TRIpure Reagent 抽提指南

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享严
5 years ago
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1 大型 / 大量质粒提取试剂盒目录号 PL14 使用手册实验室使用, 仅用于体外

2 大型 / 大量质粒提取试剂盒目录号 :PL14 目录编号包装单位 PL 次适用范围 : 适用于大规模质粒制备和 BAC/PAC 大型质粒制备试剂盒组成储存稳定性 : 试剂盒组成保存 20 次 RNaseA (10mg/ml 10mg/ml) ml 溶液 P ml 溶液 P2 室温 100 ml 溶液 PⅢ 室温 110 ml 杂质清除剂 A 室温 3 ml 杂质清除剂 B 室温 30 ml 内毒素清除剂 ml 本试剂盒在室温储存 18 个月不影响使用效果 - 1 -

3 储存事项 : 1. 第一次使用时, 将试剂盒所带全部的 RNase A 加入溶液 P1 后 ( 终浓度 100μg /ml) 置于 4 保存如果溶液 P1 中 RNase A 失活, 提取的质粒可能会混杂有微量 RNA 残留, 在溶液 P1 中补加 RNase A 即可 2. 内毒素清除剂在 4 可保存一个月, 如果要长期保存, 建议保存在 -20! 3. 环境温度低时溶液 P2 中 SDS 可能会析出出现浑浊或者沉淀, 可在 37 水浴加热几分钟, 即可恢复澄清, 不要剧烈摇晃, 以免形成过量的泡沫 4. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发氧化 ph 值变化, 各溶液使用后应及时盖紧盖子产品介绍 : 本试剂盒用碱裂解法从培养菌中提取质粒 DNA, 采用独特的溶液配方和内毒素清除试剂, 只需要几次简单离心去除蛋白质多糖内毒素 RNA 等杂质, 获得高质量的质粒 DNA 纯化 DNA 的 OD260/280 通常在 1.8 左右, 得到的质粒可直接应用于细胞转染甚至动物体内实验等对 DNA 纯度要求很高的工作中纯化后期过程均在 Eppendorf 管中操作, 方法简单, 不需特殊设备, 无需过柱, 不用酚氯仿抽提 ; 基本可完全回收细菌裂解释放出的质粒, 不必担心质粒 DNA 的丢失本方法提取纯化质粒 DNA, 对质粒损伤小, 即使是 10kb 甚至 100kb 以上的大型质粒或超大型 BAC/PAC 质粒, 只要碱裂解法能够提取, 就可以有效纯化可选择任意小体积溶解质粒, 浓度可高达 3μg/μl 产品特点 : 1. 不需要使用有毒的苯酚, 氯仿等试剂, 也不需要乙醇沉淀快速方便从 ml 大肠杆菌 LB((Luria-Bertani) 培养液中, 可快速提取 0.4-1mg 纯净的高拷贝质粒 - 2 -

4 DNA, 提取率达 % 2. 获得的质粒产量高, 超螺旋比例高, 纯度好, 可直接用于酶切转化 PCR 体外转录测序等各种分子生物学实验 3. 内毒素含量极低 (<10 EU/μg DNA), 可直接应用于细胞转染注意事项 1. 提取的质粒量与细菌培养浓度质粒拷贝数等因素有关如果所提质粒为低拷贝质粒或大于 10kb 的大质粒, 应加大菌体使用量, 同时按比例增加 P1 P2 PⅢ 的用量 2. 提取大质粒时操作动作要轻柔, 应该使用剪大了开口的吸头, 防止机械剪切对 DNA 的损坏 3. DNA 沉淀液沉淀离心后, 可能看不到明显沉淀如未见沉淀, 担心 DNA 丢失, 可保留上清液, 待完成全部操作后电泳鉴定, 以确定是否获得终产物 ( 数百微克 DNA 离心沉淀在管的侧壁上, 可能无法看到明显团块 ) 4. 得到的质粒 DNA 可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度 OD260 值为 1 相当于大约 50μg/ml DNA 电泳可能为单一条带, 也可能为 2 条或者多条 DNA 条带, 这主要是不同程度的超螺旋构象质粒泳动位置不一造成, 与提取物培养时间长短提取时操作剧烈程度等有关本公司产品正常操作情况下基本超螺旋可以超过 95% 5. 质粒 DNA 确切分子大小, 必须酶切线性化后, 对比 DNA 分子量 Marker 才可以知道处于环状或者超螺旋状态的质粒, 泳动位置不确定, 无法通过电泳知道确切大小 - 3 -

5 操作步骤 :( 实验前请先阅读注意事项 ) 提示 : 将 RNase A 全部加入溶液 P1 中, 混匀, 使用后置于 2-8 保存 1. 取过夜培养菌 150 ml 左右菌液 ( 最大不超过 180ml-200ml), 装入合适的离心瓶中,10,000 x g 于 4 离心 2 min 沉淀菌体, 完全弃除上清 2. 加入 5 ml 溶液 P1, 充分混悬震荡菌体沉淀, 使其完全分散开, 至无絮块存在细菌悬液移入 50 ml 离心管中, 室温放置 3~5 min 如果有未彻底混匀的菌块, 会影响裂解, 导致提取量和纯度偏低 3. 加入 5 ml 溶液 P2, 轻轻颠倒离心管 6~8 次, 室温放置 5 min, 使细菌完全裂解, 溶液透明温和地混合, 不要剧烈震荡, 以免基因组 DNA 剪切断裂! 所用时不应超过 5 分钟! 以免质粒受到破坏此时菌液应变得清亮粘稠, 如果菌体少, 很快清亮粘稠后就可以做下一步, 不是一定要准确的 5 分钟如果未变得清亮, 可能由于菌体过多, 裂解不彻底, 应减少菌体量 4. 加 5 ml 溶液 PⅢ, 立即颠倒离心管 6~8 次, 充分混匀, 至白色絮状物产生上述裂解液于 4 12,000~16,000 x g 离心 10~15 min, 小心吸出上清, 移入新的 50 ml 离心管中加入溶液 PⅢ 后应该立即混匀, 以免产生 SDS 的局部沉淀, 如果上清中还有微小白色沉淀, 可再次离心后取上清 5. 加入 10 ml 异丙醇, 颠倒离心管, 充分混匀 6. 于 4 12,000~16,000 x g 离心 10 min, 小心弃去上清, 倒置轻轻沥干残余液体, 加入 3-5ml 70% 乙醇漂洗一遍, 最高速离心 5 分钟, 弃上清, 晾干沉淀 DNA 沉淀如果干燥过头,DNA 将无法完全溶解, 但是如果乙醇没有晾干挥发干净, 残留太多, 也会造成 DNA 无法完全溶解 - 4 -

6 7. 加入 1.4 ml 溶液 P1 完全溶解沉淀团块 ( 可用宽口吸管轻轻吹打辅助溶解 ) 移入新的 1.5 ml 离心管中 8. 最高速离心 2 分钟, 取上清转入 2 个新的 1.5 ml 离心管中 ( 每个 700μl) 每管加入 55μl 杂质清除液 A, 颠倒充分混匀 9. 加入约 0.1 体积 ( 约 80μl) 冰预冷的内毒素清除剂到, 颠倒旋转 7-10 次 (30 秒左右 ) 充分混匀, 冰浴或者冰上放置 >=5 分钟, 中间偶尔颠倒混匀几次内毒素清除剂加入上清后, 上清会变得浑浊, 但是冰浴后应恢复清亮水浴, 溶液又会变为浑浊, 颠倒混匀后 42 温育 5 分钟 11. 室温 16,000 x g 离心 5 min 分相 ( 温度低时, 内毒素清除剂无法分相, 因此必须至少 20 C 以上室温离心 ) 12. 溶液必须分为上下两相, 否则应重复步骤上层水相含 DNA, 下层蓝色油状相含内毒素和其它杂质将含 DNA 的上层水相转移到新管 ( 注意不要吸到蓝色油状层, 里面含内毒素等杂质 ), 弃油状层 13. 将上一步所得上层水相中加入等体积杂质清除液 B( 约 750μl), 轻柔混匀,4 16,000 x g 离心 10 min, 弃上清 ( 注意不要丢失 DNA), 轻轻加入 1 ml 70% 乙醇洗涤, 离心弃上清, 共两次, 室温倒置晾干 5~10 min 使乙醇完全挥发 14. 加适量 TE 或者纯水 (200~400μl) 溶解沉淀 ( 可在 37 水浴中振荡以辅助溶解 ) 要注意很多质粒 DNA 可能附着在离心管侧壁上, 即使看不见, 也应该充分吹打侧壁溶解回收质粒 DNA - 5 -

TRIpure Reagent 抽提指南

TRIpure Reagent 抽提指南中量质粒提取试剂盒目录号 PL08 使用手册实验室使用, 仅用于体外中量质粒提取试剂盒目录号 :PL08 目录编号 PL0801 PL0802 包装 20 次 40 次适用范围 : 适用于高纯质粒中量制备和 BAC/PAC 大型质粒中量制备, 可用于转染试剂盒组成储存稳定性 : 试剂盒组成保存 20 次 40 次 RNaseA (10mg/ml 10mg/ml) -20 0.75 ml