FOREGENE PCR Purification Kit Instruction Manual PCR Purification Kit Cat.No.DE-03011/03012/03013 For purification of PCR products:60bp-10kb Research

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1 PCR Purification Kit Cat.No.DE-03011/03012/03013 For purification of PCR products:60bp-10kb Research use only Store at room temperature Copyright Foregene 2014/04. All rights reserved. 1/14

2 目 录 产品介绍 产品特点 试剂盒应用 回收 DNA 片段的应用 DNA 片段的存储 产品质量控制 试剂盒内容 产品信息 储存条件 试剂盒组分信息 注意事项 DNA 回收率 操作前准备事项 实验材料和设备 安全性 操作指南 材料取用说明 胶回收操作步骤 DNA 浓度及纯度测定 操作示意图 问题分析指南 Copyright Foregene 2014/04. All rights reserved. 2/14

3 产品介绍 该试剂盒采用本公司研制的离心柱和配方, 可以从 PCR 体系中高效率的回收高纯度 DNA 片段 该纯化柱能高效的结合 DNA, 搭配独特的配方试剂使得不经过胶回收便可直接去除引物二聚体 试剂盒回收 DNA 片段范围广, 一般条件下可以回收短至 60bp 的 DNA 片段 最小可以使用 30μl 洗脱液, 提高回收 DNA 浓度 试剂盒操作便捷, 步骤少, 只需数次离心即可同时处理多个样品,15 分钟即可获得高纯回收 DNA 片段 产品特点 DNA 回收范围广 : 可以回收短至 60bp, 大到 10kb 的 DNA 片段 回收效率高 : 回收效率一般在 80% 以上, 最高可达 95% 以上 速度快 : 操作简便, 可在 15 分钟内完成 DNA 片段回收且不需胶回收便可直接去除引物二聚体 安全 : 无需有机试剂抽提 质量高 : 回收得到的 DNA 片段纯度高, 能够满足后续各种实验 Copyright Foregene 2014/04. All rights reserved. 3/14

4 试剂盒应用 该试剂盒适用于回收 PCR 产物中 DNA 片段 (60bp-10kb) 回收 DNA 片段的应用 胶回收试剂盒回收获得的 DNA 片段纯度高, 可用于常规分子生物学操作, 如 : 酶切 连接 PCR 测序等实验 DNA 片段的储存 建议使用 Buffer EB 洗脱 DNA 片段, 直接用于下游实验或储存于 -20 产品质量控制 按照福际生物试剂盒质量检测体系标准 ( s Total Quality Management System), 每一批次的 PCR 产物纯化试剂盒都严格进行多次测试, 确保每一批次试剂盒质量的可靠性和稳定性 Copyright Foregene 2014/04. All rights reserved. 4/14

5 试剂盒内容 PCR Purification Kit PCR 产物纯化试剂盒 试剂盒组成 DE DE DE 次 100 次 250 次 Buffer BD* 18ml 36ml 90ml Buffer BD-S 10ml 20ml 50ml Buffer WB1 15ml 30ml 75ml Buffer EB 10ml 20ml 50ml DNA-Only Column 50 个 100 个 250 个 说明书 1 份 1 份 1 份 *:Buffer BD 中含有具刺激性的离液盐, 操作时请注意带上手套和进行相关防护措施 产品信息 型号 离心柱型 纯化组件 Foregene 离心柱 试剂 通量 1-24 个样品 制备时间 ~15min(24 个样品 ) 离心机 台式离心机 纯化柱 DNA 承载量 80μg 离心柱液体盛装量 800μl 最小洗脱体积 30μl PCR 体系 50μl/Prep 回收效率 * 80-95% *:DNA 片段的回收效率与片段大小 PCR 产物初始量 洗脱体系等因素相关 因此, 实际操作中, 回收效率可能比 80-95% 略低 储存条件 本试剂盒在常温 (15 25 ) 干燥条件下, 可保存 12 个月 ; 如需保存更长时间可置于 2 8 注意 : 若低温保存, 溶液容易产生沉淀 在使用前务必将试剂盒内的溶液在室温中放置一段时间, 必要时可在 37 水浴中预热 10 分钟, 以溶解沉淀, 混匀后再使用 Copyright Foregene 2014/04. All rights reserved. 5/14

6 试剂盒组分信息 Buffer BD: 调节 PCR 产物体系, 使 DNA 片段能更好的结合到硅胶膜上 Buffer BD-S: 补充调节 PCR 产物体系, 使大片段的 DNA 能更好的结合到硅胶膜上 Buffer WB1: 去除 DNA 中的残留的盐离子 Buffer EB: 洗脱纯化柱膜上的 DNA DNA-Only Column: 特异吸附 PCR 体系中的 DNA 片段 注意事项 :( 请务必在使用试剂盒前仔细阅读注意事项 ) PCR 结束后, 请尽快进行 PCR 产物纯化, 放置时间越长,DNA 降解越严重 试剂盒使用前, 请务必检查 Buffer BD 中是否按照试剂瓶标签加了异丙醇 试剂盒使用前, 请务必检查 Buffer WB1 中是否按照试剂瓶标签加入了无水乙醇 本试剂盒适用于无选择性的回收溶液中所有的 DNA 片段 ; 如需选择性回收特定片段, 同时去除其他不同大小片段, 请选择胶回收试剂盒 回收率与初始 DNA 量和洗脱体积有关, 初始量越少 洗脱体积越小, 回收率越低 洗脱体积 :Buffer EB 不应少于 30μl, 否则会影响 DNA 回收效率 所有离心步骤均为使用台式离心机常温 (15-25 ) 离心 所有实验步骤均在常温 (15-25 ) 进行 Copyright Foregene 2014/04. All rights reserved. 6/14

7 DNA 回收率 鉴于纯化柱的特性, 对于不同片段的 DNA 其吸附能力以及洗脱效率也不一样, 因此 DNA 回收的效率会有所不同,<10kb 的 DNA 片段回收效率可以达到 80% 以上 ;>10kb 的 DNA 片段, 回收效率相对低下, 请以实际操作为准 下图为从 PCR 体系中回收 225bp DNA 片段对比 : Copyright Foregene 2014/04. All rights reserved. 7/14

8 操作前准备事项 使用本试剂盒前, 请务必仔细阅读说明书 PCR 产物纯化试剂盒操作简单 方便 快 速, 说明书提供了整个试剂盒的正确使用方法 请在使用前准备好必要的实验材料和 设备 实验材料和设备 含有特异扩增 DNA 片段的 PCR 体系 1.5ml 或 2ml 无核酸酶离心管 无水乙醇 异丙醇 Buffer BD 在使用前分别添加 6ml 异丙醇 (DE-03011) 12ml 异丙醇 (DE-03012) 30ml 异丙醇 (DE-03013) 台式离心机 ( 13,400 g) 移液器等 Buffer WB1 在使用前分别添加 60ml 无水乙醇 (DE-03011) 120ml 无水乙醇 (DE-03012) 300ml 无水乙醇 (DE-03013) 安全性 本产品仅供科研使用, 请勿用于医药 临床医疗 食品及化妆品等用途 使用化学品时, 穿戴合适的实验服, 手套, 防护眼镜等 Buffer BD 含有离液盐 : 变性剂, 刺激性 Buffer WB1 含有无水乙醇 : 易燃 Copyright Foregene 2014/04. All rights reserved. 8/14

9 操作指南 请严格按照说明书进行 PCR 产物纯化相关操作 材料取用说明 PCR 结束后, 请尽快进行 PCR 产物纯化操作, 否则 DNA 片段容易降解, 导致纯化到的 DNA 量减少 如果 PCR 结束后, 不立即进行 PCR 产物纯化, 请将其 PCR 产物置于 -20 C 保存, 使用时, 置于常温溶化后再进行相关操作 PCR 产物纯化操作步骤 ( 请严格按照本操作说明进行相关实验操作 ) 使用前请先在 Buffer BD 中加入异丙醇, 加入体积请参照瓶上标签 ; 在 Buffer WB1 中加入无水乙醇, 加入体积请参照瓶上的标签 1. 估计 PCR 反应液的体积, 根据 PCR 产物片段大小按下面情况加入相应体积的 Buffer BD( 已加入相应体积异丙醇 ), 充分混匀 ( 无需去除石蜡油或矿物油 ) a 回收 DNA 片段 <2kb, 加入 4 倍于 PCR 产物体积的 Buffer BD, 充分混匀 b 回收 DNA 片段在 2kb-10kb 之间, 加入 4 倍于 PCR 产物体积的 Buffer BD, 和 1 倍体积的 Buffer BD-S, 充分混匀 c 回收 DNA 片段 >10kb, 加入 4 倍于 PCR 产物体积的 Buffer BD, 和 2 倍体积的 Buffer BD-S, 充分混匀 实例 : 如 PCR 反应体系为 50μl( 不包括石蜡油体积 ): 若回收片段 <2kb, 则加入 200μl Buffer BD( 已加入异丙醇 ), 充分混匀 ; 若回收片段在 2kb-10kb 之间, 则加入 200μl Buffer BD( 已加入异丙醇 ), 再向体系中加入 50μl Buffer BD-S, 充分混匀 ; 若回收片段 >10kbp, 则加入 200μl Buffer BD( 已加入异丙醇 ), 再向体系中加入 100μl Buffer BD-S, 充分混匀 2. 将上一步所得溶液转移至离心柱中 (DNA-Only Column),12,000rpm (~13,400 g ) 离心 1min 弃掉收集管中的废液 注意 : 离心柱容积为 800μl, 若样品体积大于 800μl 可分批加入 3. 向离心柱中加入 700μl Buffer WB1,12,000 rpm (~13,400 g ) 离心 1min, 弃掉收 Copyright Foregene 2014/04. All rights reserved. 9/14

10 集管中的废液 4. 重复步骤 3 一次 5. 将离心柱放回收集管中,12,000 rpm (~13,400 g ) 空管离心 2min, 弃掉离心柱中残余的 Buffer WB1 注意 :Buffer WB1 中乙醇的残留会影响后续的酶反应 ( 酶切 PCR 等 ) 实验 6. 将离心柱移至新的 1.5ml 离心管中, 向硅胶膜中间位置滴加 30-50μl Buffer EB, 于室温放置 2min( 切勿将洗脱液添加到压圈上, 否则会损失较大体积的洗脱液 ), 12,000rpm (~13,400 g ) 离心 1min 收集 DNA 溶液 若回收片段 >10kb, 则在使用前将 Buffer EB 置于 65 预热, 向硅胶模中滴加 30-50μl Buffer EB, 室温放置 5min, 12,000rpm (~13,400 g ) 离心 1min 收集 DNA 溶液 注意 : 为了提高 DNA 的回收效率, 可将离心得到的溶液重新加回离心柱中, 重复步骤 6, 回收片段 >10kb 时, 重复步骤 6 可明显提高回收效率 洗脱体积不应小于 30μl, 体积过少影响回收效率 ; 洗脱液的 ph 值对于洗脱效率有很大影响 DNA 浓度及纯度检测 得到的基因组 DNA 的质量与操作过程中的多种因素有关 DNA 可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度 DNA 的 OD260 值为 1 相当于大约 50μg/ml 双链 DNA DNA 的 OD260/ 如果洗脱时不使用洗脱缓冲液 Buffer EB, 而使用去离子水, 比值会偏低, 因为 ph 值和离子存在会影响光吸收值, 但并不表示纯度低 Copyright Foregene 2014/04. All rights reserved. 10/14

11 操作示意图 Copyright Foregene 2014/04. All rights reserved. 11/14

12 问题分析指南 以下针对 PCR 产物纯化中可能遇到的问题进行分析, 希望能对您的实验有所帮助 另外, 对于在操作说明和问题分析以外的其他实验或技术上的问题, 我们设有专门的技术支持帮助您 如有任何需要可联系我们 : 或 E-mali: 回收不到 DNA 片段或回收效率低 通常会有多种因素影响 PCR 产物回收效率, 比如 :PCR 体系本身 DNA 含量 洗脱体积等 1. PCR 体系中没有目的条带 建议 : 确认用于回收的 PCR 体系中有特异的目的条带 ( 如果不能确定 PCR 体系中是否含有目的条带, 可以取少量 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳分析 ) 2. Buffer BD 加入比例不合适或没有加异丙醇 建议 : 参照试剂瓶上的标签所示的体积加入相应的异丙醇, 且操作过程中按照操作说明在 PCR 产物体系中添加正确体积比例的 Buffer BD, 并充分混匀 3. DNA 片段 2kb 时回收率较低 建议 : 按照操作说明书中步骤, 在 PCR 产物体系中添加正确体积的 Buffer BD-S 4. Buffer WB1 中忘记添加无水乙醇 建议 : 参照说明书或试剂瓶上标签在 Buffer WB1 中添加正确体积的无水乙醇并混匀 5. 洗脱液添加不正确 建议 : 确认 Buffer EB 或 ddh 2 O 滴加到了纯化柱膜中间位置 ; 尤其是进行小体积洗脱的时候, 一定要确定洗脱液滴加的位置正确, 否则会导致无法回收到 DNA 6. 洗脱液使用不正确 建议 : 有些特殊需求的实验需要使用纯水洗脱, 请确定洗脱液的 ph 在 之间, 否则将很大程度上影响洗脱效率 回收的 DNA 影响下游实验 1. 洗脱下来的 DNA 片段中盐离子浓度过高 建议 : 结合 DNA 片段的纯化柱在加入 700μl Buffer WB1 后, 在室温放置 5min 再离心, 以便能彻底的去除盐离子 Copyright Foregene 2014/04. All rights reserved. 12/14

13 2. 洗脱下来的 DNA 片段中含有乙醇残留 建议 :Buffer WB1 洗涤纯化柱后,12,000rpm (~13,400 g ) 空管离心 2min 一定不能省略 ; 如果还有乙醇残留可以将纯化柱在室温放置 2-5min 再进行洗脱或者以 13,400rpm (~17,000 g ) 离心 2min Copyright Foregene 2014/04. All rights reserved. 13/14

14 中国 福际 World s Foregene 成都福际生物技术有限公司电话 : , info@foregene.com Copyright Foregene 2014/04. All rights reserved. 14/14

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