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1 Agilent 针 对 分 析 鸡 肉 中 抗 病 毒 药 物 利 巴 韦 林 (Ribavirin) 和 金 刚 烷 胺 (Amantadine) 的 解 决 方 案

2 事 件 背 景 近 日, 央 视 曝 光 违 规 喂 食 金 刚 烷 胺 利 巴 韦 林 等 抗 病 毒 药 品 的 速 生 鸡 流 入 上 海 百 盛 旗 下 餐 饮 机 构 一 事, 引 发 沪 上 人 士 广 泛 关 注!!!

3 结 构 性 质

4 利 巴 韦 林 危 害 性

5 金 刚 烷 胺 危 害 性

6 如 何 检 测 鉴 定 鸡 肉 中 的 抗 病 毒 药 物? 目 前 缺 乏 针 对 利 巴 韦 林 和 金 刚 烷 胺 在 动 物 源 食 品 中 的 检 测 技 术 方 法 和 国 家 标 准 ; 针 对 鸡 肉 样 品 中 残 留 的 抗 病 毒 药 物 含 量 低, 基 质 干 扰 大, 急 需 有 效 的 前 处 理 方 法 和 高 灵 敏 度 的 检 测 技 术 ; 安 捷 伦 科 技 能 为 客 户 提 供 从 前 处 理 到 仪 器 分 析 完 整 的 解 决 方 案 Page 6 WW Seminar Series 2006

7 鸡 肉 中 的 抗 利 巴 韦 林 / 金 刚 烷 胺 分 析 方 法 吴 翠 玲 CSD 应 用 工 程 师 安 捷 伦 科 技 ( 中 国 ) 有 限 公 司 2012/12/12

8 利 巴 韦 林 化 学 结 构 易 溶 于 水 存 在 顺 式 羟 基 所 以 选 择 Bond Elut PBA 作 为 萃 取 净 化 柱 Bond Elut PBA 独 特 的 硅 胶 基 质 的 SPE 吸 附 剂, 苯 硼 酸 通 过 可 逆 共 价 键 来 保 留 目 标 分 析 物 这 种 强 的 共 价 保 留 机 理 可 以 保 证 高 的 特 异 性 和 更 干 净 的 萃 取 效 果 硼 酸 盐 基 团 对 包 含 顺 式 - 二 醇 官 能 团 的 化 合 物 具 有 很 强 的 亲 和 性, 例 如 儿 茶 酚 核 酸 一 些 蛋 白 糖 类 和 聚 乙 二 醇 化 合 物 氨 基 醇 α- 羟 基 胺 酮 类 化 合 物 等

9 Bond Elut PBA 萃 取 机 理 苯 硼 酸 首 先 用 碱 溶 液 平 衡, 使 苯 硼 酸 根 反 应 生 成 RB(OH)3, 然 后 将 包 含 二 醇 基 的 化 合 物 上 样, 与 苯 硼 酸 结 合, 释 放 水 分 子 一 旦 目 标 分 析 物 被 保 留, 可 以 在 保 留 碱 性 环 境 的 前 提 下 选 择 合 适 溶 剂 洗 脱 污 染 物, 最 终 通 过 酸 化 苯 硼 酸 复 合 物 使 得 目 标 化 合 物 被 洗 脱, 释 放 出 带 有 二 醇 基 的 目 标 化 合 物, 同 时 使 苯 硼 酸 转 化 为 (RB(OH)2 平 衡 保 留 洗 脱 苯 硼 酸 萃 取 三 步 过 程 机 理

10 Bond Elut PBA 能 分 析 的 化 合 物 苯 硼 酸 可 以 保 留 包 含 二 醇 和 其 他 基 团 的 化 合 物 例 如 : 1 邻 - 二 醇,1,3- 二 醇, 1,3,5- 三 醇. 对 邻 二 醇 的 保 留, 要 求 化 合 物 中 的 两 个 羟 基 共 面 或 者 是 顺 式 结 构 分 子 内 部 的 氢 键 键 合 使 得 1,3- 二 醇 共 面, 因 此 该 化 合 物 可 被 保 留 2 糖 类 化 合 物 糖 类 化 合 物 中 的 环 表 现 出 假 回 转, 可 以 通 过 其 他 环 而 被 保 留 理 论 上 将 任 何 2 个 或 3 个 羟 基 隔 开 后 可 以 充 满 三 羟 基 化 硼 的 四 面 体 位 点 均 有 可 能 被 保 留 3 芳 香 -O 羟 基 酸 和 酰 胺, 包 含 α - 羟 基 酸,1,3- 二 羟 基 -, 三 酮 -, 氨 基 醇 的 化 合 物 等 不 只 是 二 醇 类 的 官 能 团 会 被 保 留, 其 他 一 些 不 同 的 官 能 管 也 会 被 固 化 的 苯 硼 酸 通 过 电 荷 转 移 或 者 是 共 价 作 用 结 合 而 保 留, 例 如 有 一 些 包 含 芳 香 -O 羟 基 酸 和 酰 胺, 包 含 α - 羟 基 酸,1,3- 二 羟 基 -, 三 酮 -, 氨 基 醇 的 化 合 物

11 鸡 肉 中 的 利 巴 韦 林 分 析 - 样 品 前 处 理 过 程 准 确 称 取 鸡 肉 样 品 ( 2g± 0. 02) g 于 15mL 具 塞 离 心 管 中, 加 入 已 知 浓 度 的 标 准 品,5 ml 乙 腈 :1% 三 氯 乙 酸 溶 液 (7:3), 加 盖 后 涡 旋 2m in, 10000r /m in 离 心 10 m in, 吸 取 上 清 液 于 15mL 离 心 管 中 ; 于 残 渣 中 再 加 入 5 ml 乙 腈 :1% 三 氯 乙 酸 溶 液 (7:3), 同 法 操 作, 合 并 两 次 上 清 液 ; 涡 旋 混 匀, 用 氨 水 调 ph 值 为 (8. 5± 0. 1 ), 再 10000r /m in 离 心 10 m in 取 上 清 液 过 柱

12 利 巴 韦 林 SPE 萃 取 净 化 过 程 Bond Elut PBA 500mg 6mL(P/N ) 活 化 1.5mL70:30 水 : 乙 腈 ( 含 有 1% 甲 酸 ) 2.8mLpH 8. 5 的 乙 酸 铵 缓 冲 液, 上 样 淋 洗 10mL 含 有 10% 乙 腈 的 ph 8. 5 的 乙 酸 铵 缓 冲 液 洗 脱 抽 干 小 柱, 用 5mL0.1Mol/L 的 甲 酸 洗 脱 洗 脱 液 涡 旋 均 匀 后 过 膜, 直 接 LC-MS/MS 检 测

13 金 刚 烷 胺 化 学 结 构 利 用 金 刚 烷 胺 氨 基 特 征 官 能 团 选 择 Bond Elut Plexa PCX 作 为 固 相 萃 取 吸 附 剂 Bond Elut Plexa PCX 为 聚 合 物 基 质 的 混 合 型 强 阳 离 子 交 换 固 相 萃 取 产 品

14 鸡 肉 中 的 金 刚 烷 胺 分 析 2g 鸡 肉 样 品 ( 精 确 至 0.01g) 至 15mL 离 心 管 中, 加 入 已 知 浓 度 的 标 准 品 5mL 甲 醇 -1% 三 氯 乙 酸 (50+50,V+V), 涡 旋 30s, 超 声 30min,10000r/min 离 心 10min, 上 清 液 全 部 转 移 至 15mL 离 心 管 中 再 加 入 5mL 甲 醇 -1% 三 氯 乙 酸 (50+50,V+V) 重 复 提 取 一 次, 合 并 全 部 滤 液 ; 涡 旋 均 匀 后 重 新 离 心, 取 5mL 上 清 液, 过 Plexa PCX 固 相 萃 取 小 柱

15 鸡 肉 中 金 刚 烷 胺 固 相 萃 取 过 程 Bond Elut PCX 60mg 3mL(P/N ) 活 化 1.3mL 甲 醇 ; 2.3mL 水, 上 样 控 制 流 速 1mL/min 以 下 淋 洗 3mL2% 盐 酸 ;3mL 甲 醇, 抽 干 洗 脱 5mL5% 氨 水 - 甲 醇 - 异 丙 醇 ( ) 洗 脱 液 氮 气 吹 扫 浓 缩 至 干, 重 新 用 30:70 乙 腈 : 水 涡 旋 溶 解 后 过 膜 后, 直 接 LC-MS/MS 检 测

16 Agilent 1290 Infinity+6460QQQ 仪 器 解 决 方 案 李 建 中 LCMS 应 用 工 程 师 安 捷 伦 科 技 ( 中 国 ) 有 限 公 司

17 测 试 试 剂 和 材 料 乙 腈 (Acetonitrile): Merck Lichrosolv Hypergrade for LC-MS, Index No: ,1L/ 瓶 ; 去 离 子 水 (Water): Millpore, Milli-Q,18.2MΩ,TOC 5ppb; 甲 酸 (Formic acid): DikmaPure HPLC Grade, 50mL/ 瓶 ; 乙 酸 铵 (Ammonium acetate) Poroshell120 EC-C18 3.0x100 mm, 2.7 µm: 色 谱 柱 部 件 号

18 LC Condition: Agilent 1290 Infinity Injection volume: 2 ml Autosampler temp: 4 ºC Column Temp: 30 ºC Needle Wash: Column: Pump Flow: Mobile Phase: Flushport (50%acetonitrile+20%isopropyl alcohol+30%water), 6 s Agilent Poroshell120 EC-C18 (3.0x100 mm, 2.7 µm) 0.4 ml/min A = Water(0.1%Formic acid+5mm Ammonium acetate) B = Acetonitrile Gradient: Time %B Stop time: 10min Post time: 3min

19 MS Condition: Agilent 6460 QQQ QQQ MS conditions Ion Mode: ESI/JetStream ESI, Positive ESI conditions Drying Gas Temperature: 300 ºC Drying Gas Flow: 8 L/min Nebulizer Pressure: 40 psi Sheath Gas Temperature: 300 ºC Sheath Gas Flow: 11 L/min Capillary voltage (+): 3000 V Nozzle voltage (+): 0 V MRM Condition: Timesegment1: 0min ΔEMV=400V Timesegment2: 4min ΔEMV=200V

20 1ppb 混 标 的 MRM 谱 图 利 巴 韦 林 金 刚 烷 胺

21 灵 敏 度 (Sensitivity) 0.1ppb 利 巴 韦 林, 2mL 信 噪 比 (S/N,RMSx3)=89 0.1ppb 金 刚 烷 胺, 2mL 信 噪 比 (S/N,RMSx3)=63

22 线 性 范 围 (Linear):0.1ppb~10ppb 稳 定 性 (Stability) 利 巴 韦 林 Conc. 0.1ppb 0.5ppb 1ppb 2ppb 5ppb 10ppb Area RSD

23 线 性 范 围 (Linear):0.1ppb~10ppb 稳 定 性 (Stability) 金 刚 烷 胺 Conc. 0.1ppb 0.5ppb 1ppb 2ppb 5ppb 10ppb Area RSD

24 利 巴 韦 林 在 净 化 后 的 鸡 肉 样 品 中 的 基 质 效 应 标 准 品 空 白 样 品 提 取 液 稀 释 标 准 品 经 过 PBA 净 化 和 色 谱 分 离 后 的 样 品 基 质 效 应 很 小

25 金 刚 烷 胺 在 净 化 后 的 鸡 肉 样 品 中 的 基 质 效 应 空 白 样 品 提 取 液 稀 释 标 准 品 标 准 品 经 过 PCX 净 化 和 色 谱 分 离 后 的 样 品 基 质 效 应 很 小

26 利 巴 韦 林 标 准 品, 添 加 样 品 和 空 白 样 品 的 TIC 谱 图 添 加 样 品 标 准 品 空 白 样 品 平 均 回 收 率 (Recovery) 为 82.8%

27 金 刚 烷 胺 标 准 品, 添 加 样 品 和 空 白 样 品 的 TIC 谱 图 标 准 品 添 加 样 品 空 白 样 品 平 均 回 收 率 (Recovery) 为 70.0%

28 总 结 Summary 采 用 Agilent QQQ 在 正 离 子 模 式 下 可 以 同 时 分 析 测 定 鸡 肉 中 抗 病 毒 药 物 利 巴 韦 林 和 金 刚 烷 胺 ; 采 用 PBA 和 PCX 分 别 可 以 有 效 的 对 鸡 肉 样 品 中 的 利 巴 韦 林 和 金 刚 烷 胺 实 现 净 化 处 理, 净 化 后 的 样 品 基 质 效 应 小, 添 加 回 收 率 可 达 到 70% 以 上 ( 无 同 位 素 内 标 校 正 ); 采 用 6460QQQ 分 析 结 果 表 明 在 0.1ppb 浓 度 下, 利 巴 韦 林 的 信 噪 比 (S/N)=89; 金 刚 烷 胺 的 信 噪 比 (S/N)=63; 在 0.1ppb~10ppb 浓 度 范 围 内, 线 性 关 系 和 稳 定 性 优 异, 相 关 系 数 R>0.999, 峰 面 积 RSD<5%.

29 Thank you for your attention! 服 务 热 线 : Ext 4 消 耗 品 cuiling.wu@agilent.com jian-zhong_li@agilent.com

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