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1 乙 酸 酐 衍 生 GC-ECD 法 测 定 饮 料 中 三 氯 蔗 糖 的 含 量 黄 志 勇, 陈 艳, 冯 慧, 刘 超, 景 赞 ( 乐 山 市 食 品 药 品 检 验 检 测 中 心, 四 川 乐 山 ) 摘 要 : 建 立 了 一 种 乙 酸 酐 衍 生 - 气 相 色 谱 仪 - 电 子 捕 获 器 检 测 食 品 中 三 氯 蔗 糖 的 方 法 样 品 经 水 稀 释 1- 甲 基 咪 唑 催 化 乙 酸 酐 衍 生, 生 成 的 衍 生 物 采 用 气 相 色 谱 - 质 谱 (GC-MS) 法 定 性, 气 相 色 谱 电 子 捕 获 器 (GC-ECD) 法 定 量 结 果 表 明 : 衍 生 目 标 物 为 4,1,6 - 三 氯 -2,3,6,3,4 - 五 乙 酰 基 蔗 糖 (4, 1, 6 -Trichloro-2, 3, 6, 3, 4 -Sucrose Pentaacetate,TOSPA) 并 且 在 0.02~1.2mg/mL 范 围 内 线 性 良 好 (r= ), 检 出 限 为 0.23 mg/kg, 回 收 率 在 90.0%~ 94.5%, 相 对 标 准 偏 差 (n=6) 为 0.6%~ 2.5% 该 方 法 操 作 简 单 干 扰 少 检 出 限 低 灵 敏 度 高 线 性 好 结 果 准 确, 能 很 好 的 满 足 饮 料 中 三 氯 蔗 糖 的 测 定 关 键 词 : 三 氯 蔗 糖 ; 乙 酸 酐 衍 生 ; 气 相 色 谱 仪 电 子 捕 获 器 (GC-ECD); 气 质 联 用 仪 (GC-MS) Determination of Sucralose in Drink by GC-ECD through Derivatization with Acetic Anhytride HUANG Zhiyong, CHEN Yan, FENG Hui, LI Chao, JING Zan (Leshan Institute for Food and Drug Control, Leshan , China) Abstract: A acetylation - gas chromatographic(gc)- electron capture detector(ecd) method was developed for the determination of sucralose in drink. The sample was diluted by water. Then the dilute solutions were derivated with the system of acetic anhytride and 1-Methylimidazole, and qualitative and quantitative analysis was achieved by GC MS and 1 GC ECD, respectively. The result showed that the derivative was 4, 1, 6 -Trichloro-2, 3, 6, 3, 4 -Sucrose Pentaacetate (TOSPA). The calibration curves showed good linearities in the range of mg /ml (r=0.9994). The limits of detection (LOD) for the sucralose was 0.23 mg /kg, the recoveries obtained by standard addition method were between 90.0% and 94.5%, the relative standard deviations (RSD, n=6) were between 0.6% and 2.5%. This method provides the advantages of low detection limit, high sensitivity, less disturbance, good linearity, high accuracy and simple operation. So this method can be applied in sucralose quality control testing in drink. Key words: sucralose; acetylation; gas chromatographic- electron capture detector(gc-ecd); gas chromatography - mass spectrometry (GC-MS) 中 图 分 类 号 : O657 文 献 标 志 码 :A 文 章 编 号 : 三 氯 蔗 糖 (4,1',6',- 三 氯 -4,1',6',- 三 脱 氧 半 乳 型 蔗 糖 ), 俗 称 蔗 糖 素 [1], 英 文 名 为 sucralose, 是 天 然 产 物 蔗 糖 的 氯 代 衍 生 物, 首 先 由 英 国 泰 莱 公 司 (Tate&Lyie) 与 伦 敦 大 学 合 作 研 究 小 组 成 功 合 成 因 其 具 有 甜 度 高 ( 甜 度 是 蔗 糖 甜 度 的 600 倍 ) 且 甜 味 纯 正, 稳 定 性 好, 热 值 低 ( 热 值 几 乎 为 零 ), 安 [2-4] 全 性 高 等 诸 多 优 点 而 被 视 为 是 一 种 较 理 想 的 新 型 甜 味 剂 5-6] [7] 但 也 有 三 氯 蔗 糖 可 诱 发 偏 头 疼 发 作 以 及 可 能 通 过 作 用 于 人 类 肠 道 中 的 细 菌, 从 而 加 重 代 谢 性 疾 病 病 情 的 报 道 [8] 三 氯 蔗 糖 作 为 食 品 添 加 剂 时 必 须 按 照 食 品 安 全 国 家 标 准 食 品 添 加 剂 使 用 标 准 中 规 定 的 范 围 和 限 量 使 用 [9] 目 前, 食 品 中 三 氯 蔗 糖 的 测 定 方 法 主 要 集 中 在 质 谱 联 用 法 (LC-MS) [10-12] 和 高 效 液 相 色 谱 的 柱 前 衍 生 紫 外 检 测 [13-14] [15-19], 蒸 发 光 散 射 检 测 和 示 差 折 光 检 测 [19-21], 但 采 用 蒸 发 光 散 射 检 测 器 其 重 现 性 还 不 够 理 想, 示 差 折 光 检 测 器 灵 敏 度 低, 不 能 进 行 梯 度 淋 洗, 达 不 到 良 好 的 分 离 效 果 而 对 于 实 验 室 仪 [22] [23] 器 普 及 率 很 高 的 气 相 色 谱 在 这 方 面 的 应 用 报 道 较 少 Qiu 等 和 Farhadi 等 报 道 了 非 食 品 中 的 三 氯 蔗 糖 在 吡 啶 溶 剂 中 进 行 三 甲 基 硅 烷 化 衍 生 后 气 相 色 谱 法 测 定, 都 获 得 了 不 错 的 结 果, 但 此 方 法 过 程 较 复 杂 且 对 无 水 条 件 要 求 较 高, 产 物 易 水 解 同 时 在 用 氢 火 焰 离 子 检 测 器 检 测 时 生 成 的 二 氧 化 硅 容 易 附 着 其 [24] [25] 电 极 上 对 检 测 器 造 成 污 染 本 文 采 用 廖 洪 梅 等 和 贺 永 惠 等 单 糖 的 乙 酰 化 方 法, 在 水 溶 液 中 以 1- 作 者 简 介 : 黄 志 勇 (1986 ), 男, 硕 士, 研 究 方 向 为 仪 器 分 析 与 食 品 质 量 控 制 huangzhy86@163.com 1
2 甲 基 咪 唑 为 催 化 剂, 乙 酸 酐 为 衍 生 化 试 剂, 直 接 对 三 氯 蔗 糖 进 行 衍 生, 并 利 用 气 相 色 谱 - 质 谱 (GC-MS) 仪 对 生 成 的 糖 醇 乙 酸 酯 衍 生 物 进 行 定 性 分 析, 并 利 用 三 氯 蔗 糖 中 含 有 氯 原 子 而 采 用 气 相 色 谱 电 子 捕 获 (GC-ECD) 对 其 进 行 定 量 测 定 该 方 法 操 作 简 单 干 扰 少 灵 敏 度 高 结 果 准 确 1 材 料 与 方 法 1.1 材 料 与 试 剂 三 氯 蔗 糖 (98%) 北 京 百 灵 威 科 技 有 限 公 司 ; 三 氯 甲 烷 ( 色 谱 纯 )MREDA TECHNOLOGY INC 美 国 ; 亚 铁 氰 化 钾 ( 分 析 纯 ) 乙 酸 锌 ( 分 析 纯 ) 乙 酸 酐 ( 分 析 纯 ) 成 都 长 征 化 学 试 剂 公 司 ;1- 甲 基 咪 唑 (99%) 成 都 化 夏 化 学 试 剂 有 限 公 司 ; 超 纯 水 ( 电 阻 率 :18.25 MΩ.cm) 1.2 仪 器 与 设 备 UPT-Ⅱ-10T 优 普 纯 水 机 成 都 超 纯 科 技 有 限 公 司 ; CP225D 双 量 程 电 子 天 平 德 国 赛 多 利 斯 公 司 ; GC-2010plus 岛 津 气 相 色 谱 仪 ( 配 ECD 检 测 器 ) 日 本 岛 津 公 司 ;GCMS-TQ8040 岛 津 气 相 色 谱 - 质 谱 联 用 仪 日 本 岛 津 公 司 1.3 方 法 标 准 品 的 衍 生 化 及 标 准 曲 线 的 绘 制 精 密 称 取 适 量 三 氯 蔗 糖 标 准 品 于 25mL 容 量 瓶 中, 加 水 溶 解, 并 定 容 至 刻 度, 摇 匀, 即 得 质 量 浓 度 为 10mg/mL 的 三 氯 蔗 糖 储 备 液 分 别 吸 取 三 氯 蔗 糖 储 备 液 mL 于 10mL 容 量 瓶 中, 各 加 水 稀 释 至 刻 度, 即 得 质 量 浓 度 为 mg/mL 的 标 准 系 列 溶 液 分 别 吸 取 0.5mL 标 准 系 列 溶 液 于 50mL 离 心 管 中, 加 入 冰 乙 酸 100µL, 混 匀, 再 加 入 0.5mL 1- 甲 基 咪 唑 和 5ml 乙 酸 酐, 混 匀,90 水 浴 反 应 1h, 冷 却 后 加 入 10ml 水, 分 解 乙 酸 酐 终 止 反 应, 加 入 2mL 三 氯 甲 烷, 充 分 振 摇 萃 取, 静 置 5min 后 取 下 层, 用 适 量 的 无 水 硫 酸 钠 干 燥 后 用 0.22µm 微 孔 膜 过 滤 后, 进 行 GC-ECD 分 析, 以 三 氯 蔗 糖 的 浓 度 为 横 坐 标, 峰 面 积 为 纵 坐 标 绘 制 标 准 曲 线 其 中 对 质 量 浓 度 为 0.01mg/mL 标 准 溶 液 同 时 进 行 GC-MS 分 析 亚 铁 氰 化 钾 溶 液 : 称 取 106g 亚 铁 氰 化 钾, 加 水 至 1000mL 乙 酸 锌 溶 液 : 称 取 220g 乙 酸 锌, 溶 于 少 量 水 中, 加 入 30mL 冰 醋 酸, 加 水 稀 释 至 1000mL 样 品 溶 液 制 备 与 分 析 准 确 称 取 混 匀 后 的 样 品 2.5g 于 25mL 容 量 瓶 中, 加 入 15mL 水 混 匀, 超 声 20min 提 取, 用 水 定 容 至 刻 度, 摇 匀 待 衍 生 注 : 对 于 含 蛋 白 质 较 多 的 样 品 则 加 入 亚 铁 氰 化 钾 溶 液 和 乙 酸 锌 溶 液 各 2.5mL 处 理 提 取 液, 沉 淀 蛋 白 质 按 法 衍 生 萃 取 过 滤 后 进 行 GC-ECD 分 析 标 准 品 和 样 品 衍 生 测 定 色 谱 条 件 色 谱 柱 :Rtx-5 石 英 毛 细 柱 (30 m 0.32 mm,0.25 µm); 进 样 口 温 度 :300 ; 检 测 器 温 度 :310 ; 升 温 程 序 :180 保 持 2 min, 以 20 /min 升 至 280, 保 持 12 min; 柱 流 量 为 2.08 ml/min; 不 分 流 进 样, 进 样 量 为 1.0 µl; 溶 剂 延 迟 5min 气 质 条 件 电 子 轰 击 离 子 源 ; 电 子 能 量 70eV; 离 子 源 温 度 200 ; 质 量 扫 描 范 围 m/z 50~700 色 谱 柱 :Rxi-5Sil MS (30 m 0.25 mm,0.25 µm); 进 样 口 柱 温 箱 温 度 均 与 气 相 条 件 一 致 色 谱 柱 流 量 为 0.83mL/min; 分 流 比 为 10, 进 样 量 为 1.0 µl; 溶 剂 延 迟 5min 2 结 果 与 分 析 2
3 2.1 气 质 联 用 分 析 在 本 文 选 用 的 气 质 条 件 下 得 到 的 离 子 碎 片 图 如 图 1 所 示 从 图 中 可 以 看 到, 没 有 出 现 TOSPA 的 分 子 离 子 峰 (m/z 607), 这 是 由 于 电 子 源 轰 击 能 量 为 70ev, 远 高 于 普 通 化 学 键 的 键 能, 容 易 产 生 碎 片 离 子, 加 之 目 标 物 本 身 具 有 多 碳 数 多 支 链 的 结 构 特 点, 导 致 分 子 离 子 峰 的 稳 定 性 下 降, 最 终 没 有 分 子 离 子 峰 的 出 现, 但 其 糖 苷 键 在 电 子 轰 击 下 断 裂 产 生 了 两 个 较 大 的 碎 片 离 子 m/z 283 m/z 307, 以 及 分 离 一 个 乙 酰 酯 基 后 得 到 的 碎 片 离 子 m/z 223 m/z 347 试 验 结 果 表 明, 该 方 法 获 得 三 氯 蔗 糖 衍 生 物 为 TOSPA % % / 度 丰 对 相 m/z 图 1 TOSPA 的 GC-MS 碎 片 离 子 图 谱 Fig.1 The GC-MS spectrum of TOSPA 2.2 标 准 曲 线 和 检 出 限 在 选 定 的 色 谱 条 件 下 进 行 测 定, 以 峰 面 积 对 三 氯 蔗 糖 标 准 溶 液 质 量 浓 度 作 校 正 曲 线 配 制 标 准 溶 液 质 量 浓 度 分 别 为 mg/mL, 其 线 性 方 程 为 y= x+69602,r=0.9994, 其 标 准 溶 液 的 色 谱 图 如 图 1 中 三 氯 蔗 糖 对 照 品 色 谱 图 所 示 将 按 节 前 处 理 的 加 标 样 品 稀 释 至 含 三 氯 蔗 糖 0.015mg/mL, 再 按 节 色 谱 条 件 进 行 测 定, 以 3 倍 信 噪 比 (R SN ) 计 算 该 方 法 的 检 出 限 为 0.23mg/kg 实 验 结 果 表 明, 该 方 法 在 0.02~1.2mg/mL 范 围 内 线 性 良 好, 检 出 限 较 低, 能 满 足 饮 料 中 三 氯 蔗 糖 含 量 测 定 的 要 求 图 1 三 氯 蔗 糖 对 照 品 阴 性 样 品 和 阴 性 加 标 样 品 的 色 谱 图 Fig.1 Chromatograms of Sucralose standard, snegative samples and Spiked negative samples 2.3 加 标 回 收 率 和 精 密 度 在 阴 性 果 蔬 饮 料 样 品 中 分 别 添 加 低 中 高 三 个 水 平 的 工 作 溶 液, 按 照 上 述 衍 生 和 色 谱 条 件 进 行 测 定, 每 个 浓 度 重 复 六 次, 色 谱 图 如 图 1 中 阴 性 样 品 和 阴 性 样 品 加 标 色 谱 图 所 示 回 收 率 结 果 见 表 1 3
4 所 示, 平 均 回 收 率 为 90.0% ~ 94.5%, 相 对 标 准 偏 差 (relative standard deviations,rsd) 为 0.6% ~ 2.5%, 证 实 该 方 法 的 准 确 度 与 精 密 度 都 较 高, 满 足 测 定 要 求 表 1 阴 性 样 品 的 加 标 回 收 率 和 相 对 标 准 偏 差 (n=6) Table 1 Spiked recovery and RSD of the negative samples (n=6) 添 加 量 / 平 均 测 得 值 / 平 均 回 收 率 /% 相 对 标 准 (mg/kg) (mg/kg) 偏 差 /% 结 论 本 实 验 针 对 饮 料 中 三 氯 蔗 糖 建 立 了 一 种 衍 生 GC-ECD 检 测 方 法 利 用 1- 甲 基 咪 唑 催 化, 在 水 溶 液 中 直 接 对 三 氯 蔗 糖 进 行 衍 生, 用 GC-MS 对 生 成 的 糖 醇 乙 酸 酯 衍 生 物 进 行 分 析, 确 定 其 衍 生 物 为 TOSPA, 用 GC-ECD 对 其 进 行 定 量 测 定 在 0.02~1.2 mg/ml 范 围 内 具 有 良 好 的 线 性 响 应 (r=0.9994), 方 法 检 出 限 为 0.23 mg/kg, 添 加 mg/kg 三 个 水 平 条 件 下 的 平 均 回 收 率 在 90.0%~94.5% 之 间,RSD 在 0.6% ~ 2.5% 之 间 该 方 法 具 有 操 作 简 单 干 扰 少 灵 敏 度 高 结 果 准 确 等 特 点, 适 用 于 饮 料 中 三 氯 蔗 糖 的 测 定 参 考 文 献 : [1] 凌 关 庭. 食 品 添 加 剂 手 册 [M]. 3 版. 北 京 : 化 学 工 业 出 版 社, 2003: [2] 张 玉, 吴 慧 明, 徐 丽 红, 等. 三 氯 蔗 糖 的 安 全 性 研 究 进 展 [J]. 食 品 工 业 科 技, 2011, 32(11): [3] 高 金 燕, 陈 红 兵. 三 氯 蔗 糖 在 无 糖 巧 克 力 和 口 香 糖 中 的 应 用 [J]. 食 品 工 业, 2004, 6(5): 5-6. [4] KNIGHT I. The development and applications of sucralose: a new high-intensity sweetener[j]. Canadian Journal of Physiology and Phar-macology, 1994, 72(4): doi: /y [5] 周 力. 三 氯 蔗 糖 的 生 产 与 应 用 [J]. 食 品 科 学, 1997, 18(8): [6] 胡 莉 蓉. 新 型 甜 味 剂 三 氯 蔗 糖 [J]. 化 工 时 刊,2005, 19(3): [7] BIGAL M E, KRYMCHANTOWSKI A V. Migraine triggered by sucralose-a case report[j]. Headache, 2006, 46(3): doi: /j x [8] SUEZ J, KOREM T, ZEEVI D, et al. Artificial sweeteners induce glucose intolerance by altering the gut microbiota[j]. Nature, 2014, 514(7521): doi: /nature [9] 中 华 人 民 共 和 国 卫 生 部. GB 食 品 安 全 国 家 标 准 食 品 添 加 剂 使 用 标 准 [S]. 北 京 : 中 国 标 准 出 版 社, [10] 倪 炜 华, 郑 丹. LC-MS 法 测 定 饮 料 中 的 三 氯 蔗 糖 [J]. 中 国 食 品 添 加 剂, 2011, 02: doi: /j.issn [11] 周 莉 莉, 杨 颖, 刘 艳 明, 等. 超 高 效 液 相 色 谱 - 串 联 质 谱 法 测 定 食 品 中 的 三 氯 蔗 糖 [J]. 分 析 测 试 学 报, 2011, 30(10): doi: /j.issn [12] KOYAMA M, YOSHIDA K, UCHIBORI N, et al. Analysis of nine kinds of sweeteners in foods by LC/MS[J]. Shokuhin Eiseigaku Zasshi, 2005, 46(3): doi: /j.jfda [13] Nojiri S, Nakazato M, Kasuya Y, et al. Determination of sucra-lose in foods by HPLC using pre-column derivatization[j]. Shokuhin Eiseigaku Zasshi, 2002, 43(5): [14] 陈 璐 莹, 刘 亚 攀, 冉 雪 琴 等. 紫 外 衍 生 - 高 效 液 相 色 谱 法 测 定 保 健 食 品 和 饮 料 中 的 三 氯 蔗 糖 [J]. 四 川 大 学 学 报 ( 医 学 版 ),2014, 45(5): doi: /j.scuxbyxb [15] 张 莉. 高 效 液 相 色 谱 法 测 定 饮 料 中 三 氯 蔗 糖 的 含 量 [J]. 中 国 卫 生 检 验 杂 志, 2007, 17(10): [16] 张 伟 清, 张 玉 婷, 曹 进 等. 酱 油 及 酱 制 品 中 三 氯 蔗 糖 的 测 定 [J]. 食 品 科 学, 2013, 28(20): doi: /spkx
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