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陪寇
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1 第 22 卷第 3 期年 9 月 ANALYSIS AND TESTING TECHNOLOGY AND INSTRUMENTS Volume 22 Number 3 Sept 分析测试新方法 (169 ~ 178) 一种测定植物的高灵敏度衍生化 HPLC-MS/ MS 方法孙琪, 陈帆 ( 温州大学化学与材料工程学院, 浙江温州 ) 摘要 : 建立以丹磺酰肼为柱前衍生试剂, 采用 Agilent Poroshell 120 EC-C18(50 mm 3. 0 mm,2. 7 μm) 反相色谱柱, 甲醇 - 水 ( 体积比为 99 1) 为流动相, 流速为 0. 3 ml / min, 进样量为 10 μl, 电喷雾电离源, 选择反应监测 ( SRM) 方式正离子检测, 测定豆 β- 谷岩藻麦角的柱前衍生化高效液相色谱串联质谱法. 同时分析测定羊栖菜海带紫菜中的种类及含量. 以胆固醇为内标物, 采用内标工作曲线法定量, 各线性范围在 ~ 100 μg / ml 之间, 相关系数在 ~ 之间, 检出限 (LODs) 在 0. 2 ~ 20 ng / ml 之间, 定量限 (LOQs) 在 ~ ng / ml 之间, 类物质灵敏度比高效液相色谱法提高 25 ~ 500 倍. 关键词 : 植物 ; 高效液相色谱串联质谱法 ; 柱前衍生化 ; 选择反应监测中图分类号 : O 文献标志码 :B 文章编号 : (2016) DOI: / j A Highly Sensitive Method for Quantitative Analysis of Phytosterols by HPLC-MS / MS with Pre-Column Derivatization SUN Qi, CHEN Fan ( College of Chemistry and Materials,Wenzhou University,Wenzhou ,Zhejiang China) Abstract: A sensitive liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry ( LC-ESI-MS / MS) method for the determination of phytosterols in sargassum fusiforme has been developed and validated. Four kinds of phytosterols were derivatived by dansyl hydrazine and separated on a reversed-phase Agilent Poroshell 120 EC-C18 column(50 mm 3. 0 mm, 2. 7 μm) with a mobile phase of methanol-water (99 1,V V) at a flow rate of 0. 3 ml / min, and the injection volume was 10 μl. An electrospray ionization source was applied and operated in the positive ion mode, confirmed by the selected reaction monitoring (SRM) mode using an internal standard method. Phytosterols showed a wide linearity in ~ 100 μg / ml, with correlation coefficients between and The limits of detection of phytosterols were between 0. 2 and 20 ng / ml. This simple, selective and sensitive method can be successfully used for the determinations of different types of matrices, and has a 25 ~ 500 fold increase in sensitivity than that in high performance liquid chromatography. Key words: phytosterols;high performance liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry;precolumn derivatization;select reaction monitoring 植物是一类天然活性物质的总称. 虽然它们在植物性食物中含量很少, 却具有较高的食用和药用价值. 药理学研究表明, 植物能有效降低胆固醇, 具有抗炎抗癌抗氧化的功能, 同时还具备调节免疫系统调节人体甾体激素等作用. 有些也是维生素 D 甾族化合物以及多种激素合成的前体物质 [1-6]. 因此, 对植物分析研究具有非常重要的现实意义. 植物的定量分析方法主要有毛地黄皂苷法气相色谱法气相色谱质谱联用高效液相色谱法高效液相色谱质谱联用法高速逆流色谱法等 [7-14]. 最早期方法多为毛地黄皂苷法, 但因其价格贵分析耗时操作繁琐多干扰因素而逐渐被淘汰. 高效液相色谱法应用较为广泛, 但是单一的色收稿日期 : ; 修订日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金面上项目 ( ) 资助,Foundation item:nsfc(no ) 作者简介 : 孙琪 (1992-), 女, 硕士研究生, 主要从事色质联用分析,Tel: , @ 163. com 通信作者 : 陈帆, 教授, 主要从事色质联用分析,Tel: , fanchen@ wzu. edu. cn.

2 170 第 22 卷谱法有时定性并不完全准确, 因此色谱 - 质谱联用的方法刚好弥补这一缺点. 就目前报道的文献中, 鲜有衍生化液相色谱串联质谱法分析植物. 液相色谱 - 质谱联用的电喷雾电离 ( ESI) 源远比气相色谱 - 质谱联用的化学电离 (EI) 源温和, 更容易控制碎裂程度, 产生准分子离子峰, 方便获得分子结构信息. 因此本研究是一种将衍生与液质联用结合的方法. 首先采用较温和且适合天然产物的戴斯马丁 (DMP) [15-16] 氧化剂 [17-18] 将氧化成酮, 再用丹磺酰肼与酮发生腙化反应, 最后进样分析. 采用二级质谱, 定性能力大大提高, 因此液相色谱不必完全分离所有组分. 选择反应监测 (SRM) 模式提高选择性, 大大节省分析时 [19] 间. 衍生化反应的目的是引入容易离子化的基团, 使目标物的离子化效率增强, 从而提高仪器检测的灵敏度. 因此, 该方法的建立为植物以及具有相似结构的类固醇维生素 D 2 ( VD 2 ), 维生素 D 3 (VD 3 ) 等的分析研究提供理论依据. 1 试验部分 1. 1 仪器与试剂 Milli - Q 超纯水处理系统 ( 美国 Millipore 公司 );LCQ DECA XP Plus 液相色谱质谱联用仪 (Thermo Finnigan);KQ-250D 型超声波清洗器 ( 昆山市超声仪器有限公司 ); 海尔超低温保存箱 ;FD- IC-50 型冷冻干燥机 ( 北京博医康实验仪器有限公司 ); 高速万能粉碎机 ( 上海启前电子科技有限公司 );BUCHI Rotavapor R-215 型旋转蒸发仪 ;AL106 电子天平 ( 梅特勒 - 托力多仪器有限公司 ); 可调量程移液器 ( 德国 Eppendorf 公司 ). 甲醇乙醇 ( 色谱纯, 北京百灵威科技有限公司 ), 其他试剂均为分析纯 ; 水为超纯水 (Milli-Q 超纯水制备 ); 丹磺酰肼 (98% ), 戴斯马丁氧化剂,15wt% 二氯甲烷溶液 ( DMP), 麦角 (98% ), 豆 (95% ), β- 谷 (98% ), 岩藻 (98% ), 胆固醇 (98% ), 均购自北京百灵威科技有限公司 ; 羊栖菜采摘自浙江温州洞头海域, 紫菜海带均为市售仪器工作条件高效液相色谱 ( HPLC) 条件 : Agilent Poroshell 120 EC - C48 反相色谱柱 ( 50 mm 3. 0 mm,2. 7 μm); 流动相 : 甲醇 - 水 ( 体积比为 99 1); 柱温 : 室温 ; 流速 :0. 3 ml / min; 进样量 :10 μl. 电喷雾离子源 (ESI) 条件 : 正离子模式, 电喷雾电压为 4 kv; 加热毛细管温度为 350 ; 氮气 ( N 2 ) 压力为 MPa; 氦气 (He) 压力为 MPa; 鞘气流速 20 arb; 辅助气流速为 5 arb 标准溶液的配制称取 g 植物标准品和 g 胆固醇标准品, 分别用二氯甲烷溶解并定容于 10 ml 容量瓶, 摇匀, 得质量浓度为 0. 5 mg / ml 植物储备液和 0. 5 mg / ml 胆固醇储备液衍生化反应用 0. 5 mg / ml 的植物标准储备液配制一系列浓度的标准工作液, 每个浓度均含 10 μl 0. 5 mg / ml 的胆固醇储备液作为内标, 加入 6 μl DMP,35 左右超声 40 min, 第一步氧化反应完毕. 反应液用 N 2 吹干, 加入 150 μl 丹磺酰肼衍生剂 6 μl 对甲苯磺酸,40 左右超声 30 min, 第二步反应完毕. 用甲醇稀释至 1. 0 ml, 过 μm 滤膜后进样分析. 以麦角为例, 植物衍生反应机理如图 1 2 所示. Fig. 1 图 1 DMP 氧化反应机理 Reaction mechanism of phytosterol and DMP

3 第 3 期孙琪, 等 : 一种测定植物的高灵敏度衍生化 HPLC-MS / MS 方法 171 Fig. 2 图 2 [19] 丹磺酰肼衍生甾酮反应机理 Dansyl hydrazine derivative reaction mechanism

4 172 第 22 卷 1. 5 样品前处理第一步氧化反应所用的戴斯马丁氧化剂具有较高选择性, 较温和的反应条件, 能直接有效地将仲醇氧化成酮, 更适合天然产物的反应, 并且反应后处理简单, 不产生有毒有害物质, 因此是一种环境友好的氧化剂. 丹磺酰肼与羰基的腙化反应条件简单快速, 反应过程会发生贝克曼重排, 这些中间产物也会提高质谱的离子化效率, 增加灵敏度羊栖菜样品溶液的制备羊栖菜用蒸馏水洗净, 置于超低温冰箱冷冻 24 h, 冷冻干燥机干燥 24 h, 将干燥后的羊栖菜粉碎过筛, 装瓶待用. 准确称取 g 羊栖菜粉末,50 下用 40 ml 乙醇超声功率 90 W 提取 90 min, 减压抽滤, 滤液于 40 下旋转蒸发至干. 向上述蒸干溶剂的茄形瓶中加 KOH -C 2 H 5 OH 溶液 (2 mol / L,20 ml),60 下皂化 90 min. 皂化结束, 溶液冷却至室温, 旋转蒸发有机溶剂, 然后向其中加 10 ml 水溶解, 水相分别用 10 ml 正己烷萃取 3 次, 取正己烷相合并, 蒸干溶剂, 用二氯甲烷定容 ml, 取 100 μl 按 1. 4 所述进行衍生化反应, 最后用甲醇定容 ml, 过 μm 微孔滤膜进样分析. 2 结果与讨论图 3 Fig. 3 衍生剂体积对衍生化效率的影响 Effect of derivative agent volume on efficiency of derivatization 2. 1 衍生化条件优化衍生剂体积的选择丹磺酰肼与不会完全反应, 同时由于第一步氧化剂剩余, 因此需要过量衍生剂对衍生, 尽可能定量转化, 所以试验考察了衍生剂的体积分别为 ml 时, 产物浓度的变化情况. 试验结果表明, 随着衍生剂用量增加, 产物浓度增加, 当超过 ml 时, 产物浓度不再增加, 故选择衍生剂的体积 ml. 衍生产物峰面积强度随衍生剂用量的变化趋势如图 3 所示衍生化时间的选择保持衍生温度和用量不变, 在 60 min 内, 考察时间对衍生效率的影响. 使用相同浓度的标准品混合液与衍生剂反应不同时间后测定, 结果表明, 反应 30 min 后, 各衍生物峰面积达到最大且基本恒定, 故选择衍生化时间为 30 min. 衍生产物峰面积强度随衍生时间的变化趋势如图 4 所示衍生化温度的选择在 20 ~ 60 之间, 考察温度对衍生效率的影响, 结果如图 5 所示. 由图 5 可见, 随着温度升高, 图 4 反应时间对衍生化效率的影响 Fig. 4 Effect of reaction time on efficiency of derivatization 图 5 反应温度对衍生化效率的影响 Fig. 5 Effect of reaction temperature on efficiency of derivatization 各衍生物峰面积不断增大, 当温度超过 40, 衍生效率明显降低, 故选择 40 作为最佳衍生化温度.

5 第 3 期孙琪, 等 : 一种测定植物的高灵敏度衍生化 HPLC-MS / MS 方法液质条件优化液相色谱条件植物是一类低极性化合物, 亲水性很差, 通过查阅文献, 考察 100% 甲醇作流动相, 每种待测组分可在 10 min 内出峰, 且峰型较优, 各衍生物色谱图如图 6 所示. 但由于甲醇较强的洗脱能力使各组分不能较长保留使组分得不到较好分离, 因此考察甲醇 - 水 ( 体积比为 99 1) 作流动相, 结果表明, 甲醇 - 水能增加各组分保留值, 各衍生物色谱图如图 7 所示. 由图 7 可见, 分离较好, 因此选择甲醇 - 水 ( 体积比为 99 1) 作为流动相. 本试验选用 Agilent Poroshell 120 EC-C18(50 mm 3. 0 mm, 2. 7 μm) 反相色谱柱, 短柱可以有效减少分析时间. Fig. 6 图 6 100% 甲醇分离衍生物的色谱图 Chromatograms separated phytosterol derivatives by 100% methanol

6 174 第 22 卷 Fig. 7 图 7 标准衍生物的 SRM 图 SRM chromatograms of standard phytosterol derivatives 质谱条件优化在 ESI 源条件下, 分别对待测标准衍生物做正负离子模式下的全扫描分析, 结果表明, 各衍生物的最佳准分子离子峰均在正离子模式下产生. 在此基础上, 进一步对母离子优化至最大响应, 然后对相应子离子作全扫描分析, 通过对碰撞能量的优化, 使子离子丰度达到最优. 将二级质谱子离子峰作为最终定性定量的特征离子. 优化后的质谱参数如表 1 所列方法比较由于类物质属于极性很弱的化合物, 直接进质谱几乎不离子化, 因此在这种情况下对其进行定性定量分析就变得毫无意义. 文献报道对类物质的分析多采用高效液相色谱法 [20]. 该法要求组分全部出峰, 对于成分复杂的天然产物的分析不但浪费时间, 而且定性不准. 取标准品配成一

7 第 3 期孙琪, 等 : 一种测定植物的高灵敏度衍生化 HPLC-MS / MS 方法 175 系列浓度的工作溶液进高效液相色谱分析, 做系列标准曲线, 结果如表 2 所列. 本试验中 LODs( 信噪比 S / N = 3) 在 5 ~ 100 ng / ml 之间, LOQs(S / N = 10) 在 ~ 333 ng / ml 之间. 柱前衍生化 HPLC - ESI-MS / MS 法与高效液相色谱法相比较,4 种植物测定的灵敏度提高了 25 ~ 500 倍. Table 1 表 1 质谱分析参数 Optimized SRM parameters for determination of phytosterols 植物母离子 [M] + 子离子 [M-234] + 碰撞能量 E / ev β- 谷豆麦角岩藻胆固醇表 2 柱前衍生化 HPLC-ESI-MS / MS 法与高效液相色谱法比较 Table 2 Compared pre-column derivatization HPLC-ESI-MS / MS with HPLC 液相线性范围 ρ / (μg / ml) 检出限 LOD / (ng / ml) 液相衍生液质定量限 LOQ / (ng / ml) 液相衍生液质灵敏度提高倍数麦角 0. 1 ~ 豆 1 ~ β- 谷 5 ~ 岩藻 5 ~ 标准植物衍生物的液质分析按照前述植物衍生过程将标准品衍生化反应后, 采用甲醇 - 水 ( 体积比为 99 1) 在 25 min 内对 5 种衍生物作二级质谱的定性定量分析. 由于丹磺酰肼的衍生化产物存在同分异构现象 ( 顺式和反式 ), 因此二级质谱显示为双峰, 如图 7 所示. 每一种衍生物母离子都会在一定的碰撞能量下产生对应的子离子峰, 因此使用特定的子离子 [M-C 12 H 12 NO 2 S] + 作为对植物衍生物 HPLC / SRM / MS 分析的特征离子. 结果表明 : 灵敏度和选择性大大提高, 定性更准确. 各组分经液相色谱分离, 质谱定性定量分析鉴定, 如衍生后的麦角的准分子离子峰为 640, 使用能量碰撞诱导解离, 得到 406, 即化合物相应的二级质谱子离子峰, 其质谱图如图 8 所示线性方程检出限定量限将植物按 1. 3 节所述衍生方法进行衍生化反应, 在同样的液质条件下, 分别进样分析. 以衍生物质量浓度 ( ρ,μg / ml) 为横坐标, 衍生物与图 8 麦角衍生物的质谱图和碰撞诱导解离机理 Fig. 8 Typical product ion spectra from CID of [M] + ion for Ergosterol derivative and collision induced dissociation mechanism 内标的峰面积比 ( Y i / Y I ) 为纵坐标, 做线性回归分析. 植物衍生物在总进样质量浓度为 ~ 100 μg / ml 时表现出较好的线性, 相关系数在以上. 以 3 倍信噪比 (S / N = 3) 计算检出限

8 176 第 22 卷 (LODs),10 倍信噪比 (S / N = 10) 计算定量限 LOQ, 确定本试验的 LODs 在 0. 2 ~ 20 ng / ml 之间,LOQs 在 ~ ng / ml 之间. 为考察方法重现性, 分别对标准品进行日内和日间衍生化反应, 最后进样分析, 其相对标准偏差小于 1. 0%, 表现出较好的重现性. 试验结果如表 3 4 所列. Table 3 表 3 衍生物的线性回归方程相关系数检出限定量限 Linear regression equations,correlation coefficients,limits of detection,limits of quantification of phytosterols derivatives 线性方程相关系数检出限 LOD / (ng / ml) 定量限 LOQ / (ng / ml) 麦角 Y = ρ 豆 Y = ρ β- 谷 Y = ρ 岩藻 Y = ρ 表 4 植物标准品 3 种质量浓度日内和日间相对标准偏差 (n =6) Table 4 High, medium, and low concentrations of intra-day and inter-day relative standard deviations % μg / ml 1 μg / ml 10 μg / ml 麦角豆甾 β- 谷岩藻麦角豆甾 β- 谷岩藻麦角豆甾 β- 谷岩藻醇醇醇日间日内 N 加标为考察该方法的准确度, 进行了加标试验. 称取 18 份等量的羊栖菜粉末, 分 3 组, 进行高中低水平的加标试验, 经提取皂化衍生化反应后, 采用同样的液质联用条件进行测定. 计算和相对标准偏差 ( ), 得在 82. 0% ~ % 之间, 精密度均小于 2. 0%, 结果如表 5 所列. 表 5 高中低 3 种质量浓度下的加标 Table 5 Spiked recoveries and relative standard deviations under high, medium, and low concentrations % 0. 1 μg / ml 1 μg / ml 10 μg / ml β- 谷岩藻 μg / ml 0. 5 μg / ml 5 μg / ml 麦角

9 第 3 期孙琪, 等 : 一种测定植物的高灵敏度衍生化 HPLC-MS / MS 方法实际样品测定将海带紫菜样品按 1. 6 节冷冻干燥粉碎过筛提取皂化, 按 1. 4 节衍生, 平行做 6 个样, 在 1. 2 节的液质条件下进样分析 3 次. 以标准品衍生物二级质谱子离子的色谱保留时间做对照, 判断海带紫菜样品中植物的种类, 羊栖菜海带紫菜中平均含量如表 6 所列. 由表 6 可知, 岩藻在羊栖菜中含量最多, 麦角豆几乎不含, 紫菜中这几种含量最少. 这也说明豆多存在谷物作物植物油等物质中, 藻类物质含量较少甚至没有. 故在羊栖菜紫菜海带研究中, 羊栖菜的研究意义更大. 表 6 海藻中的平均含量 (n =6) Table 6 Contents of phytosterols in seaweeds( n = 6) 测得质量分数 ω / (mg / kg) 羊栖菜海带紫菜 / % 羊栖菜海带紫菜 β- 谷豆 Nd Nd Nd Nd Nd Nd 麦角 Nd Nd Nd Nd 岩藻注 : Nd 为未检出. 3 结论本试验选用温和的高碘氧化试剂 DMP 将植物氧化成酮, 以丹磺酰肼作为柱前衍生化试剂, 胆固醇为内标物, 采用 HPLC -ESI -MS / MS 法测定了羊栖菜海带紫菜中的植物. 结果表明, 羊栖菜中含有岩藻 β- 谷及少量的麦角, 其中岩藻含量最高 ; 紫菜海带中植物种类同羊栖菜类似, 但是每种含量远远少于羊栖菜, 故研究羊栖菜具有很大意义. 由于该方法采用丹磺酰肼作为柱前衍生化试剂, 丹磺酰肼的叔氮极易离子化, 大大增强了质谱信号, 与高效液相色谱法相比,4 种植物的测定灵敏度提高了 25 ~ 500 倍. 同时该方法还具有衍生化条件温和产物无毒灵敏度高重现性良好等特点, 为各类谷物植物性食物植物油等的分析研究提供参考依据. 参考文献 : [ 1 ] Liang Y T, Wong W T, Guan L, et al. Effect of phytosterols and their oxidation products on lipoprotein profiles and vascular function in hamster fed a high cholesterol diet [ J]. Atherosclerosis,2011,219 (( 1 ): [ 2 ] Alemany L, Laparra J M, Barberá, et al. Relative expression of cholesterol transport-related proteins and inflammation markers through the induction of 7 - ketosterolmediated stress in Caco - 2 cells [ J]. Food and Chemical Toxicology, 2013, 56: [ 3 ] Valerio M, Awad A B. β - sitosterol down - regulates some proinflammatory signal transduction pathways by increasing the activity of tyrosine phosphatase SHP-1 in J774A. 1 murine macrophages [ J ]. Int Immunopharmacol, 2011,11 (8): [ 4 ] Loizou S, Lekakis I, Chrousos G P, et al. β-sitosterol exhibits anti - inflammatory activity in human aortic endothelial cells [ J ]. Molecular nutrition & food research, 2010 (54): [ 5 ] Awad A B, Gan Y, Fink C S. Effect of β-sitosterol, a plant sterol, on growth, protein phosphatase 2A and phospholipid D in LNCaP cells [ J ]. Nutrition and Cancer, 2000, 36: [ 6 ] Petter Nieminena, Anne - Mar Mustonen. Increased reproductive Success in the white American mink ( Neovison vison ) with chronic dietary β - sitosterol supplement[ J]. Animal Reproduction Science, 2010, 119: [ 7 ] 胡于鲁, 刘银燕, 谷月卿, 等. 重量法测定大豆的含量 [J]. 白求恩医科大学学报,1995,21 ( l): [ 8 ] 颜鸿飞, 李拥军, 王美玲, 等. 高效液相色谱 - 串联质谱法测定水果中残留的烯唑醇 [ J]. 分析测试技术与仪器,2012,18(4): [ 9 ] 黄可可, 黄丽英, 吴萍萍, 等. 液相色谱 - 电喷雾电离 / 离子阱质谱法分析金线莲中 3 - 吡啶甲醇 [ J].

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第 22 卷第 1 期 2 0 1 6 年 3 月 ANALYSIS AND TESTING TECHNOLOGY AND INSTRUMENTS Volume 22 Number 1 Mar. 2016 大型仪器在食药品安全中的应用成果 (001 ~ 008) 水产品中多种雌激素残留的质谱分析方法研究卢巧梅 ( 福州大