27期

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1 中国农学通报 14,(27):299-3 Chinese Agricultural Science Bulletin 超高效液相色谱 - 串联质谱法测定猪肉中非甾体抗炎药残留量李娜, 张玉婷, 刘磊, 邵辉, 李辉, 李晶, 郭永泽 ( 天津市农业质量标准与检测技术研究所, 天津 0381) 摘要 : 研究建立了猪肉中美洛昔康氟尼辛卡洛芬和托芬那酸四种非甾体抗炎药残留量的超高效液相色谱 - 串联质谱 (UPLC-MS/MS) 检测方法样品中残留的药物经乙腈提取, 提取液浓缩后用乙腈 -0.1% 甲酸水溶液溶解, 正己烷液 - 液分配净化, 最后采用电喷雾串联质谱仪在正离子多反应监测扫描 (MRM) 模式下进行测定, 基质外标法定量四种药物在各自的线性范围内, 线性关系良好, 相关系数均为对猪肉中美洛昔康氟尼辛卡洛芬和托芬那酸在定量限 (LOQ) 2.5 倍定量限 (2.5 LOQ) 和 5 倍定量限 (5 LOQ) 三个添加浓度水平下的回收率进行测定, 其平均回收率在在 72.1% 和 87.3% 之间, 相对标准偏差在 2.8% 和 6.7% 之间美洛昔康氟尼辛卡洛芬和托芬那酸的定量限 (S/N 10) 分别为 80 和 µg/kg 该方法不使用固相萃取柱, 简化了操作步骤, 节约了检测成本, 灵敏度准确度和精密度均符合多残留检测技术的要求, 可为猪肉中非甾体抗炎药残留量的测定提供技术支持关键词 : 超高效液相色谱 - 串联质谱法 ; 猪肉 ; 非甾体抗炎药 ; 残留中图分类号 :S 文献标志码 :B 论文编号 : Determination of Non-steroidal Anti-inflammatory Drugs in Porcine Muscle by UPLC-MS/MS Method Li Na, Zhang Yuting, Liu Lei, Shao Hui, Li Hui, Li Jing, Guo Yongze (Tianjin Institute of Quality Standards and Testing Technology for Agricultural Products, Tianjin 0381) Abstract: An ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric method was developed for the determination of the four non steroidal anti- inflammatory drugs (Meloxicam, Flunixin, Carprofen and Tolfenamic Acid) in porcine muscle. The drugs were extracted with acetonitrile, then cleaned- up by liquidliquid extraction with n- hexane, and finally analyzed by ultra performance liquid chromatography- tandem mass spectrometry (UPLC- MS/MS) in multiple reaction monitoring (MRM) mode via positive electrospray ionization. The method was validated at three fortification levels (LOQ, 2.5LOQ and 5LOQ) in porcine muscle. The validation results were as follows: the correlation coefficients of the standard calibration curves for the four non- steroidal anti- inflammatory drugs all were over their own concentration range; the average recoveries of the four drugs were between 72.1% and 87.3%, with the relative standard deviation (RSD) between 2.8% and 6.7% ; the limits of quantification (S/N 10) of Meloxicam, Flunixin, Carprofen and Tolfenamic Acid were,, 80 and μg/kg. It was indicated that the method developed in this study is cheap,easy and has a good purification effect. The sensitivity, accuracy and precision of the method were all acceptable, and it can meet the requirements of the multiple residue analysis. So, this method can be further 基金项目 : 天津市农业科学院院长基金 (11003) 第一作者简介 : 李娜, 女,1984 年出生, 助理研究员, 硕士, 从事兽药残留分析研究通信地址 :0381 天津市西青区津静公路 17 公里处华达路生物中心三楼,Tel: , lina153@126.com 通讯作者 : 郭永泽, 男,1971 年出生, 河北赵县人, 研究员, 硕士, 研究方向为农产品质量安全监测及风险评估通信地址 :0381 天津市西青区津静公路 17 公里处华达路生物中心三楼,Tel: , yongzeguo@126.com 收稿日期 : , 修回日期 :14-4-

2 0 中国农学通报 applied to investigate the anti-inflammatory residue status in porcine muscle. Key words: Ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry; porcine muscle; nonsteroidal anti-inflammatory drugs; residue 0 引言非甾体抗炎药 (non- steroidal anti- inflammatory drugs) 是一类不含有甾体结构的抗炎药, 其主要通过与环氧化酶结合, 阻断花生四烯酸转化为前列腺素, 从而发挥抗炎和解热镇痛作用, 临床上广泛用于哺乳动物乳腺炎子宫炎关节炎的治疗及各种发热和疼痛症状的缓解由于疗效显著, 目前已成为用量最多的兽药种类之一非甾体抗炎药在养殖业中应用越来越广泛的同时, 其在动物组织中的残留对消费者产生的健康危害也引起了食品安全监管部门的高度重视美国欧盟日本等发达国家均已开始对动物源性食品中的非甾体抗炎药进行残留监控, 欧盟和日本明确规定了美洛昔康氟尼辛卡洛芬和托芬那酸的最大残留限量 (MRLs), 其中猪肉中 4 种药的 MRLs 值分别是 ( 日本 :10) 和 50( 日本 :)µg/kg 目前非甾体抗炎药的检测方法有液相色谱法液相色谱 - 串联质谱法气相色谱 - 质谱法毛细管电泳法和薄层色谱法等 [1], 主要是对药物制剂含量和血液尿液中非甾体抗炎药残留量的测定, 但对其在动物性食品中残留量的检测方法报道较少, 液相色谱 - 串联质谱法因具有高灵敏度和高选择性的优势, 成为复杂的动物组织样品中非甾体抗炎药残留检测的主流方法 [2-5] [2] Igualada C. 等采用盐酸水解, 乙酸乙酯萃取, 液相色谱 - 离子阱质谱联用仪测定动物组织中美洛昔康氟尼辛卡洛芬和托芬那酸 4 种非甾体抗炎药,4 种药的检出限在 16~1193 µg/kg 之间, 回收率在 82%~102% 之 [3] 间 Malone E. M. 等建立了牛奶中地塞米松倍他米松等 3 种甾体类激素和美洛昔康托芬那酸等 4 种非甾体抗炎药残留量的液相色谱 - 串联质谱检测方法, 样品采用乙腈提取, 正己烷液 - 液萃取净化, 其中非甾体抗炎药的检出限在 16.64~72.78 µg/kg 之间 Hoof N. V. [4] 等采用液相色谱 - 串联离子阱质谱法测定牛肉中 6 种非甾体抗炎药残留量, 样品经乙腈提取 HLB 固相萃取柱净化, 水杨酸氟尼辛美洛昔康和托芬那酸的检测 [5] 限分别为和 68.2 µg/kg 彭涛等采用酸化乙腈提取, 硅胶固相萃取柱净化, 超高效液相色谱 - 串联四极杆质谱仪检测猪肝中 18 种非甾体抗炎药残留量虽然上述检测方法都达到了多残留检测的目的, 灵敏度也能满足要求, 但是样品前处理过程多使用固相萃取柱净化, 操作繁琐, 检测成本也较高, 对质监部门实用性较差研究从质检部门的实际需要出发, 针对欧盟日本有 MRLs 值规定的 4 种非甾体抗炎药, 建立猪肉中美洛昔康氟尼辛卡洛芬和托芬那酸残留量的超高效液相色谱 - 串联四极杆质谱检测方法, 前处理过程中不使用固相萃取柱, 简化了操作步骤, 节约了检测成本, 适合各食品检测机构对出口欧盟日本的动物性食品进行非甾体抗炎药监控 1 材料与方法 1.1 仪器与试剂 Acquity TM UPLC 超高效液相色谱仪,Quattro Premier XE 三重四极杆质谱仪 ( 配电喷雾离子源 ),( 美国 Waters 公司 ); 旋涡混合器 (QL-901, 江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司 ); 台式高速离心机 (H1650, 湘仪离心机仪器有限公司 ); 旋转蒸发仪 (Laborota 00 efficient, 德国 Heidolph);Milli- Q 超纯水仪 ( 美国 Millipore 公司 ) 等美洛昔康氟尼辛托芬那酸和卡洛芬标准品, 纯度均不低于 99%, 购自德国 Dr. Ehrenstorfer GmbH 公司 ; 乙腈甲酸为色谱纯, 购自美国 Fisher 公司 ; 水为超纯水 ; 正己烷, 无水硫酸钠为分析纯, 购自天津科密欧化学试剂有限公司分别称取各标准品适量, 用乙腈溶解并定容, 配制成美洛昔康氟尼辛托芬那酸和卡洛芬浓度分别为和 1000 µg/ml 的标准储备液, 于 4 条件下保存分别吸取美洛昔康氟尼辛托芬那酸和卡洛芬标准储备液和 5.0 ml 于 50 ml 容量瓶, 用乙腈稀释并定容, 配制成浓度分别为和 100 µg/ml 的混合标准工作液 1.2 样品前处理方法称取试样 5.00 g( 精确至 0.01 g) 于 50 ml 聚丙烯塑料离心管中, 加 4 g 无水硫酸钠, 用玻璃棒搅匀, 加入 15 ml 乙腈, 于旋涡混合器上涡旋 1 min,00 r/min 离心 5 min, 取上清液于蒸发瓶中残渣用 15 ml 乙腈重复提取一次, 涡旋 1 min,00 r/min 离心 5 min, 合并两次上清液, 加 5 ml 异丙醇, 在 45 条件下于旋转蒸发仪上蒸干, 残渣先加 1 ml 乙腈, 超声溶解, 再加 1 ml 0.1% 甲酸水溶液, 涡旋 1 min, 充分溶解, 然后加 3 ml 乙腈饱和的正己烷, 涡旋 s, 转移至 10 ml 离心管

3 李娜等 : 超高效液相色谱 - 串联质谱法测定猪肉中非甾体抗炎药残留量 1 中,00 r/min 离心 5 min, 取下层液体过 2 µm 滤膜 1.3 色谱条件色谱柱 :Acquity TM BEH C18 柱 (2.1 mm 50 mm, 1.7 μm); 流动相 :A 相 : 乙腈 ;B 相 :0.1% 甲酸水溶液 ; 梯度洗脱条件见表 1 进样量 :10 μl; 柱温 : 表 1 梯度洗脱条件时间 /min Initial 4 5 流速 /(ml/min) A/% 90 B/% 曲线 Initial 质谱条件电离模式 : 电喷雾正离子 ESI(+); 毛细管电压 : 3.0 kv; 离子源温度 :110 ; 脱溶剂气温度 :380 ; 脱溶剂气流量 :550 L/h; 锥孔反吹气流量 :50 L/h; 检测方式 : 多反应监测扫描模式 (MRM); 质谱采集参数见表 2 2 结果与分析 2.1 仪器条件的优化质谱条件在电喷雾正离子模式下分别对 1 µg/ml 的单个标准溶液进行全扫描, 得到每种农药的分子离子, 然后以其为母离子, 对子离子进行二级质谱全扫描, 选择信号强度较大的两个碎片离子为特征离子, 并优化得到每种农药的母离子和子离子所需的最佳锥孔表 2 4 种非甾体抗炎药的质谱检测条件名称保留时间 /min 定性离子对 /(m/z) 定量离子对 /(m/z) 锥孔电压 /V 碰撞能量 /V 美洛昔康 > > > 氟尼辛 > > > 卡洛芬 > > > 托芬那酸 > > > 电压和碰撞能量, 最后以多反应监测模式进行扫描优化得到的质谱参数见表液相色谱条件分别采用甲醇 - 水和乙腈 - 水作为流动相, 并加入 0.1% 甲酸提高离子化效率, 摸索不同的流动相比例, 研究 4 种药物的最佳分离条件结果表明, 相同比例下乙腈比甲醇洗脱能力强, 所得色谱峰更尖锐, 响应信号更强, 因此选择乙腈为有机相经过反复试验, 确定最佳的梯度洗脱条件 : 在 ml/min 的流速下,0~4 min, 乙腈从 % 匀速变化至 90% ;4~ 5 min, 乙腈保持 %, 具体的液相色谱条件见 1.3 节在此条件下,4 种药物能够完全分离, 且峰形良好, 整个分析过程在 5 min 之内即可完成 LOQ 浓度水平猪肉加标样品中 4 种非甾体抗炎药的总离子流图和 MRM 色谱图见图 1 和图 2 图 1 LOQ 浓度水平猪肉加标样品的总离子流色谱图

4 2 中国农学通报美洛昔康美洛昔康氟尼辛氟尼辛卡洛芬卡洛芬托芬那酸托芬那酸图 2 LOQ 浓度水平猪肉加标样品 4 种非甾体抗炎药的多反应监测色谱图 2.2 复溶液的选择对于超高效液相色谱 - 串联质谱而言, 复溶液很关键, 其对目标物的色谱峰形影响很大纯乙腈或纯甲醇溶解的样品, 因目标物不能在色谱柱上很好的保留就被洗脱下来, 常表现为色谱峰前延, 变宽, 不对称在复溶液中加入少量水相, 可有效改善峰形本实验以各种不同比例的乙腈 -0.1% 甲酸水作为复溶液进行比较研究结果表明, 当乙腈和 0.1% 甲酸的比例为 1:1 时,4 种药物峰形良好, 尖锐对称此外, 卡洛芬和托芬那酸的回收率取决于复溶液中乙腈比例的大小当乙腈比例较小时, 卡洛芬和托芬那酸几乎没有回收 ; 即使加乙腈 -0.1% 甲酸水 (1+1, v/v) 直接溶解, 卡洛芬和托芬那酸依然没有回收本实验采用先加 1 ml 乙腈充分溶解后, 再加 1 ml0.1% 甲酸水溶解的方法,4 种药物的回收率都有明显提高因此, 研究最终采用乙腈 -0.1% 甲酸水 (1+1, v/v) 作为复溶液, 但必须先加乙腈充分溶解后再加 0.1% 甲酸水溶解 2.3 样品前处理条件的优化 [2] 据文献报道, 常用的提取溶剂有酸化乙腈, 乙酸

5 李娜等 : 超高效液相色谱 - 串联质谱法测定猪肉中非甾体抗炎药残留量 3 表 3 4 种非甾体抗炎药的标准曲线相关系数回收率及相对标准偏差 (n=5) 名称线性范围 / (µg/l) 标准曲线 r 相关系数 LOD 检出限 / LOQ 定量限 / 添加浓度 / 平均回收率 /% RSD/% 美洛昔康 0.8~ Y= x 氟尼辛 0.8~ Y= x 卡洛芬 ~0 Y= x 托芬那酸 4.0~ Y= x [3] [4-5] 乙酯和乙腈, 非甾体抗炎药大多属于酸性或中性药物, 因此, 在酸性条件下更易溶于有机溶剂但研究涉及的 4 种非甾体抗炎药用乙腈提取, 也能获得很好的提取效率由于猪肉样品中含有少量水分, 提取液在旋蒸过程中会起泡沫而且不易蒸干, 研究采用提取前在样品中加无水硫酸钠除水, 旋蒸前在提取液中加异丙醇的方法, 有效改善了因提取液起泡导致的回收率损失的问题此外, 研究采用正己烷液 - 液分配除脂的净化方法 [2] [5] 代替硅胶柱 HLB 柱等固相萃取柱净化, 同样取得了良好的净化效果样品提取液浓缩乙腈 -0.1% 甲酸水 (1+1, v/v) 定容后, 与饱和正己烷液 - 液分配除脂, 取下层水相过膜后直接进样, 既简化了前处理步骤, 又节约了检测成本, 为各食品检测机构提供了多快好省的检测方法 2.4 方法的线性灵敏度准确度和精密度为了消除基质效应, 本实验用基质匹配标准工作溶液绘制标准曲线以各组分的浓度为横坐标, 峰面积为纵坐标, 线性方程和相关系数见表 3 结果表明, 4 种非甾体抗炎药在各自的浓度范围内, 线性关系良好, 相关系数均为以信噪比大于 3 计算方法的检出限, 以信噪比大于等于 10 确定方法的定量限, 美洛昔康氟尼辛卡洛芬和托芬那酸的定量限分别为 80 和 µg/kg 在 LOQ 2.5 LOQ 和 5 LOQ 三个浓度水平做加标回收试验, 每个浓度水平做 5 个平行样品, 按照上述方法进行提取净化和测定在这三个加标浓度水平,4 种非甾体抗炎药在猪肉中的平均回收率和相对标准偏差 (RSD) 均列于表 3 中 4 种非甾体抗炎药在猪肉中的平均回收率在 72.1% 和 87.3% 之间, 相对标准偏差在 2.8% 和 6.7% 之间, 符合多残留分析的要求 3 结论研究建立了猪肉中美洛昔康氟尼辛卡洛芬和托芬那酸四种非甾体抗炎药残留量的 UPLC-MS/MS 检测方法, 分别对样品处理条件液相色谱和质谱条件进行了摸索与现有文献报道的方法相比, 本方法前处理步骤更简单, 不使用固相萃取柱净化, 检测成本更低该方法操作简便, 净化效果好, 灵敏度高, 准确度和精密度均符合多残留检测技术的要求, 满足各食品检测机构的实际需要, 适用于出口欧盟日本的动物性食品中非甾体抗炎药的日常监控参考文献 [1] 胡婷, 彭涛, 邓晓军, 等. 非甾体抗炎药残留检测方法研究进展 [J]. 中国兽药杂志,10,44(8): [2] Carmen Igualada, Francisco Moragues, Jorge Pitarch. Rapid Method for the Determination of Non- steroidal Anti- inflammatory Drugs in Animal Tissue by Liquid Chromatography- Mass Spectrometry with Ion- trap Detector[J]. Analytica Chimica Acta, 07,586: [3] Malone E M, Dowling G, Elliott C T, et al. Development of a Rapid, Multi- class Method for the Confirmatory Analysis of Antiinflammatory Drugs in Bovine Milk Using Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry [J]. Journal of Chromatography A,09, 1216: [4] Hoof N V, Wasch K D, Poelmans S, et al. Multi- residue Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry Method for the Detection of Non- steroidal Anti- inflammatory Drugs in Bovine Muscle: Optimization of Ion Trap Parameters[J]. Rapid Communication in Mass Spectrometry,04,18: [5] 彭涛, 于静, 严矛, 等. 超高效液相色谱 - 电喷雾串联质谱法同时测定猪肝中非甾体类抗炎药残留 [J]. 分析化学,09,37(3):

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