# 西安交通大学学报 医学版 第 卷 +,,"##-#&//&"&&# -#"# /&#&&/-"$)**###- &$#&$)**#-" "##& $)**# # "- +,,&#""# ##& ( ) ### (### $)**# ## /##0# ##, 我国肝癌 ","+!+**,- 发病率

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1 第 卷第 期 年 月 西安交通大学学报 医学版!"#$## %&'& & 临床研究 在肝癌中的表达及其对预后的影响 王亚婷 何彩霞 卢振辉 王 琦 杨少奇 李 洋 # 宁夏医科大学 宁夏银川 $# 宁夏医科大学总医院肝胆外科 宁夏医科大学总医院消化内科 宁夏银川 $## 宁夏吴忠新区医院 宁夏银川 $ 摘要 目的 检测人类婆罗双树样基因 #%&''# 在肝癌中的表达情况 探讨 %&''# 表达与原发性肝细胞癌 患者预后的相关性 方法 应用免疫组织化学法检测 例石蜡 标本及其中 例癌旁组织标本 %&''# 蛋白的表达 分析其与 患者临床病理学资料及预后的关系 采用荧光定量 (")"* +, 法 分别检测 例新鲜 及癌旁肝组织中 %&''#-.& 和蛋白的相对含量 结果 组织中 %&''# 蛋白的表达率 /0 #1 显著高于癌旁组织 $0 差异有统计学意义 #/#%&''# 蛋白在 中的表达与甲胎蛋白水平有关 $%&''# 高表达和低表达组患者的平均生存时间分别为 #$ 个月 %&''# 高表达组患者的 年生存率 $10$$0 显著低于 %&''# 低表达组 年生存率 1$0 /$0 $##$ 肝癌及癌旁组织的 %&''#-.& 的相对量分别为 #// 两组比较差异有统计学意义 /#(")"* +, 检测结果显示 %&''# 蛋白在 中的相对量为 $# 癌旁组织中几乎不表达 结论 %&''# 表达与肝癌患者预后密切相关 可作为肝癌患者判断预后的预测指标 关键词 肝癌 %&''# 基因 免疫组织化学 (")"* +, 实时荧光定量 中图分类号 $ 文献标志码 & $!"#!$##$ %"#&'&## (&. 2 3 '45"! (&. 6 &.%,7 '82 #.29"+4 :"*)! $#;"*-",",+*%!*2"* ""*+,)+,.29"+4 :"*)! $#;"*-", )*,""*,+,2""*+,)+,.29"+4 :"*)! $# #(!, 2." ;)*,)+! $ (### $)**# ### +,, " - +,,&.##"-""#$)**##+,,# "##"###&/"$)**# - ### " " +,,&!-## 0# ## 1," /-""# $)**#" #"+,, -"##& $)**# /&#1 +,,- ##&$-#"# #/&#&& $)**# +,, -#" - )1 &$& $)**# "- $)**# -&&"#&$& # &! $&1" $$& $)**# - # -- 1$&/$& $&##&$&$)**#') 收稿日期 $# 修回日期 $ 基金项目 宁夏回族自治区对外科技合作项目 $" #,2#'+) 通讯作者 杨少奇 &0&# 优先出版 ---&#(&(#"&11&&$1&&&$1!"!

2 # 西安交通大学学报 医学版 第 卷 +,,"##-#&//&"&&# -#"# /&#&&/-"$)**###- &$#&$)**#-" "##& $)**# # "- +,,&#""# ##& ( ) ### (### $)**# ## /##0# ##, 我国肝癌 ","+!+**,- 发病率呈逐年上升趋势 肝癌术后复发转移率高居不下 使得其远期疗效并不理想 因此 筛选出能指导预后的分子标记对肝癌治疗非常重要 近期大量研究认为 肝癌的复发和转移与肝癌干细胞密切相关 肝癌细胞中类干细胞或祖细胞亚型具有预后差的特 征 人类婆罗双树样转录因子 #)++"* )*,,*#%&''# 在胚胎早期发育 器官形成以及胚胎干细胞 "-*,)"-"+3% 增殖和多能性维持方面发挥着重要作用 是经典的干细胞标记物 %&''# 在乳腺癌 胃癌 结直肠癌 食管癌 等肿瘤中均表达异常 提示其与肿瘤发生发展关系密切 但在肝癌方面研究较少 本研究将探讨 %&''# 在肝癌中的表达和作用 * 材料与方法 ** 临床标本 选取宁夏医科大学总医院 年 月 # 年 月肝胆外科手术治疗 经病理确诊的 例 石蜡标本及其中 例癌旁组织标本 例胆管细胞性肝癌标本 例肝血管瘤标本 其中男性 ## 例 女性 例 年龄范围 # 岁 平均年龄 $ 岁 分化程度 高分化 例 中 低分化 #1 例 术后当日即为随访开始 通过住院记录和电话进行随访 随访截止时间为 $ 年 月 另有 年 月至 # 年 月经手术切除的新鲜 标本 例及相应癌旁组织 距离癌组织 - 标本取得后立即转移至液氮罐中 随后置于 / 冰箱中冻存 以上病例均有完整的临床病理学资料 术前均未进行化疗或放疗 研究经医院伦理委员会批准并征得病人或家属同意 *+ 实验试剂 %&''# 鼠抗人单克隆抗体 购自 &- 公司 免疫组化试剂盒 鼠抗人 " 单克隆抗体均购自北京中杉金桥生物技术有限公司 全蛋白提取试剂盒 & 蛋白含量检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司 总.& 提取试剂盒购自 <-"2 公司 3' 发光试剂盒.& 反转录试剂盒 荧光 试剂盒均购自 "*-, 公司 荧光 为罗氏 '2+"* #/ 仪 *, 实验方法 *,* 免疫组化 3+:), 二步法 石蜡包埋组织连续切片 厚 #- 置于 $ 烤箱中过夜 石蜡切片常规脱蜡 水化 间接蒸汽修复抗原 - 抗原修复液为 3;&/ 依次滴加 -'' < 室温 - 山羊血清封闭液 - %&''# 鼠抗人单克隆抗体 =# 过夜 聚合物辅助剂 - 辣根酶标记抗小鼠 82 多聚体 - ;& 显色 常规脱水 透明 封片 % 代替一抗作为阴性对照 结果判定 每张切片选取 $ 个高倍镜视野 胞核内无显色为阴性 $0$0 的细胞核显色 染色颗粒较淡为弱阳性 >$0$0 细胞核显色 染色颗粒较深为中度阳性 $0 细胞核染色 且染色颗粒深为强阳性 *,+ 荧光定量 检测 %&''# -.& 的表达 根据 " 提供的 %&''# 基因序列.9# 由上海生工生物有限公司设计合成 %&''# 引物 上游 $?&&& &&&? 下游 $?&&& &? 内参 &; 引物 上游 $?&& &&&&&? 下游 $?& &&? 总.& 提取及逆转录 取 -2 组织按试剂盒说明提取总.& 经.,;*, 分光光度计检测总.& 质量及浓度 取 2 总.& 进行逆转录反应合成 ;.& 严格按照试剂说明操作 反应体系为 $' 其中 % *"" 7 -)"*-$' 上下游引物各 ' 模板 ' 置于罗氏 '2+"* #/ 扩增仪上 反应条件 1$ 预变性 - 1$ 变性 $) 退火 )# 次循环后 延伸 )-.& 含量采用相对定量法 获得各样 本待测基因及同样本 &; 的 值后用 方法计算 定量 反应产物同时进行电泳鉴定 实验共重复 次 *,,(")"* +, 法 提取肝癌及癌旁组织总蛋白 & 法测定蛋白浓度 上样蛋白为 $2%;% &3 凝胶电泳后 #-&$ 转至硝酸纤维素膜 $2' 脱脂奶粉室温封闭 一抗鼠抗人!"!

3 期 王亚婷 何彩霞 卢振辉 等 %&''# 在肝癌中的表达及其对预后的影响 $ %&''# 单克隆抗体 =$# 孵育过夜 二抗 =$ 室温下孵育 曝光成像 以凝胶定量软件 6!," 分析灰度值 同时检测内参 " = 的表达 * 统计学方法 应用 %%% 软件进行统计学分析 精确概率法 和 (")"* +, 结果中的计量资料用 表示 对于符合正态分布的资料 两组间比较行 检验 生存曲线分析采用 A +9""* 法 生存率差异性经 ',2* 检验评估 $ 为差异有统计学意义 + 结 果 +-* 蛋白的定位与表达 %&''# 蛋白主要 定位于细胞核 组织中 %&''# 的表达率 /0#1 显著高于癌旁组织 $0 差异有统计学意义 #/# 在 例胆管细胞性肝癌的表达率为 /0%&''# 在肝血管瘤组织中不表达 表 图 表 * 不同肝组织标本中 蛋白的表达阳性率 例 ",):""*")),)*",%&''# "*" ))!") 0 标本例数阴性 阳性 > 阳性率 0 肝细胞性肝癌 / / 肝胆管细胞性肝癌 # / 肝癌癌旁组织 $ 肝血管瘤肝组织 图 * "+:"*))!")B# &%&''# 蛋白在 组织中呈阳性表达 %&+# 蛋白在癌旁组织中无表达 %&''# 在胆管细胞性肝癌中呈阳性表达 ;%&+# 蛋白在肝血管瘤中无表达 +-+ 表达与患者临床特征及生存时间的关系 在 例 组织中 %&''# 蛋白表达与性别 年龄 部位 肿瘤最大径 分化程度 )&2 门静脉癌栓.9 分期无明显关系 $ 与甲胎蛋白水平有关 $ 表 将 例肝癌组织分为阴性表达组 低表达组 > 高表达组 或 1 总体生存时间显示 截止到 个月 %&''# 高表达组患者平均生存时间为 个月 1$0 可信区间 为 $/$ 年累计生存率分别为 $10$$0%&''# 低表达组患者平均生存时间为 #$ 个月 1$0 可信区间 为 $/$ 年累计生存率分别为 1$0/$0%&''# 阴性组患者平均生存时间为 $1/ 个月 1$0 可信区间 为 1 1 年累计生存率分别为 0110 %&''# 高表达组患者的生存率明显低于低表达组 差异有统计学意义 $##$$ 图 +-, 荧光定量./ 检测结果 在 例肝细胞癌中有 例表达 %&''# -.& 对应癌旁组织中 例表达 %&''# -.&%&''# -.& 在 例肝癌组织中的相对表达量为 #// 癌旁组织 表 + 表达情况与临床病理特征的关系 "+,)""" %&''#"*")), +,,+,2*"*)) ","+!+**,-))!") 临床病理特征 性别 例数 %&''# 蛋白表达情况 > 值 男 ## / 女 年龄 #/ $$ 岁 1 $$ 岁 $ 肿瘤直径 $ $- $ $ $- $ 1 分化程度 1/1 中低 #1 1 # 高 1 &@ # #2' 1 #2' 1 )&2 1 > #/ / # 门静脉癌栓 // 有 / 无 $ 1 #.9 分期 $1 # $ / 为卡方检验 精确概率检验法 # 或有理论数!"!

4 西安交通大学学报 医学版 第 卷的相对表达量为 经 检验 两组统计学差异显著 /# 图 图 # 图 1 "*")), ","+!+**,- **,-))!") & 肝癌组织 ; 癌旁组织 图 + <:"*+)!*::+!*:" 2 %&''# "*")), 2*,!+,%&''#"*")), 2*,! 图, 荧光定量./ 图 荧光定量./ +-)"0&" 检测结果 %&''# 蛋白在 例肝癌组织中的相对表达量为 $# 癌旁组织中几乎不表达 图 $, 讨 论人类婆罗双树样基因 %&'' 家族共 # 个成员 人的 %&''# 基因定位于染色体 77 编码 /1 型锌指蛋白转录因子 研究表明 %&''# 的 表达富集于胚胎和成人干细胞及类干细胞中 有助于生物发育过程中的细胞干性及肿瘤生长 是一个涉及胚胎 器官发生及肿瘤干细胞 "*)"- "+ % 相关的干细胞基因 %&''# 与转录因子包括 %<D<#.,2 等相互作用共同维系了 3% 的多功能性 是维持 3% 无限增殖 自我更新 多向 分化的重要调控基因 而 %&''# 作为核心因素 在这个调控网络中起主导作用 # 5&. 等通过功能分析表明 %&''# 可上调 - 和 '/ 从而促进胃上皮向间质细胞转化并获得干细胞潜质 参与胃癌的发生和转移 <8A&(& 等通过免疫组化证实 %&''# 在胎儿及婴儿的肝细胞中高表达 例 中有 例病人的 %&''# 蛋白表达阳性 在成人正常肝细胞及胆管细胞中未检出 %&''# 蛋白 本实验中 %&''# 在大部分 呈高表达 与 <8A&(& 的研究结果一致 而 %&''# 在正常肝组织中几乎不表达的特点 提示 %&''# 有可能作为肝癌肿瘤标记物之一 本实验同时检测了 例胆管细胞性肝癌中 %&''# 的表达 其中有 / 例表达 %&''# 研究发现 %&''# 的表达可诱导 A1 和 3&9 的表达 A1 作为胆管上皮和胆管细胞性肝癌的特异性染色标记 提示 %&''# 在促进肝干细胞分化为胆管细胞的过程中可 能发挥了重要作用 本实验发现 %&''# 表达与 &@ 有关 &@ 作为一种癌胚蛋白 主要来自胚胎的肝细胞 在部分生殖细胞肿瘤及胃肠道肿瘤中升高 而健康成人中合成受到抑制 有趣的是 %&''# 蛋白在胎儿和部分新生儿肝脏中表达 而在健康成人肝组织中无表达 但 又重新表达于部分预后不良的肝癌患者体内 &@%&''# 同为癌胚胎蛋白 两者表达是否有内在关联性 有待于进一步研究 本研究结果显示癌旁组织中 %&''# -.& 的表达与其蛋白表达一致性有差异 提示其表达强度可能受到体内诸多因素的影响 但具体机制有待于进一!"!

5 期 王亚婷 何彩霞 卢振辉 等 %&''# 在肝癌中的表达及其对预后的影响 步研究 结果表明 %&''# -.& 在 中呈高表达 %&''# 作为干细胞群的可靠指标 它的水平在数量上提示了肝癌组织中含有干细胞的比例 大量研究表明 包括肝癌在内的一些实体恶性肿瘤存在 % 干细胞特异性标记物呈过表达的肿瘤细胞通常具有较高的侵袭性和致瘤能力 新近研究发现 %&''# 的高表达与结直肠癌细胞的迁移和进展密切相关 %&''# 可作为结直肠癌独 $ 立的生存预测因子 <8A&(& 等发现 %&''# 在成年鼠成肝细胞 ",+) 的表达随着长大后逐渐沉默 表明在胎鼠肝脏细胞早期分化方面起到了重要的作用 进一步敲除 %&''# 基因可抑制移植肝肿瘤生长 提高了免疫缺陷瘤小鼠的平均存活时间 本实验 A+9""* 生存分析显示 %&''# 高表达组肝癌患者平均生存时间 月 较低表达组 #$ 月 明显缩短 表明肝癌组织中 %&''# 蛋白表达越强 患者的生存期越短 预后越差 %&''# 的表达可影响肝癌的恶性生物学行为 可能作为肝癌患者病情程度判断及预后不良的预测指标 但本研究入组病例较少 需进一步加大样本量进行深入研究 参考文献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编辑 韩维栋 上接第 / 页 &+ /##& 1')'851')'85!3!)$!%)55 $5+)3/)'6*9)'6 /&.# &6# 4,'!7 ###- # ##" -- #"# ## #, + &,.#1& &#6#//#$1 $'!1')'851')'85!3!$!& #& ##4,'!7$4# /).')63 '&)# "# -"# - ",97),*,'47" 4,'!7 #"#(&,#$1$& # $ #'.*$' $6)'&4, $" &,#$1/#& '!76$* #-"#"# 编辑 卓选鹏 ""#".11" $18!"!