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秃潘
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1 2016 年 1 月 Vol.34 No.1 January 2016 Chinese Journal of Chromatography 103 ~ 107 色谱手性分离专刊研究论文 DOI: / SP.J 基于离子液体促进的手性配体交换毛细管电泳法分离分析去氧肾上腺素光学异构体杨四梅, 张佳瑶, 李菲, 胡旭芳, 曹秋娥 ( 云南大学化学科学与工程学院, 教育部自然资源药物化学重点实验室, 云南昆明 ) 摘要 : 基于非手性离子液体对手性配体交换的促进作用, 建立了一种测定去氧肾上腺素手性异构体的毛细管电泳分离分析方法在系统优化了电泳条件后, 采用 20 kv 的分离电压 25 的毛细管柱温 254 nm 的检测波长以及 5 s 的压力 (3 447 Pa) 进样时间, 在添加 4 0 mmol / L Cu(Ⅱ) 8 0 mmol / L L 脯氨酸 ( L Pro) 和 15 mmol / L 氯化 1 丁基 3 甲基咪唑 ([BMIM]Cl) 的 20 mmol / L Tris H 3 缓冲溶液 (ph 5 4) 中,R 去氧肾上腺素和 S 去氧肾上腺素的分离度为 1 42, 峰面积与质量浓度分别在 12 5 ~ mg / L 和 15 0 ~ mg / L 范围内有线性关系将该方法用于加标血液和尿液样品中 R 和 S 型去氧肾上腺素的测定, 尿液中的加标回收率为 93 7% ~ 108 2%, 相对标准偏差在 3 18% (n = 3) 以内 ; 血液中的加标回收率为 91 4% ~ 113 1%, 相对标准偏差在 4 82% (n = 3) 以内关键词 : 毛细管电泳 ; 手性配体交换 ; 离子液体 ; 去氧肾上腺素 ; 光学异构体 ; 手性分离中图分类号 :O658 文献标识码 :A 文章编号 : (2016) Separation and determination of optical isomers of phenylephrine by chiral ligand exchange capillary electrophoresis coupling with the promoting effect of ionic liquid YANG Simei, ZHANG Jiayao, LI Fei, HU Xufang, CAO Qiue (Key Laboratory of Medicinal Chemistry for Nature Resource, Ministry of Education, School of Chemical Science and Technology, Yunnan University, Kunming , China) Abstract: A method for the separation and determination of optical isomers of phenylephrine was developed based on the promoting effect of non chiral ionic liquid on chiral ligand exchange capillary electrophoresis after the electrophoretic parameters were optimized system atically. R phenylephrine and S phenylephrine can be separated and determined effectively in 20 mmol / L Tris H 3 buffer solution (ph 5 4) composed of 4 0 mmol / L Cu(Ⅱ), 8 0 mmol / L L proline ( L Pro) and 15 mmol / L 1 butyl 3 methylimidazolium chloride ([ BMIM] Cl) with the applied voltage of 20 kv, capillary temperature of 25, detection wavelength of 254 nm, and injection of 5 s at Pa. The resolution of R and S phenylephrines was The linear ran ges for the determination of R phenylephrine and S phenylephrine were mg / L and mg / L, respectively. The method has been satisfactorily used for the determination of R phenylephrine and S phenylephrine in the spiked blood and urine samples. The spiked recov eries in the urine sample were in the range of 93 7% % with the RSDs lower than 3 18% (n = 3), and the spiked recoveries in the blood sample were in the range of 91 4% and 113 1% with the RSDs lower than 4 82% (n = 3). Key words: capillary electrophoresis; chiral ligand exchange; ionic liquid; phenylephrine; optical isomers; chiral separation 收稿日期 : 通讯联系人.Tel:(0871) ,E mail:qecao@ ynu.edu.cn. 基金项目 : 国家自然科学基金项目 ( ). Foundation item: National Natural Science Foundation of China ( No ).

手性离子液体对手性配体交换的促进作用, 建立了一种测定去氧肾上腺素手性异构体的毛细管电泳分离分析方法在系统优化了电泳条件后, 采用 20 kv 的分离电压 25 的毛细管柱温 254 nm 的检测波长以及 5 s 的压力 (3 447 Pa) 进

2 104 色谱第 34 卷 [1] 手性配体交换毛细管电泳始于 Gassmann 等用 Cu(Ⅱ) L 组氨酸配合物为添加剂分离丹酰化氨基酸对映体, 其分离识别机理一般认为是分析对象与金属手性配合物中的部分手性配体发生了配体交换作用并形成三元配合物, 而具有不同构象的异构体分子形成的三元配合物的稳定性存在差异, 从而得到分离目前, 手性配体交换毛细管电泳已成为分离手性化合物的重要电泳模式之一, 并在氨基酸羟基酸等对映体的分离分析中受到了人们的高度重视 [2-7], 但用其分离其他类型的药物对映体的研究报道较少而且金属配合物体系容易吸附在毛细管内壁上, 导致多数方法的重现性不够理想, 难以用于定量测定离子液体一般由有机阳离子和无机阴离子组成, 其阳离子部分能在毛细管内壁发生吸附作用, 这不仅可以改变毛细管内壁的电荷情况, 改善分离, 而且吸附在毛细管内壁上的离子液体与组分分子的相互作用也能对分离产生促进作用因此, 近年来将离子液体作为毛细管电泳的添加剂来改善分离尤其是改善环糊精对手性药物的分离得到了广泛关注 [8-13] 去氧肾上腺素为人工合成拟肾上腺素药, 在临床上不仅常用于治疗感染中毒性及过敏性休克心搏骤停支气管哮喘等, 还可用于治疗感冒的复方制剂中, 以缓解感冒引起的发热头痛鼻塞全身酸痛等症状去氧肾上腺素具有左旋 ( R 构型 ) 和右旋 ( S 构型 ) 两种光学异构体, 其中 R 构型为光学活性体, S 构型为无效异构体因此控制产品中 S 构型的含量对于该药物的疗效至关重要目前报道的分离分析去氧肾上腺素光学异构体的方法主要是手性色谱法 [14], 基本未见毛细管电泳法本文采用手性配体交换毛细管电泳法, 以离子液体为添加剂, 对去氧肾上腺素手性对映体进行了分离分析结果表明, 将氯化 1 丁基 3 甲基咪唑 ([ BMIM] Cl) 添加到含有 Cu(Ⅱ) 与 L 脯氨酸手性配合物的电解质溶液中后, 原本重叠严重的去氧肾上腺素手性对映体的电泳峰实现了有效分离, 这不仅证明了 [ BMIM ] Cl 对 Cu(Ⅱ) 与 L 脯氨酸手性配合物体系电泳分离去氧肾上腺素手性对映体有促进作用, 而且据此现象建立的分离分析去氧肾上腺素光学异构体的毛细管电 [14] 泳法与文献报道的色谱法相比, 具有简单快速, 能准确定量的优点 1 实验部分 1.1 主要仪器与试剂 P / ACE TM MDQ 型高效毛细管电泳仪带二极管阵列紫外检测器 ( 美国 Beckman Coulter 公司 ), 数据处理采用 32Karat 软件 ; 未涂层石英毛细管 (57 cm 75 μm, 有效长度 50 cm; 河北省永年锐沣色谱器件有限公司 ) 标准品 R 去氧肾上腺素和去氧肾上腺素外消旋体盐酸盐购于美国 Sigma 公司 ;L 苯丙氨酸 ( L Phe) L 组氨酸 (L His) L 脯氨酸 (L Pro) L 色氨酸 (L Trp) L 赖氨酸 (L Lys) L 亮氨酸 ( L Leu) 购自上海华美生物工程公司 ;[ BMIM] Cl 购于上海迈瑞尔化学技术有限公司实验用试剂除特别说明外均为分析纯, 水为高纯水 1.2 溶液配制标准溶液 :R 去氧肾上腺素和去氧肾上腺素外消旋体标准储备溶液均用水配制,4 下保存 ; 工作溶液由储备溶液用水稀释得到样品溶液 : 将取自健康人的尿样与血样 ( 云南大学校医院 ) 以及加标后的尿样与血样在 r / min 下离心 10 min, 上清液用 0 45 μm 滤膜过滤后直接进样分析 1.3 HPCE 的条件与方法运行电解质溶液为含有 4 0 mmol / L Cu(Ⅱ) 8 0 mmol / L L Pro 15 0 mmol / L [BMIM]Cl 的 20 mmol / L Tris H 3 缓冲溶液 (ph 5 4), 使用前用 0 45 μm 滤膜过滤 ; 分离电压为 20 kv, 柱温为 25, 检测波长为 254 nm, 采用压力 (3 447 Pa) 进样 5 0 s 为了确保重现性, 毛细管柱每天在运行前和两次运行间依次用 0 1 mmol / L NaOH 溶液水和运行电解质溶液各冲洗 5 min 2 结果与讨论基于去氧肾上腺素分子中的相邻位置上含有一个 -OH 基及一个 N 原子, 具有与 Cu( Ⅱ) 配位的能力, 而且其中的 -OH 基还处于手性 C 原子上, 其与 Cu(Ⅱ) 配位的能力随光学结构的不同会有所不同, 因此拟采用手性配体交换原理实现去氧肾上腺素外消旋体的分离为此, 实验首先在无其他添加剂的情况下, 研究了以手性配体交换毛细管电泳中常用的几种氨基酸 (L Phe L His L Pro L Trp L Lys 以及 L Leu) 与 Cu( Ⅱ) 的配合物为手性选择剂, 对去氧肾上腺素外消旋体进行分离结果表明, 在上述手性配合物存在下, 虽经多方案优化电泳条件, 去氧肾上腺素外消旋体都没有得到基本分离考虑到离子液体在电泳中对分离尤其对环糊精分离手性药物的改善作用, 实验尝试了在手性配体交换基础上, 引

视 [2-7], 但用其分离其他类型的药物对映体的研究报道较少而且金属配合物体系容易吸附在毛细管内壁上, 导致多数方法的重现性不够理想, 难以用于定量测定离子液体一般由有机阳离子和无机阴离子组成, 其阳离子部分能在毛细

3 第 1 期杨四梅, 等 : 基于离子液体促进的手性配体交换毛细管电泳法分离分析去氧肾上腺素光学异构体 105 入离子液体作为添加剂, 利用离子液体对手性配体交换的促进作用, 达到对去氧肾上腺素外消旋体分离的目的 2.1 配体种类配合物组成比例及浓度的影响选择了简单易得且溶解性好的咪唑类离子液体 [BMIM]Cl 为添加剂, 在含有 10 mmol / L [ BMIM] Cl 的 20 mmol / L Tris H 3 缓冲溶液 (ph 5 0) 中添加 3 0 mmol / L 的 Cu( Ⅱ) 以及 6 0 mmol / L 氨基酸 (L Pro L Trp L Phe L His L Lys 及 L Leu), 研究了不同的手性配体对分离与检测的影响结果表明, 添加 L Lys 和 L Leu 与 Cu(Ⅱ) 的配合物对去氧肾上腺素外消旋体的分离基本没有作用, 但添加其余 4 种手性氨基酸与 Cu( Ⅱ) 的配合物可以使去氧肾上腺素外消旋体得到一定程度的分离, 其中以加入 L Pro 与 Cu(Ⅱ) 的配合物得到的分离度最大, 为 1 02 因此, 实验选择 L Pro 与 Cu( Ⅱ) 的配合物作为分离去氧肾上腺素外消旋体的手性选择剂, 并进一步研究了 L Pro 与 Cu(Ⅱ) 的加入比例以及浓度对分离的影响固定电解质溶液中 Cu ( Ⅱ) 的浓度为 3 0 mmol / L, 依次加入不同浓度的 L Pro, 组成 L Pro 与 Cu(Ⅱ) 的物质的量比依次为及 4 1 的配合物体系, 考察了 L Pro 与 Cu(Ⅱ) 的比例对去氧肾上腺素外消旋体分离的影响图 1a 的结果表明, 去氧肾上腺素外消旋体的分离度随 L Pro 与 Cu(Ⅱ) 加入比例的增加先增大后减小, 当加入的物质的量比为 2 1 时, 具有最大的分离度保持 L Pro 与 Cu(Ⅱ) 的物质的量比为 2 1 不变, 在 1 0 ~ 6 0 mol / L 配合物浓度范围内, 研究了配合物 Cu(L Pro) 2 的浓度对分离的影响随着配合物浓度的增加, 去氧肾上腺素外消旋体的分离度有所提高 ( 见图 1b), 但组分的迁移时间有所延长, 基线噪声增加, 检测灵敏度下降这是因为随着配合物浓度的增加, 电解质溶液的离子强度以及背景吸收都会增加综合考虑分离度分析时间检测灵敏度以及基线噪声, 选择 4 0 mmol / L Cu( L Pro) 2 为分离去氧肾上腺素外消旋体的手性选择剂 2.2 电解质溶液的 ph 以及缓冲溶液浓度的影响在固定电解质溶液中 Cu( L Pro) 2 的浓度为 4 0 mmol / L 以及 Tris 浓度为 20 mmol / L 条件下, 用 H 3 溶液在 ph 3 5 ~ 8 0 范围内调节电解质溶液的 ph, 试验了 ph 值对分离的影响结果表明, 随着电解质溶液 ph 的增加, 去氧肾上腺素两个光学异构体的迁移时间均先缩短后增长, 分离度则先增加后降低 ( 见图 2) 当 ph 为 5 4 时, 去氧肾上腺图 1 (a)l 脯氨酸 (L Pro) 与 Cu(Ⅱ) 的物质的量比及 (b)cu(l Pro) 2 的浓度对去氧肾上腺素光学异构体分离度的影响 Fig. 1 Effects of (a) the mole ratio of L proline (L Pro) to Cu(Ⅱ) and (b) concentration of Cu(L Pro) 2 on the resolution for the separation of the optical i somers of phenylephrine 素异构体的分离度具有最大值, 而且迁移时间较短这可能是因为随着电解质溶液 ph 的增加, 一方面毛细管内壁带负电荷的程度增加, 电渗流增加 ; 另一方面去氧肾上腺素的酚羟基的电离能力也随之增强, 迁移速度下降, 因此去氧肾上腺素异构体的迁移时间随溶液 ph 的变化有最小值此外, 在电解质溶液的 ph 较低时,Cu(Ⅱ) 与 L Pro 之间难以形成稳定的配合物, 因此对去氧肾上腺素异构体的分离能力较差 ; 而当 ph 较高时,Cu(Ⅱ) 与 L Pro 形成的配合物可能过于稳定, 从而难以被去氧肾上腺素异构体置换, 因此分离度也不高实验最终选择电解质溶液的 ph 值为 5 4 缓冲溶液的浓度对分离有一定的影响在 10 ~ 50 mmol / L 范围内, 随着缓冲溶液浓度的增加, 组分的分离度变化不明显, 但迁移时间和基线噪声特别是基线噪声有所增加因此, 实验选用 20 mmol / L Tris H 3 (ph 5 4) 为分离缓冲体系 2.3 [BMIM]Cl 浓度的影响图 3 是电解质溶液中离子液体 [BMIM]Cl 的浓度对去氧肾上腺素异构体迁移时间的影响可见,

mmol / L 氨基酸 (L Pro L Trp L Phe L His L Lys 及 L Leu), 研究了不同的手性配体对分离与检测的影响结果表明, 添加 L Lys 和 L Leu 与 Cu(Ⅱ) 的配合物对去氧肾上腺素外消旋体的分离基本没有作用, 但添加其余 4 种手性氨基

4 106 色谱第 34 卷图 2 电解质溶液的 ph 值对 R 去氧肾上腺素和 S 去氧肾上腺素迁移时间的影响 Fig. 2 Effect of the ph value of electrolyte solution on the migration times of R phenylephrine and S phenylephrine 在没有 [BMIM]Cl 存在时, 两组分重叠严重, 基本上没有得到分离随着 [ BMIM] Cl 的浓度在 5 ~ 20 mmol / L 范围内不断增加, 两组分的迁移时间和分离度均增加但当离子液体的浓度超过 15 mmol / L 以后, 基线噪声明显增大, 而且峰形有所展宽这可能是因为随着 [ BMIM] Cl 浓度的增加, 不仅电解质溶液的离子强度增加, 而且离子液体带正电荷的部分在毛细管内壁上的吸附量增加, 因此电渗流降低, 组分迁移时间延长, 基线噪声增大同时, 随着离子液体浓度的增加, 其与被分离物之间的相互作用增加, 因此分离度增加综合考虑, 选择 [BMIM]Cl 的浓度为 15 mmol / L 图 3 氯化 1 丁基 3 甲基咪唑 ([BMIM]Cl) 浓度对 R 去氧肾上腺素和 S 去氧肾上腺素迁移时间的影响 Fig. 3 Effect of the concentration of 1 butyl 3 methylimidazolium chloride ([ BMIM ] Cl) on the migration times of R pheny lephrine and S phenylephrine 2.4 电压柱温和进样时间的影响在上述选定的电解质溶液中, 研究了分离电压柱温和进样时间对去氧肾上腺素光学异构体分离的影响结果表明, 随着分离电压和毛细管柱温的增加, 去氧肾上腺素两个光学异构体的迁移时间均不断缩短, 分离度下降, 而且当电压达到 25 kv( 柱温为 25 ) 或柱温达到 30 ( 电压为 20 kv) 以上时, 基线噪声明显, 容易出现断流现象组分的检测灵敏度随着进样时间 ( 进样压力为 Pa) 的增加而增大, 但组分的峰形在进样时间大于 5 s 后逐渐展宽, 分离度下降实验选用了分离电压为 20 kv, 毛细管柱温为 25, 在 Pa 压力下进样 5 0 s 图 4 为在上述选定的电泳条件下得到的去氧肾上腺素外消旋体及加标血清样品的代表性电泳图可见, 在此条件下, 去氧肾上腺素的两个光学异构体不管是在标准溶液还是血清样品中都得到了有效分离图 4 (a) 空白血样 (b) 加标血样以及 (c) 去氧肾上腺素外消旋体标准溶液的电泳图 Fig. 4 Electropherograms of ( a) a blank blood sample, (b) the blood spiked with phenylephrine raceme and ( c) the standard solution of phenylephrine raceme Separation conditions: running buffer, 20 mmol / L Tris H 3 buffer (ph 5 4) composed of 4 0 mmol / L Cu(Ⅱ), 8 0 mmol / L L Pro and 15 mmol / L [BMIM] Cl; applied voltage, 20 kv; capillary temperature, 25 ; detection wavelength, 254 nm; injection, 5 s at Pa. Peaks: 1. R phenylephrine; 2. S phenylephrine. 2.5 工作曲线和方法的精密度在优化后的实验条件下, 首先对一系列不同浓度的 R 去氧肾上腺素标准溶液进行电泳分析, 得到了 R 去氧肾上腺素的工作曲线, 然后用该工作曲线求得去氧肾上腺素外消旋体标准溶液中 R 去氧肾上腺素的浓度, 再用总浓度差减后求得外消旋体标准溶液中 S 去氧肾上腺素的浓度, 并由此得到了 S 去氧肾上腺素的工作曲线同时, 实验还对 100 mg / L 的外消旋体标准溶液进行了 5 次平行测定, 得到了两个光学异构体的峰面积 A 与迁移时间 t 的相对标准偏差 (RSD) 表 1 的结果表明, 方法具有较好的重现性和一定的实际应用价值

mmol / L 范围内不断增加, 两组分的迁移时间和分离度均增加但当离子液体的浓度超过 15 mmol / L 以后, 基线噪声明显增大, 而且峰形有所展宽这可能是因为随着 [ BMIM] Cl 浓度的增加, 不仅电解质溶液的离子强度增加, 而且离

5 第 1 期杨四梅, 等 : 基于离子液体促进的手性配体交换毛细管电泳法分离分析去氧肾上腺素光学异构体 107 Component Linear range / (mg / L) Table 1 表 1 方法的线性关系与精密度 Linear relationships and precisions of the method Regression equation (n = 7) r Migration time / min RSDs (n = 5) / % Migration time Peak area R Phenylephrine A = C S Phenylephrine A = C A: peak area; C: mass concentration, mg / L. 2.6 样品的测定结果及加标回收率将处理后的空白及加标血液与尿液样品, 用优化后的电泳条件进行了分离分析, 结果见表 2 可见, 在空白血液与尿液中均没有检测到 R 去氧肾上腺素与 S 去氧肾上腺素, 而 R 去氧肾上腺素与 S 去氧肾上腺素在尿液中的加标回收率为 93 7% ~ 108 2%, 相对标准偏差在 3 18% (n = 3) 以内, 在血液中的加标回收率为 91 4% ~ 113 1%, 相对标准偏差在 4 82% (n = 3) 以内 Sample 表 2 样品测定结果及加标回收率 (n = 3) Table 2 Results and spiked recoveries for the determination of samples (n = 3) R phenylephrine Spiked / (mg / L) Found / (mg / L) Recovery / % RSD / % S phenylephrine Spiked / (mg / L) Found / (mg / L) Recovery / % RSD / % Urine Blood 结论研究结果表明, 离子液体氯化 1 丁基 3 甲基咪唑对 Cu(Ⅱ) 与 L 脯氨酸手性配合物体系电泳分离去氧肾上腺素光学异构体具有促进作用而且基于配体交换与离子液体协同作用建立的分离分析去氧肾上腺素光学异构体的毛细管电泳方法具有较好的分离度与较高的定量分析准确度, 有一定的实际应用价值参考文献 : [1] Gassmann E, Kuo J E, Zare R N. Science, 1985, 230: 813 [2] Maccarrone G, Contino A, Cucinotta V. TrAC Trends Anal Chem, 2012, 32: 133 [3] Schmid M G. J Chromatogr A, 2012, 1267: 10 [4] Zhao Y F, Liu C H, Zhang H L, et al. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2005, 33(7): 955 赵艳芳, 柳春晖, 张红丽, 等. 分析化学, 2005, 33(7): 955 [5] Qiu C G, Wang X Y, Guo Z P, et al. Chemical Journal of Chinese Universities, 2012, 33(3): 470 邱昌桂, 王晓瑜, 郭振朋, 等. 高等学校化学学报, 2012, 33 (3): 470 [6] Aydogan C, Karakoc V, Denizli A. Food Chem, 2015, 187: 130 [7] Huang L, Yu L S, Chen Y T. Chinese Journal of Chromatog raphy, 2014, 32(11): 1225 黄露, 余丽双, 陈毅挺. 色谱, 2014, 32(11): 1225 [8] Xiao W, Yang F Q, Xia Z N. Chinese Journal of Pharmaceu tical Analysis, 2015, 25(5): 856 肖文, 杨丰庆, 夏之宁. 药物分析杂志, 2015, 25(5): 856 [9] Tang S, Liu S J, Guo Y, et al. J Chromatogr A, 2014, 1357: 147 [10] Yang S W, Dai Y L, Deng N, et al. Chemical Reagents, 2015, 37(8): 751 杨思文, 代语林, 邓宁, 等. 化学试剂, 2015, 37(8): 751 [11] Xia C, Chen Z T, Xia Z N. Chinese Journal of Chromatog raphy, 2008, 26(6): 677 夏陈, 陈志涛, 夏之宁. 色谱, 2008, 26(6): 677 [12] Zhang J J, Du Y X, Zhang Q, et al. J Chromatogr A, 2013, 1316: 119 [13] Liu Y J, Shamsi S A. J Chromatogr A, 2014, 1360: 296 [14] Wang Y, Chen W J, Zhou Y, et al. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis, 2012, 32(11): 1985 王琰, 陈文静, 周颖, 等. 药物分析杂志, 2012, 32 ( 11): 1985

0 A = 564.62C-1024.8 0.9965 11.24 0.69 2.

龚亚夫在重新思考基础教育英语教学的理念一文中援引的观点认为当跳出本族语主义的思维定式后需要重新思考许多相连带的问题比如许多发音的细微区别并不影响理解和

龚亚夫在重新思考基础教育英语教学的理念一文中援引的观点认为当跳出本族语主义的思维定式后需要重新思考许多相连带的问题比如许多发音的细微区别并不影响理解和语音语篇语感语域林大津毛浩然改革开放以来的英语热引发了大中小学英语教育整体规划问题在充分考虑地区学校和个体差异以及各家观点的基础上遵循实事求是逐级定位逐层分流因材施教的原则本研究所倡导的语音语篇语感语域