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1 第 39 卷第 1 期 2016 年 3 月南京师大学报 ( 自然科学版 ) JOURNAL OF NANJING NORMAL UNIVERSITY(Natural Science Edition) Vol. 39 No. 1 Mar,2016 doi: /j.issn Blf-ADT 对 HeLa 细胞的抑制作用及其机制的研究王倩 *, 潘望, 李伟 *, 肖志一, 潘黎黎, 绪广林 ( 南京师范大学生命科学学院, 江苏省分子医学与生物技术重点实验室, 江苏南京 ) [ 摘要 ] 研究 Blf-ADT( 布洛芬硫化氢供体物 ) 的抗肿瘤作用, 并对其机制作初步探讨. 通过形态学观察噻唑蓝 (MTT) 比色实验集落形成实验测定 HeLa 细胞的增殖能力 ; 细胞划痕实验测定 HeLa 细胞的迁移能力 ;Annexin V- FITC/PI 双染流式细胞仪测定 HeLa 细胞的凋亡率 ;Western blotting 检测细胞凋亡相关蛋白 (Bcl-2 Bax Erk P38 和 Procaspase-3 等 ) 的表达. 结果显示,Blf-ADT 能呈浓度或时间依赖性抑制细胞增殖减少细胞集落的形成, 降低细胞的迁移能力, 同时能显著提高 HeLa 细胞的凋亡率, 影响细胞凋亡相关蛋白 (Bcl-2 Bax Erk P38 和 Procaspase-3 等 ) 的表达.Blf-ADT 对人宫颈癌 HeLa 细胞的生长有显著的抑制作用, 对治疗宫颈癌具有潜在的临床应用价值. [ 关键词 ] HeLa,Blf-ADT, 细胞增殖, 细胞凋亡, 抗肿瘤作用 [ 中图分类号 ]Q4 [ 文献标志码 ]A [ 文章编号 ] (2016) Study on Anti-Tumor Activity and Mechanisms of Blf-ADT Wang Qian,Pan Wang,Li Wei,Xiao Zhiyi,Pan Lili,Xu Guanglin (School of Life Sciences,Nanjing Normal University,Jiangsu Province Key Laboratory for Molecular and Medical Biotechnology,Nanjing ,China) Abstract:The purpose of this study was to observe the activity and mechanisms of a new compound Blf-ADT on HeLa cells. The effects of Blf-ADT on Hela cells was investigated by morphological observation,mtt assay and colony forma tion assay,respectively. Wound healing assay was used to detect the effect of Blf-ADT on the migration of HeLa cells. Meanwhile,the activities of Blf-ADT on apoptosis was measured by Flow cytometry. Furthermore,Western blot was per formed to investigate the expressions of related proteins in HeLa cell line treated with Blf-ADT. As a result,we found that Blf-ADT could inhibit cell proliferation and reduce cell migration in a dose-and time-dependent manner. In addi tion,blf- ADT could significantly increase the rate of apoptosis and affect the expression of apoptosis- related proteins. Taken together,the data indicate that Blf-ADT can significantly inhibit the growth of HeLa cells and have potential clini cal value for treatment of cervical cancer. Key words:hela,blf-adt,cell proliferation,cell apoptosis,anti-tumor effect 宫颈癌 (Cancer of cervix) 是女性最常见的对健康最具危害性的恶性肿瘤之一, 世界范围内每年 [1] 新增的病例中, 有 80% 发生在发展中国家, 已经成为发展中国家妇女死亡的主要原因. 近年来, 我国宫颈癌发病年龄有年轻化的趋势, 因此进行宫颈癌的发病机制及药物治疗的研发具有十分重要的临 [2] 床价值. 非甾体抗炎药 NSAIDs(Non-steroidal anti-inflammatory drugs), 是一类不含有甾体结构的抗炎镇痛药. 近年来, 各种临床及实验研究显示, 长期有效地服用 NSAIDs 能够降低肿瘤的发生率. 本课题组利用化学拼合原理合成了一种新型的具有抗炎作用的化合物 Blf-ADT, 前期研究显示其具有良好的抗炎作用, 但其抗肿瘤作用还不清楚, 因此本文将以 HeLa 细胞为作用对象对 Blf-ADT 的抗肿瘤作用及机制作进一步研究. 收稿日期 : 基金项目 : 教育部留学回国人员科研启动基金资助项目 ( 教外司留 [2015]311 号 ) 南京师范大学留学回国人员启动基金项目. 通讯联系人 : 绪广林, 副教授, 研究方向 : 气体信号分子供体物的抗炎及抗肿瘤作用. xudunlop@126.com *:Wei Li and Qian Wang made equal contribution to the paper

2 南京师大学报 ( 自然科学版 ) 第 39 卷第 1 期 (2016 年 ) 1 材料与方法 1.1 药品和试剂 Blf-ADT 由本实验室自行合成提供, 分子结构式如图 1 所示. 高糖 DMEM(Dulbecco s Modified Eagle Medium) Trypsin 溶液和青链霉素双抗购自美国 Invitrogen 公司 ; 胎牛血清 FBS 购自杭州四季青有限公司 ; DMSO 购自美国 Amersco 公司 ;MTT 购自 Sigma Company(US); 多聚甲醛 Giemsa 染液 TEMED 和 Tween-20 均购自北京 solarbio 科技有限公司 ;Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒购自 Vazyme Company(US); 实验用抗体 (Bax,bcl-2,p38,p-p38,ERK,p-ERK,procaspase-3,COX-2 和 β-actin 一抗 ) 购自美国 Cell Signaling; 二抗均购自 Bioworld Technology;X-ray 胶片等购于南京丁贝生物技术有限公司 ;ECL 化学发光液购于北京普利莱基因技术有限公司 ; 其他试剂如甲醇等均为国产分析纯. 1.2 细胞株及其培养人宫颈癌细胞株 HeLa 细胞购自中科院上海细胞所. 细胞置于含 5% CO 2 的 37 培养箱中, 用含 10% 胎牛血清及 100 μg ml 1 青霉素 100 μg ml 1 链霉素的 DMEM 培养基培养. 用 0.25% 胰酶 -EDTA 消化传代,2 d~3 d 传代一次. 1.3 细胞形态学观察取指数生长期细胞, 制成单细胞悬液, 调整细胞浓度为 /ml, 接种于 6 孔板, 分别用 50 mmol L -1 的 Blf-ADT 和 100 mmol L -1 的布洛芬进行处理, 继续培养 48 h 后, 与溶剂对照组细胞在倒置显微镜下观察其细胞形态, 数码相机拍照. 1.4 MTT 检测取指数生长期细胞, 制成单细胞悬液, 细胞浓度调整为 /ml. 每孔细胞悬液 100 ml, 接种于 96 孔培养板常规培养. 药物处理终浓度分别为 10 mmol L mmol L mmol L mmol L -1 的 Blf-ADT 和 100 mmol L -1 的布洛芬, 同时设置含 0.1% DMSO 的完全培养液作为溶剂对照组, 分别常规培养 24 h 48 h 72 h. 全自动酶标仪上 570 nm 处测定吸光度 (A) 值. 按公式计算药物作用后培养细胞的抑制率 : 相对细胞生长抑制率 (%)=[( 溶剂对照组 OD 值 - 实验组 OD 值 )/ 溶剂对照孔 OD 值 ] 100%. 1.5 集落形成实验取指数生长期细胞, 制成单细胞悬液, 细胞浓度调整为 /ml. 每孔细胞悬液 2 ml, 接种于 24 孔培养板常规培养. 药物处理终浓度分别为 25 mmol L mmol L mmol L -1 的 Blf-ADT 和 100 mmol L -1 的布洛芬, 同时设置含 0.1% DMSO 的完全培养液作为溶剂对照组. 分别常规培养 24 h 48 h 72 h 后, 将培养液换成含 20% 胎牛血清的 DMEM 培养液, 继续培养 7 d~10 d. 无水甲醇固定 5 min, 姬姆萨染色液染色 10 min, 冲洗掉多余的染料, 室温干燥计数. 按公式计算培养细胞抑制率 : 抑制率 (%)=[( 对照组克隆数 - 实验组克隆数 )/ 对照组克隆数 ] 100%. 1.6 细胞划痕实验不同终浓度的 Blf-ADT 处理培养细胞, 待细胞生长至单层铺满孔内底部时, 用 20 μl 的枪头在孔内底部中央划一条直线. 用无菌 PBS 溶液缓慢冲洗, 再加入无血清培养液. 常规培养 24 h 后显微镜下观察拍照. 1.7 流式细胞仪检测凋亡率不同终浓度的 Blf-ADT 处理细胞 48 h 后, 收集细胞,1 000 r min -1 离心 3 min 弃上清,PBS 冲洗 3 次, 每管加入 100 μl 1 Binding Buffer 重悬细胞, 并将细胞浓度调整为 /ml, 再加入 5 μl Annexin V-FITC 5 μl PI 和 400 μl 1 Binding Buffer, 轻轻混匀,1 h 内样品用流式细胞仪检测. 激发波长为 488 nm. 用 CellQuest 软件对实验数据进行分析, 绘制散点图. [3] 1.8 Western blotting 检测凋亡相关蛋白的表达细胞总蛋白提取 Blf-ADT 处理细胞 48 h 后, 提取细胞总蛋白,-70 冷冻保存. 采用 BCA 法, 以一定浓度梯度的 BSA 溶液为标准, 于 570 nm 处测定吸光度值, 绘制标准曲线, 同时测定样品的吸光度值, 计算蛋白含量 Fig.1 图 1 Blf-ADT 的分子结构式 Molecular structure of Blf-ADT

王 1.8.2 倩等 Blf-ADT 对 HeLa 细胞的抑制作用及其机制的研究 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳及蛋白电转移各取含相同浓度蛋白的细胞裂解上清液与 5 SDS 上样缓冲液 250 mmol L-1 Tris-HCl ph 6.8 10% SDS 500 mmol L-1 DTT 50% 甘油 0.

3 免疫杂交检测靶蛋白将 PVDF 膜放入含 5% 脱脂奶粉的 TBST 0.1% Tween-20 10 mmol L 1 Tris-Cl ph 7.5 150 mmol L 1 NaCl 缓冲液常温下摇床震荡封闭 3 h. 封闭结束后用 1 PBST 溶液摇床震荡洗膜 4 次每次 15 min.

在暗室中利用 ECL 化学杂交方法曝光胶片以显示对应的目的蛋白条带. 1.9 统计学处理结果数据用(x±s)表示数据分析采用 Student s t-test. 2 结果 2.

MTT 检测结果显示图 3A 用 10 mmol L-1 25 mmol L-1 50 mmol L-1 100 mmol L-1 的 Blf-ADT 分别处理细胞 24 h 48 h 72 h 后具有明显的增殖抑制作用呈剂量依赖且随时间增加作用增强 P<0.05.

2 细胞形态学观察 Cell morphology changes were observed when treated with 100 μmol L-1 Blf-ADT and 100 μmol L-1 ibuprofen A The effects of Blf-ADT on viability of HeLa cells.

3 王倩等 Blf-ADT 对 HeLa 细胞的抑制作用及其机制的研究 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳及蛋白电转移各取含相同浓度蛋白的细胞裂解上清液与 5 SDS 上样缓冲液 250 mmol L-1 Tris-HCl ph % SDS 500 mmol L-1 DTT 50% 甘油 0.5% 溴酚蓝混合后 100 水浴煮 5 min. 冷却后上样蛋白上样量为 60 μg~120 μg 70 V 浓缩胶或 90 V 分离胶电泳. 将分离胶与提前处理好的 PVDF 膜采用汉堡包法叠加固定在 35 V 130 ma 参数下电泳分离 2.5 h 使目的蛋白转移到 PVDF 膜上免疫杂交检测靶蛋白将 PVDF 膜放入含 5% 脱脂奶粉的 TBST 0.1% Tween mmol L 1 Tris-Cl ph mmol L 1 NaCl 缓冲液常温下摇床震荡封闭 3 h. 封闭结束后用 1 PBST 溶液摇床震荡洗膜 4 次每次 15 min. 洗膜结束后将 PVDF 膜放入稀释的一抗溶液中 4 滚动孵育 16 h 左右. 1 PBST 溶液洗膜 3 次每次 15 min. 然后放入对应的辣根过氧化物酶 HRP 标记的二抗溶液中 4 滚动孵育 8 h 左右. 最后 1 PBST 溶液摇床震荡洗膜 3 次每次 15 min. 在暗室中利用 ECL 化学杂交方法曝光胶片以显示对应的目的蛋白条带. 1.9 统计学处理结果数据用(x±s)表示数据分析采用 Student s t-test. 2 结果 2.1 Blf-ADT 对 HeLa 细胞生长的影响光镜下可见图 2 未经 Blf-ADT 处理的溶剂对照组细胞形态呈几何多边形细胞之间紧密生长界限清晰. 经过 50 mmol L-1 Blf-ADT 处理后的细胞大多数皱缩成椭圆形或者圆形布洛芬处理组与溶剂对照组细胞形态接近. MTT 检测结果显示图 3A 用 10 mmol L-1 25 mmol L-1 50 mmol L mmol L-1 的 Blf-ADT 分别处理细胞 24 h 48 h 72 h 后具有明显的增殖抑制作用呈剂量依赖且随时间增加作用增强 P< mmol/l 的布洛芬对细胞增殖的抑制作用效果低于 25 mmol L-1 50 mmol L mmol L-1 的 Blf-ADT. A Ctrl B 100 μmol L-1 Blf-ADT C 100 μmol L-1 ibuprofen 图2 Fig.2 细胞形态学观察 Cell morphology changes were observed when treated with 100 μmol L-1 Blf-ADT and 100 μmol L-1 ibuprofen A The effects of Blf-ADT on viability of HeLa cells. HeLa cells were treated with Blf-ADT ) μmol L-1 and 100 μmol L-1 ibuprofen respectively for 24 h 48 h and 72 h. Cell viability was detected by MTT. B The effects of Blf-ADT on colony formation on HeLa cells. n=3 *P<0.05 **P<0.01 ***P<0.001 vs control group Cont. 图3 Fig.3 Blf-ADT 对 HeLa 细胞增殖的影响 Effects of Blf-ADT on proliferation of HeLa cell

第 39 卷第 1 期 2016 年南京师大学报自然科学版集落形成实验结果显示用 25 mmol L-1 50

Blf-ADT 处理后细胞向划痕损伤处迁移速度均显著慢于溶剂对照组图 4 即细胞迁移能力呈不同程度的降低 100

mmol L-1 ibuprofen 24 h C0 25 mmol L-1 Blf-ADT 0 h C1 25 mmol

Blf-ADT 24 h E0 100 mmol L-1 Blf-ADT 0 h E1 100 mmol L-1

3 Blf-ADT 对 HeLa 细胞迁移能力的影响 Cell migration changes were observed

Blf-ADT n=3 Blf-ADT 对 HeLa 细胞凋亡的影响流式细胞仪检测结果显示培养 48

27% 25 mmol L- 1 50 mmol L-1 100 mmol L-1 的 Blf-ADT 处理组凋亡率分别为

4 第 39 卷第 1 期 2016 年南京师大学报自然科学版集落形成实验结果显示用 25 mmol L-1 50 mmol L mmol L-1 的 Blf-ADT 分别处理 HeLa 细胞 24 h 48 h 72 h 后具有明显的增殖抑制作用呈时间剂量依赖性图 3B P< mmol L-1 布洛芬的抑制作用均弱于 25 mmol L-1 50 mmol L mmol L-1 的 Blf-ADT. 2.2 Blf-ADT 对 HeLa 细胞迁移能力的影响细胞划痕实验结果显示经过 100 mmol L-1 布洛芬和不同浓度的 Blf-ADT 处理后细胞向划痕损伤处迁移速度均显著慢于溶剂对照组图 4 即细胞迁移能力呈不同程度的降低 100 mmol L-1 的 Blf-ADT 处理组划痕损伤基本无愈合现象表明 Blf-ADT 能有效抑制 HeLa 细胞的体外迁移能力. A0 Ctrl 0 h A1 Ctrl 24 h B0 100 mmol L-1 ibuprofen 0 h B1 100 mmol L-1 ibuprofen 24 h C0 25 mmol L-1 Blf-ADT 0 h C1 25 mmol L-1 Blf-ADT 24 h D0 50 mol L-1 mblf-adt 0 h D1 50 mmol L-1 Blf-ADT 24 h E0 100 mmol L-1 Blf-ADT 0 h E1 100 mmol L-1 Blf-ADT 24 h 图4 Fig Blf-ADT 对 HeLa 细胞迁移能力的影响 Cell migration changes were observed after HeLa cells treated with different concentrations of Blf-ADT n=3 Blf-ADT 对 HeLa 细胞凋亡的影响流式细胞仪检测结果显示培养 48 h 后溶剂对照组的凋亡率 UL + UR 为 4.27% 25 mmol L mmol L mmol L-1 的 Blf-ADT 处理组凋亡率分别为 12.34% 21.17% 64.22% 见图 5. 由此可见 Blf-ADT 处理 HeLa 细胞后会引起凋亡率提高在本实验使用剂量范围内与药物浓度呈正相关. 而 100 mmol L-1 布洛芬组效果较弱凋亡率为 15.96%. A Ctrl B 25 μmol L-1 Blf-AD c 50 μmol L-1 Blf-ADT d 100 μmol L-1 Blf-AD e 100 μmol L-1 ibuprofen 图5 Fig Blf-ADT 对 HeLa 细胞凋亡的影响 Effects of Blf-ADT on apoptosis of HeLa cells

5 王倩, 等 :Blf-ADT 对 HeLa 细胞的抑制作用及其机制的研究 2.4 Blf-ADT 对 HeLa 细胞凋亡相关蛋白的影响本实验以不同浓度 Blf-ADT 和 100 mmol/l 的布洛芬处理细胞 48 h 后,Western Blotting 检测发现, 随着药物处理浓度增高,COX-2 Bcl-2 和 procaspase-3 表达量显著降低,Bax 表达量无变化 ;p38 和 Erk p- Erk 的表达量无变化, 而 p-p38 和 p-erk1/2 表达量降低 ( 图 6). A:Ctrl;B:100 mmol L -1 ibuprofen;c:10 mmol L -1 Blf-ADT;D:25 mmol L -1 Blf-ADT;E:50 mmol L -1 Blf-ADT;F:100 mmol L -1 Blf-ADT 图 6 Western blot 检测 HeLa 细胞中凋亡相关蛋白的表达变化 Fig.6 The changes of apoptosis proteins in HeLa cells by Western blotting analysis 3 讨论宫颈癌 (Cancer of cervix) 是全球女性中最常见的恶性肿瘤之一, 其发病率在全世界范围内居女性恶性 [4] 肿瘤第二位, 仅次于乳腺癌, 而在发展中国家和地区则位居第一位. 据统计, 每年全世界新增病例有 45.9 万, 其中我国就有万, 占全球发病人数的 1/3 [5]. 宫颈癌对女性的身体健康产生了严重的威胁. 与其他恶性肿瘤相比, 宫颈癌是可以预防的癌症, 因为其具有明确的致病因素和较长的可逆转的癌前病变期. 很多研究已经证实, 炎症是一个明确可以导致肿瘤的危险因素. 非甾体抗炎药 (NSAIDs) 主要通过阻断前列腺素 (PGs) 合成的机制实现抗炎解热镇痛等作用. 近年来研究的热点集中在 NSAIDs 的抗肿瘤作用和机制上, 并取得了一定进展.COX 是 PGs 合成的重要限速酶, 至少存在 COX-1 COX-2 两种同工酶, 近年来研究表明,COX-2 催化产生的 PGs 除了介导炎症疼痛等外, 还与某些肿瘤尤其是消化道肿瘤的发生密切相关.NSAIDs 通过多方面的机制来抑制肿瘤, 可作用于多个靶点, 环氧化酶 -2(COX-2) 是其中之一. 由此可见,NASIDs 的抗炎和抗肿瘤作用存在一定的内在联系,NASIDs 的抑瘤作用体现在肿瘤发生过程的各个环节, 如通过多条信号传导通路抑制 COX-2 活性抑制肿瘤血管形成促进肿瘤细胞凋亡等. Blf-ADT 是本课题组利用化学拼合原理合成的一种新型的具有抗炎作用的化合物. 在本研究中, 分别从细胞增殖迁移能力细胞凋亡细胞凋亡相关蛋白几个方面, 探讨了新型非甾体抗炎药 Blf-ADT 对人宫颈癌 HeLa 细胞株的影响. MTT 检测和平板克隆形成实验分析结果表明,Blf-ADT 对 HeLa 细胞有显著的抑制作用, 呈剂量和时间依赖性. 此外, 对细胞增殖的抑制作用还表现在细胞形态学方面 ( 图 2). 肿瘤细胞重要的生物学特征之一就是侵袭转移. 本实验细胞划痕损伤实验结果表明, 在同一时间范围内, 随着药物处理浓度增加, 细胞损伤愈合能力逐渐减弱, 提示药物能明显抑制细胞迁移能力. 为了进一步探讨 Blf-ADT 对 Hela 细胞增殖的抑制作用是否由细胞凋亡引起, 本研究利用流式细胞仪检测了 Blf-ADT 处理细胞后的凋亡变化. 结果表明, 随着 Blf-ADT 处理浓度增加, 早期凋亡和晚期凋亡的细胞数目明显增多, 说明 Blf-ADT 能诱导其凋亡, 且呈剂量依赖性. 肿瘤细胞另一主要特征是抗凋亡, 因 [6] 此诱导肿瘤细胞凋亡已成为治疗肿瘤的一个重要方向. 根据功能和结构的不同, 将 Bcl-2 基因家族分成两类 :(1) 促凋亡基因 (pro-apoptotic), 如 bax bak bad bid bim 等 ;(2) 抗凋亡基因 (anti-apoptotic), 如 Bcl-2 [7] Bcl-xL Bcl-w mcl-1 等. 在调控凋亡的过程中, 起关键性作用的是 Bcl-2 和 Bax 表达量比例. 有研究表 [8] 明,Bcl-2 蛋白表达量下降 Bax 蛋白表达量无变化, 两者异二聚体比率降低, 会促进肿瘤细胞凋亡. 同

6 南京师大学报 ( 自然科学版 ) 第 39 卷第 1 期 (2016 年 ) [9] 时,Bcl-2 蛋白家族能调控线粒体凋亡途径主要蛋白酶 caspase-3 活性. 为了进一步研究 Blf-ADT 诱导细胞凋亡是否和这些蛋白相关, 作者利用 Western Blot 技术检测了细胞凋亡相关蛋白 Bcl-2 Bax procaspase- 3 表达量. 结果表明,Bcl-2/Bax 比值显著降低. 此外,Blf-ADT 作用后, 未活化的 procaspase-3 表达量随着药物浓度增高而降低, 则由此推测活化的 caspase-3 有所增加. 上述研究结果表明,Blf-ADT 通过降低 Bcl- 2/Bax 比值, 增加 caspase-3 活性, 从而诱发 Hela 细胞凋亡. [10] MAPK 途径相关蛋白被认为是细胞凋亡信号的重要介质. 绝大多数细胞中都存在 MAPK 途径, 信号从胞外传递到胞内,MAPK 可促进血管内皮细胞增殖和新血管生成, 刺激引起细胞增殖分化转化以及凋亡. 哺乳动物机体中已经发现 5 种不同的 MAPK 信号转导通路. 其中 Erk1/2 信号转导通路调控细胞生长和分化,p38MAPK 信号转导通路在炎症与细胞凋亡等应激反应中发挥重要作用. 为此, 本实验研究了 Erk1/2( 磷酸化和非磷酸化 ) 和 p38( 磷酸化和非磷酸化 )MAPK 激酶信号传导通路在 Blf-ADT 处理的 Hela 细胞凋亡中的变化. 实验数据表明, 随着药物浓度的增高,p-Erk1/2,p-p38 和 Cox-2 表达量有所下降, 而 Erk1/2 和 p38 表达量无变化 ( 图 5). 由此推测,Blf-ADT 可能是通过影响 MAPK 信号转导通路 Erk 和 P38 的表达来影响 Cox-2 的表达, 从而诱发 Hela 细胞凋亡. 综上所述, 表明 Blf-ADT 对 HeLa 细胞具有显著的增殖抑制作用, 主要与影响凋亡相关蛋白 COX-2 的表达以及 MAPK 信号通路有关.Blf-ADT 可能对宫颈癌治疗具有潜在的临床应用价值. [ 参考文献 ] [1] LI X Y,WANG X. The role of human cervical cancer oncogene in cancer progression[j]. Int J Clin Exp Med,2015,15: [2] 卢秀娥. 宫颈癌及癌前病变筛查现状及其研究进展 [J]. 中国社区医师,2013,15:9. [3] SAMBROOK J. Molecular cloning:a laboratory manual[m]. Beijing:Science Press,2008. [4] SCHIFFMAN M H,BRINTON L A. The epidemiology of cervical carcinogenesis[j]. Cancer,2006,76: [5] PANKIN D M,PISAN I P,FERLAY J. Estinates of the worldwide incidence of 25 major cancers[j]. Int Cancer,2007,80: [6] ABBOTT R G,FORREST S,PIENTA K J. Simulating the hallmarks of cancer[j]. Artif Life,2006,12: [7] ADAMS J M,CORY S. The Bcl-2 protein family:arbiters of cell survival[j]. Science,1998,281(5 381): [8] 徐美华, 张桂英, 谢兆霞, 等. 吲哚美辛对结肠癌细胞 CDK2 CDK4 P21WAF/CIP1 Bcl-2 及 Bax 蛋白表达的影响 [J]. 中化杂志,2002,22: [9] DEVERAUX Q L,REED J C. IAP family proteins-suppressors of apoptosis[j]. Genes Dev,1999,13: [10] UEHLING D E,HARRIS P A. Recent progress on MAP kinase pathway inhibitors[j]. Bioorg Med Chem Lett,2015,25: [ 责任编辑 : 黄敏 ]

12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL

12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL ( )2017 57 5JournalofNanchangUniversity(MedicalSciences)2017,Vol.57No.5 11 LY294002, (, 330006) : LY294002 PI3K/AKT 0 10 15 20 25 30μmol L -1 LY294002(LY294002 ) A549,PBS CCK8 LY294002 A549 ; Westernblot