解效果快速完全 4. 快速, 简捷, 单个样品操作一般可在 40 分钟内完成 5. 多次柱漂洗确保高纯度,OD 260 /OD 280 典型的比值达 1.9~2.0, 基本无 DNA 残留, 可用于 RT-PCR,Northern-blot 和各种实验 - 2 -

5 注意事项 1. 第一次使用前请先在漂洗液 RW 瓶和 70% 乙醇瓶中加入指定量乙醇, 加入后请及时打钩标记已加入乙醇, 以免多次加入! 2. 所有的离心步骤均在室温完成, 使用转速可以达到 12,000 rpm 的传统台式离心机 3. 需要自备乙醇, β- 巯基乙醇, 一次性注射器, 研钵 4. 裂解液 RLT 和去蛋白液 RW1 中含有刺激性化合物, 操作时要戴乳胶手套, 避免沾染皮肤, 眼睛和衣服若沾染皮肤眼睛时, 要用大量清水或者生理盐水冲洗 5. 预防 RNase 污染, 应注意以下几方面 : 1) 经常更换新手套因为皮肤经常带有细菌, 可能导致 RNase 污染 2) 使用无 RNase 的塑料制品和枪头避免交叉污染 3) RNA 在裂解液 RLT 中时不会被 RNase 降解但提取后继续处理过程中应使用不含 RNase 的塑料和玻璃器皿玻璃器皿可在 150 烘烤 4 小时, 塑料器皿可在 0.5 M NaOH 中浸泡 10 分钟, 然后用水彻底清洗, 再灭菌, 即可去除 RNase 4) 配制溶液应使用无 RNase 的水 ( 将水加入到干净的玻璃瓶中, 加入 DEPC 至终浓度 0.1%( v/v),37 放置过夜, 高压灭菌 ) 6. 关于 DNA 的微量残留 : 一般说来任何总 RNA 提取试剂在提取过程中无法完全避免 DNA 的微量残留, 本公司的 EASYspin 系列 RNA 提取产品, 由于采取了本公司独特的缓冲体系和选择了特殊吸附能力的吸附膜, 在大多数 RT-PCR 扩增过程中极其微量的 DNA 残留 ( 一般电泳 EB 染色紫外灯下观察不可见 ) 影响不是很大, 如果要进行严格的 mrna 表达量分析如荧光定量 PCR, 我们建议在进行模板和引物的选择时 : 1) 选用跨内含子的引物, 以穿过 mrna 中的连接区, 这样 DNA 就不能作为模板参与扩增反应 2) 选择基因组 DNA 和 cdna 上扩增的产物大小不一样的引物对 3) 将 RNA 提取物用 RNase-free 的 DNase I 处理本试剂盒还可以用于 DNase I 处理后的 RNA 清洁 (cleanup), 请联系我们索取具体操作说明书 4) 在步骤去蛋白液 RW1 漂洗前, 直接在吸附柱 RA 上进行 DNase I 处理请参照附录部分 - 3 -

6 7. RNA 纯度及浓度检测 : 完整性 : RNA 可用普通琼脂糖凝胶电泳 ( 电泳条件 : 胶浓度 1.2%;0.5 TBE 电泳缓冲液 ;150v,15 分钟 ) 检测完整性由于细胞中 70%-80% 的 RNA 为 rrna, 电泳后 UV 下应能看到非常明显的 rrna 条带动物 rrna 大小分别约为 5 kb 和 2kb, 分别相当于 28S 和 18S rrna 动物 RNA 样品中最大 rrna 亮度应为次大 rrna 亮度的倍, 否则表示 RNA 样品的降解出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解纯度 :OD260/OD280 比值是衡量蛋白质污染程度的指标高质量的 RNA, OD260/OD280 读数 (10mMTris, ph7.5) 在之间 OD260/OD280 读数受测定所用溶液的 ph 值影响同一个 RNA 样品, 假定在 10mM Tris,pH7.5 溶液中测出的 OD260/OD280 读数之间, 在水溶液中所测读数则可能在之间, 但这并不表示 RNA 不纯浓度 : 取一定量的 RNA 提取物, 用 RNase-free 水稀释 n 倍, 用 RNase-free 水将分光光度计调零, 取稀释液进行 OD260, OD280 测定, 按照以下公式进行 RNA 浓度的计算 : 终浓度 (ng/μl)= (OD260) ( 稀释倍数 n) 40 操作步骤 :( 实验前请先阅读注意事项 ) 提示 : 第一次使用前请先在漂洗液 RW 瓶和 70% 乙醇瓶中加入指定量无水乙醇! 使用前将 10X 红细胞裂解液 RLB 用 DEPC 处理水稀释到 1X 操作前在裂解液 RLT 中加入 β- 巯基乙醇至终浓度 1%, 如 1 ml RLT 中加入 10μl β- 巯基乙醇此裂解液最好现用现配配好的 RLT 4 可放置一个月 1. 在适合大小的 RNase free 离心管中加入 1 体积 (<1.5 ml) 加入各种抗凝剂新鲜血液 ( 颠倒混匀后 ) 和 3 体积的红细胞裂解液 RLB, 颠倒混匀, 可轻弹管壁, 确保混匀 2. 室温放置 10 分钟 ( 期间应该颠倒轻弹混匀数次帮助裂解红细胞 ) 如果 RNA 降解严重, 可在冰上裂解, 但是时间可长一些以充分裂解 - 4 -

7 3. 12,000 rpm 离心 20 秒, 倒弃红色上清, 并小心的尽可能多的吸弃上清 ( 注意不要吸到管底的细胞团 ), 留下完整的管底白细胞团离心后在管底应该见到白色的白细胞团, 也可能有一些红细胞残片和白细胞团在一起, 但是如果看到的是大部分的红色细胞团, 说明红细胞裂解很不充分, 应该再加入红细胞裂解液重悬细胞团后重复步骤 2,3 上清尽可能的吸弃, 残留过多会稀释裂解液, 造成裂解结合异常, 产量纯度降低 4. 涡旋或者轻弹管壁将白细胞沉淀完全松散重悬, 加入 350μl(<0.5 ml 全血 ) 或者 600μl( ml 全血 ) 裂解液 RLT, 吹打混匀后用手剧烈振荡 20 秒, 充分裂解病人血样中白细胞数量可能大幅增加, 应该适当减少处理量或者按照 350μl (<2x10 6 白细胞 ) 或者 600μl(2x10 6-1x10 7 白细胞 ) 比例加 RTL 5. 用带钝针头的一次性 1 ml( 配 0.9mm 针头 ) 注射器抽打裂解物 5-10 次或直到得到满意匀浆结果 ( 或者电动匀浆 30 秒 ), 可以剪切 DNA, 降低粘稠度和提高产量 6. 较精确估计裂解物体积, 加入等体积的 70% 乙醇 ( 请先检查是否已加入无水乙醇!), 此时可能出现沉淀, 但是不影响提取过程, 立即吹打混匀, 不要离心 7. 将混合物 ( 每次小于 700μl, 多可以分两次加入 ) 加入一个吸附柱 RA 中,( 吸附柱放入收集管中 )12,000 rpm 离心秒, 弃掉废液 8. 加 700μl 去蛋白液 RW1, 室温放置 30 秒,12,000rpm 离心 30 秒, 弃掉废液如果 DNA 残留明显, 可在加入 RW1 后室温放置 5 分钟再离心 9. 加入 500μl 漂洗液 RW( 请先检查是否已加入无水乙醇!),12,000 rpm 离心 30 秒, 弃掉废液加入 500μl 漂洗液 RW, 重复一遍 10. 将吸附柱 RA 放回空收集管中,12,000 rpm 离心 2 分钟, 尽量除去漂洗液, 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应 11. 取出吸附柱 RA, 放入一个 RNase free 离心管中, 根据预期 RNA 产量在吸附膜的中间部位加 30-50μl RNase free water( 事先在水浴中加热效果更好 ), 室温放置 1 分钟,12,000 rpm 离心 1 分钟 12. 如果提取全血 >0.5 ml 或者 >2x10 6 白细胞, 加 30-50μl RNase free water 重复步骤 11, 合并两次洗脱液, 或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍 ( 如果需要 - 5 -

8 RNA 浓度高 ) 洗脱两遍的 RNA 洗脱液浓度高, 分两次洗脱合并洗脱液的 RNA 产量比前者高 15 30%, 但是浓度要低, 用户根据需要选择附基因组 DNA 柱上消化操作步骤 : 一般情况下, 一般说来任何总 RNA 提取试剂在提取过程中无法完全避免 DNA 的微量残留, 本公司的 EASYspin 系列 RNA 提取产品, 由于采取了本公司独特的缓冲体系和选择了特殊吸附能力的吸附膜, 在大多数 RT-PCR 扩增过程中极其微量的 DNA 残留 ( 一般电泳 EB 染色不可见 ) 影响不是很大, 如果要进行严格的 mrna 表达量分析如荧光定量 PCR, 可以购买各种商品化的 RNase free DNase 直接在离心吸附柱子 RA 上面消化 DNA, 然后纯净 RNA 可以洗脱下来直接使用附录 : 以 Qiagen RNase free DNase set 举例 (qiagen 货号 :79254) A:DNase I 储存液的配制 : 将 DNase I 干粉 (1500 Kunitz 单位 ) 溶解在 550μl RNase-free 水中, 轻柔混匀, 分装后 -20 贮存 ( 可保存 9 个月 ) 注意从-20 融化后的 DNase I 储存液保存于 4 ( 可保存 6 周 ), 不要再次冻存 B: DNase I 工作液的配制 : 取 10μl DNase I 储存液加 70μl RDD( 产品中附带 ) 溶液, 轻柔混匀操作步骤 : 1. 前面按照正常步骤操作, 在加入去蛋白液 RW1 步骤前按照以下步骤操作 2. 向吸附柱 RA 中加入 350μl 去蛋白液 RW1,12,000 rpm 离心秒, 弃废液, 将吸附柱放回收集管中 3. 向吸附柱 RA 中央加入 80μl 的 DNase I 工作液, 室温放置 15 分钟 4. 向吸附柱 RA 中加入 350μl 去蛋白液 RW1, 12,000 rpm 离心秒, 弃废液, 将吸附柱放回收集管中 5. 接漂洗液 RW 步骤等后续步骤 For Research Use Only. Not Intended for any animal or human therapeutic or diagnostic use

TRIpure Reagent 抽提指南

TRIpure Reagent 抽提指南 EASYspin Plus 微量样品 RNA 快速提取试剂盒目录号 RN39 使用手册实验室使用, 仅用于体外 EASYspin Plus 微量样品 RNA 快速提取试剂盒目录号 :RN RN39 目录编号包装单位 RN39 3901 50 次适用范围 : 适用于快速提取微量动物细胞微切割组织和易裂解动物组织等样品总 RNA, 使用独有基因组 DNA 清除柱技术确保有效清除 gdna 残留,