LipoFiterTM

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句献常
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1 LipoFiter TM 产品编号产品名称规格 HB-TRLF-200 HB-TRLF-1000 HB-TRLF-5000 LipoFiter TM 脂质体转染试剂 200ul 1ml 5ml 保存条件 :4 保存, 一年有效 -20 保存, 三至五年有效, 反复冻融不影响产品质量 LipoFiter TM 简介 LipoFiter TM 脂质体转染试剂 ( LipoFiter TM Liposomal Transfection Reagent ) 是一种适合于把质粒或其它形式的核酸, 以及核酸蛋白复合物转染到培养的真核细胞中的高效阳离子脂质体转染试剂 LipoFiter TM 优点 1 转染效率高, 重复性好, 操作简单 2 无明显细胞毒性, 抗血清干扰等, 用 LipoFiter TM 转染细胞后, 对于大多数细胞,72 小时内不更换培养液无明显细胞毒性使用 LipoFiter TM 转染时血清的存在不影响转染效率, 这样可以减小去除血清对细胞的损伤 1

2 3 LipoFiter TM 对于贴壁细胞和悬浮细胞都适用, 并且可以用于稳定表达细胞株的筛选 LipoFiter TM 使用说明 1. 细胞培养 : 以六孔板为例, 在转染前一天 (20-24 小时 ) 把约细胞 ( 具体的细胞数量据细胞大小和细胞生长速度而定 ) 培养到六孔板内, 使第二天细胞汇合度 (confluent) 能达到约 50%~70% 注 1: 汉恒生物 LipoFiter TM 对细胞毒性极小, 因此无需通过增大细胞汇合度来抵抗转染试剂毒性, 我们实验证明,50%~70% confluent 时细胞的转染效率可以达到最优注 2: 其它培养板或培养皿参考六孔板进行操作, 各种培养介质如培养板, 培养皿的详细细胞接种数目推荐各种培养介质下 LipoFiter TM 转染前细胞接种数量级详表 2. 在进行下述转染步骤前, 把六孔板每孔内换成新鲜的细胞培养液培养液的体积约为 2ml 注 : 其他培养介质培养液体积参见各种培养介质下 LipoFiter TM 转染 DNA 详表, 血清抗生素 Glutamine 等对 LipoFiter TM 转染并无影响 3. 把 LipoFiter TM 脂质体转染试剂轻轻混匀 4. 对于待转染的六孔板中一个孔的细胞, 取一只洁净无菌离心管, 加入 4μg 质粒 DNA( 其他培养介质 DNA 用量参见附表 ) 及适量 DMEM 溶液, 用枪轻轻吹打混匀, 终体积 250μl 注 : 其他培养介质培养液体积参见各种培养介质下 LipoFiter TM 转染 DNA 详表, 如后续实验需要, 可将 DMEM 用其他如 1640 MEM F12 等培养基代替, 2

3 对 LipoFiter TM 转染效率及操作并无影响 5. 取另一只洁净无菌离心管, 加入 238μl DMEM 溶液, 再加入 12 μl LipoFiter TM ( 其他培养介质 LipoFiter TM 用量参见附表 ), 用枪轻轻吹打混匀, 终体积 250μl, 室温放置 5 分钟 6. 将步骤 4 与 5 中的 DNA 溶液与 LipoFiter TM 溶液混合, 用枪轻轻吹打混匀注意 : 不可 Vortex 或离心 7. 室温孵育 20 分钟有可能出现絮状沉淀物, 属正常现象, 不会影响转染效率 8. 无论是贴壁细胞还是悬浮细胞, 均把 500μl LipoFiter TM -DNA 混合物全部加入六孔板的一个孔内加入时注意尽量均匀加入到整个孔内, 随后轻轻 8 字摇摆混匀注 : 针对贴壁细胞, 如上述所说, 只需将 LipoFiter TM -DNA 复合物加入细胞中孵育 6 小时再换液即可若是转染悬浮或半悬浮细胞, 则推荐通过平角离心转染法, 即将适量的 LipoFiter TM -DNA 复合物加入细胞培养皿后 ( 步骤 8), 封口膜封好, 放入平角离心机, 低速 (500g-1000g/min) 离心 1.5h, 然后放入培养箱中正常培养 6 小时再换液即可 9. 细胞培养箱内培养 6 小时后, 去除含有 LipoFiter TM -DNA 的培养液每孔加入 2ml 新鲜细胞培养液继续培养注 : 通常 LipoFiter TM -DNA 混合物和细胞一起孵育 6 小时已经足够产生较高的转染效率大多数细胞和 LipoFiter TM -DNA 一起培养长达 72 小时未见明显细胞毒性但转染后 6 小时更换新鲜培养液对于一些生长非常快速的细胞有助于提高转染效率对一些比较易于转染的细胞如 HEK293T 细胞, 换液可视细胞生长状况而定, 无需为提高转染效率而换液 3

4 10. 转染后续处理 1) 对于基因表达, 再培养小时后即可检测转染效果, 如转染带 GFP 或者其他荧光基因的表达载体, 可用荧光显微镜观测细胞转染效率 2) 用于筛选稳定表达细胞株, 则在转染后 24 小时即可加入适当的筛选药物, 例如 G418 或 Puromycin( 嘌呤霉素 ) 等, 进行稳定表达细胞株的筛选注 1: 对于六孔板中一个孔的细胞,DNA 用量可以在 1.6~4μg 的范围内进行适当调节, 而 LipoFiter TM 的用量则是相对固定的, 即用什么样的孔板, 孔板中的装培养液的体积如果固定, 比如 6 孔板是 2ml, 则 LipoFiter TM 的用量是 12ul 一般保持不变最佳的转染条件, 因具体的细胞和培养条件而定, 可以在上述推荐范围内自行优化转染条件对于多个孔转染相同数量相同质粒的情况可以把每个孔所需的 LipoFiter TM 和 DNA 混合物配置在一个离心管内, 后续混匀孵育等步骤后可以分加到各个孔内注 2: 对于其它培养板或培养器皿, 各种试剂的用量可以参考各种培养介质下 LipoFiter TM 转染 DNA 详表进行换算 4

5 各种培养介质下 LipoFiter TM 转染前细胞接种数量级详表类型 ( 培养皿 / 培养板 ) 汇合度 =100% 接种细胞数 ( 转染 24 小时前 ) ( 即 confluent=100%) 24 小时后达到汇合 24 小时后达到汇合 24 小时后达到汇合时的细胞数度 90%~100% 度 70%~80% 度 50%~60% 96-well (3~4) 10 4 (1.5~2) 10 4 (1.2~1.6) 10 4 (0.9~1.2) well (0.6~1) 10 5 (0.3~0.5) 10 5 (0.25~0.4) 10 5 (0.18~0.3) well (1.5~2) 10 5 (0.8~1) 10 5 (0.65~0.8) 10 5 (0.5~0.6) well (4~5) 10 5 (2~2.5) 10 5 (1.6~2) 10 5 (1.2~1.5) well (1~1.2) 10 6 (0.5~0.6) 10 6 (0.4~0.5) 10 6 (0.3~0.36) mm (1.8~2.6) 10 6 (0.9~1.4) 10 6 (0.7~1.1) 10 6 (0.55~0.85) mm (0.7~1.2) 10 7 (0.4~0.7) 10 7 (0.32~0.55) 10 7 (0.24~0.42) 10 7 LipoFiter TM 推荐不推荐推荐推荐各种培养介质下 LipoFiter TM 转染 DNA 详表类型表面积对应细胞培养溶剂 DMEM ( 培养皿 / 培养板 ) /cm 2 液体积对应体积 /µl DNA LipoFiter TM 96-well 0.3cm 2 100µl 2 x 25 µl 0.2 µg 0.6 µl 48-well 0.8cm 2 350µl 2 x 37.5 µl 0.5 µg 1.6 µl 24-well 2cm 2 500µl 2 x 50 µl 0.8 µg 2.4 µl 12-well 4cm 2 1ml 2 x 100 µl 1.6 µg 5 µl 6-well 10cm 2 2ml 2 x 250 µl 4.0 µg 12 µl 60mm 20cm 2 4ml 2 x 0.5 ml 8.0 µg 24 µl 100mm 60cm 2 12ml 2 x 1ml 24 µg 72 µl 注 1: 对于六孔板中一个孔的细胞,DNA 用量可以在 1.6~4μg 的范围内进行适当调节, 而 LipoFiter TM 的用量则是相对固定的, 即用什么样的孔板, 孔板中的装培养液的体积如果固定, 比如 6 孔板是 2ml, 则 LipoFiter TM 的用量则是 12ul 一般保持不变 5

6 细胞毒性比较我们通过对 293T 细胞和 Hela 细胞加入不同浓度的 LipoFiter TM 和某进口主流转染试剂 Lipo xxx, 进行细胞毒性检测, 发现 Lipo xxx 对细胞的毒性远远高于 LipoFiter TM, 同一株细胞, 用 LipoFiter TM 转染后的存活率远远高于用 Lipo xxx 转染后的存活率 6

7 转染效果 7

注意事项 1. 使用高纯度的 DNA(A260/A280 比值越近 1.8 越好 ) 有助于获得较高的转染效率对于质粒, 推荐使用 Qiagen 公司生产的质粒大量抽提试剂盒进行高质量无内毒素抽提 2. 转染前细胞必须处于良好的生长状态 3. 需自备 DMEM 培养基, 其他培养基如 1640 MEM alpha-mem, F12,DMEM/F12 M199 也均可以用于转染实验 4.

8 注意事项 1. 使用高纯度的 DNA(A260/A280 比值越近 1.8 越好 ) 有助于获得较高的转染效率对于质粒, 推荐使用 Qiagen 公司生产的质粒大量抽提试剂盒进行高质量无内毒素抽提 2. 转染前细胞必须处于良好的生长状态 3. 需自备 DMEM 培养基, 其他培养基如 1640 MEM alpha-mem, F12,DMEM/F12 M199 也均可以用于转染实验 4. LipoFiter TM 不能 vortex 或离心, 宜缓慢晃动混匀 5. LipoFiter TM 使用后请立即盖好盖子, 避免长时间暴露在空气中, 影响转染效率 6. 经测试,LipoFiter TM 细胞毒性不明显, 非常适用于病毒包装 ( 腺病毒, 慢病毒, 逆转录病毒等 ); 请在进行病毒包装时严格按照病毒安全操作进行关于病毒安全操作可参考汉恒生物 - 病毒载体操作安全手册或来电来信和我们的病毒技术工程师沟通, 您还可以扫描加微信和我们技术工程师就技术上进一步沟通 7. 为了您的安全和健康, 请在符合洁净度要求的细胞培养室中进行转染操作, 操作时请穿实验服并戴一次性手套口罩和无菌帽 8

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材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽