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要燕滕
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1 中国科技论文在线 # 台湾独蒜兰无菌萌发与植株再生研究卓孝康 1,2, 兰思仁 1,2, 彭东辉 1,2, 吴沙沙 1,2, 陈潇 1,2, 江鸣涛 1,2 1,2**, 张林瀛 (1. 福建农林大学园林学院, 福建福州 ; 2. 福建农林大学海峡兰花保育研究中心, 福建福州 ) 摘要 : 以台湾独蒜兰 (Pleione formosana) 种胚为材料, 研究不同基础培养基不同种类激素和添加物的浓度配比对种胚萌发和植株再生的影响结果表明 : 台湾独蒜兰种胚萌发的最佳配方为 MS + NAA 0.5 mg L -1 + 蛋白胨 2%, 萌发率最高, 达 88.20%, 种苗生长健壮 ; 壮苗培养的配方为 TH + NAA 0.5 mg L BA 1.0 mg L -1 + 蛋白胨 2%; 丛生芽增殖和假鳞茎膨大的最佳培养基为 MS + 6-BA 0.2 mg L -1 + NAA 1.0 mg L -1 + 土豆 100 g L -1, 其增殖系数高, 达 4.17, 假鳞茎饱满, 直径达 0.33 cm; 生根培养的最佳配方为 MS + 6-BA 1.0 mg L -1 + NAA 1.0 mg L -1 + 香蕉泥 50 g L -1 + 土豆 50 g L -1, 根诱导率达 78%, 平均每株根数为 4.67 条关键词 : 台湾独蒜兰 ; 胚培养 ; 增殖 ; 生根中图分类号 :S Aseptic Budding and Plant Regeneration from Mature Embryos of Pleione formosana ZHUO Xiaokang 1,2, LAN Siren 1,2, PENG Donghui 1,2, WU Shasha 1,2, CHEN Xiao 1,2, JIANG Mingtao 1,2, ZHANG Linying 1,2 (1. College of Landscape, Fujian Agriculture and Forestry University, FuZhou 35002,China; 2. Fujian Agriculture and Forestry University Cross-Straits Orchids Conservation Research Center,Fuzhou,Fujian ,China) Abstract: In order to find the most suitable formulation for each growth stage, and establish the rapid propagation system, Pleione formosana embryoes were used to study the effects of different basic culture medium, plant growth regulators and additives in orthogonal experimental design.. Results indicated that: the optimum medium for the embryo germination and later growth was MS + NAA 0.5 mg L-1 + peptone 2%. The germination rate reached 88.20%, and the plants grew strong. The optimum medium for cultivating strong plant was TH + NAA 0.5 mg L BA 1.0 mg L -1 + peptone 2%. The optimum medium for proliferation of cluster buds and pseudobulb expanding was MS + 6-BA 0.2 mg L -1 + NAA 1.0 mg L -1 + mashed potato 100 g L -1. The average proliferation rate was 4.17,and the diameter of pseudobulb reached 0.33 cm. The optimum medium for rooting was MS + 6-BA 1.0 mg L -1 + NAA 1.0 mg L -1 + banana mud 50 g L -1 + mashed potato 50 g L -1. The rooting rate was 78%,and the number of roots was 4.67 per plant. Key words: Pleione formosana; embryo culture; proliferation; rooting 0 引言 40 台湾独蒜兰 (Pleione formosana) 为兰科 (Orchidaceae) 独蒜兰属多年生草本植物, 花期 3-4 月, 花后或花期长出一枚叶片, 又被称为一叶兰 [1] 喜温暖湿润半阴环境, 生于林下或林缘腐殖质丰富的土壤和岩石上, 主要分布于台湾福建西部至北部浙江南部和江西东南部 [2] 台湾独蒜兰具有极高的观赏价值和药用价值, 为兰科濒危种, 属野生动植物濒危物种国际贸易公约应保护植物 [3] 近年来由于自然灾害和人为干扰, 其生存与发展已受基金项目 : 教育部博士点基金 ( ), 福建省自然科学基金 (2011J01081), 国家林业局林业公益性行业科研专项 ( ) 作者简介 : 卓孝康 (1988-), 男, 硕士研究生, 兰科植物种质资源与应用通信联系人 : 彭东辉 (1971-), 男, 教授, 园林植物种质资源与育种. fjpdh@126.com - 1 -

的最佳配方为 MS + NAA 0.5 mg L -1 + 蛋白胨 2%, 萌发率最高, 达 88.20%, 种苗生长健壮 ; 壮苗培养的配方为 TH + NAA 0.5 mg L -1 + 6-BA 1.0 mg L -1 + 蛋白胨 2%; 丛生芽增殖和假鳞茎膨大的最佳培养基为 MS + 6-BA 0.

2 45 到极大威胁, 种群数量日趋下降, 许多原有记载的分布地已经找不到台湾独蒜兰的踪影另外, 台湾独蒜兰种子细小, 自然条件下不易萌发, 有性繁殖率低, 主要靠假鳞茎的无性繁殖来延续后代, 繁殖速度慢目前, 独蒜兰属植物的组培繁殖已有一些报道 [4-7], 但仍缺乏系统性的研究国内外对台湾独蒜兰组培快繁研究报道很少,Lu M-C [8] 利用 2,4-D 和 TDZ 诱导台湾独蒜兰愈伤组织, 并成功的培育出植株本研究通过胚培养的方法, 对台湾独蒜兰进行离体快速繁殖, 希望对野生台湾独蒜兰种质资源的保护和可持续开发利用提供有效途径 1 材料与方法试验材料于 2013 年 3 月 21 日对福建省德化县戴云山国家自然保护区内的野生台湾独蒜兰进行人工授粉 ( 异株异花 ), 于 2013 年 8 月 29 日采回未开裂的蒴果为试验材料, 种子发育约 160 d 植株再生材料来源于播种 100 d 的无根种胚苗 1.2 试验方法灭菌与无菌播种方法将采来的蒴果用洗衣粉浸洗 10 min, 再用自来水冲洗 2 h, 在无菌条件下用 75% 的酒精表面消毒 30 s 后, 无菌水冲洗 3 次, 再用 0.1% 的升汞消毒 15 min, 无菌水冲洗 5 次, 每次 5 min 在超净工作台接种盘上, 用灭菌滤纸将果荚表面水分吸干, 切开蒴果, 将种子均匀的撒落于培养基表面每组处理接种 30 瓶, 每个处理 3 个重复种子萌发诱导培养基设计方案如下 : 30.0 g L -1 蔗糖,7 g L -1 琼脂,2 g L -1 活性炭,pH 值为 5.8, 培养温度为 23 ± 2, 光照强度为 µmol (m 2 s) -1, 光照时间为 12 h d -1 采用 L 9 (3 4 ) 正交试验 [9], 研究 6-BA NAA 外源添加物对种子萌发的影响 ( 表 1) 播种后每 2 d 观察一次种子萌发情况,45 d 统计萌发率, 以种子突破种皮为萌发标准 ;90 d 测量种子萌发后的生长状况表 1 台湾独蒜兰无菌萌发配方正交设计 L 9 (3 4 ) Table 1 The orthogonal design scheme L 9 (3 4 ) of the formulation for the embryo culture of Pleione formosana 水平因素基础培养基 6-BA/mg L -1 NAA/mg L -1 添加物 /g L 植株再生培养 1 TH 香蕉 5% 2 MS 椰子 10% 3 1/2MS 蛋白胨 0.2% 以无菌播种 90 d 后, 叶芽长约为 0.5 cm, 球茎约为 0.3mm, 尚未生根的种苗为材料, 以 MS 为基础培养基, 采用 L 9 (3 4 ) 正交试验研究 6-BA NAA 外源添加物 ( 香蕉和马铃薯 ) 对增殖和生根的影响 ( 表 2), 培养条件 ( 同上 ) 每个处理接种 30 瓶, 每瓶 5 株,3 次重复 90 d 后统计增殖数生根数, 测量株高根长和假鳞茎大小, 筛选出适合台湾独蒜兰丛生芽增殖和生根的培养基 - 2 -

殖, 希望对野生台湾独蒜兰种质资源的保护和可持续开发利用提供有效途径 1 材料与方法 50 1.

3 80 85 表 2 台湾独蒜兰丛生芽的增殖与生根培养基配方正交设计 L 9 (3 4 ) Table 2 The orthogonal design scheme L 9 (3 4 ) of the formulation for the proliferation and rooting culture of Pleione formosana 水平因素 6-BA/mg L -1 NAA/mg L -1 添加物 /g L 数据统计与分析香蕉 10% 香蕉 5%+ 土豆 5% 土豆 10% 用 SPSS 13.0 统计分析软件对数据进行方差分析 (general linear model procedures) 和多重比较 (Student-Newman-Keuls), 各指标计算公式为 : 萌发率 = 萌发种子数 / 种子总数 100 %; 增值系数 = 增殖后芽数 / 接种外植体数 100%; 根诱导率 = 生根株数 / 接种株数 ; 生根数 = 生根根数 / 生根不定芽数 100% [10-11] 2 结果分析 2.1 种子萌发种子萌发率台湾独蒜兰种子播种 45 d 后, 种子已完全突破种皮, 少数长出叶芽从表 3 各因素 R 值分析可知对种胚萌发的影响主次关系为基础培养基 > 添加物 >6-BA>NAA 经方差分析 ( 表 4) 可知, 基础培养基和添加物对种子萌发均有显著影响,6-BA 对种子萌发有一定影响, 台湾独蒜兰种子萌发的最优水平组合为处理 4: MS + NAA 0.5 mg L -1 + 蛋白胨 2%, 萌发率最高, 达 88.20%, 原球茎大小均一, 饱满健壮, 长势最好, 少数已分化出叶芽表 3 不同激素种类和添加物的浓度配比对种胚萌发的影响 Table 3 Effect of the different kinds and concentration of hormones and additives on the germination of Pleione formosana 处理号基础培养基 6-BA/mg L -1 NAA/mg L -1 添加物 / g L -1 萌发率 (%) x=arcsin 1 TH 香蕉 5% TH 椰子 10% TH 蛋白胨 2% MS 蛋白胨 2% MS 香蕉 5% MS 椰子 10% /2MS 椰子 10% /2MS 蛋白胨 2% /2MS 香蕉 5% K K K T= k k k R

0 统计分析软件对数据进行方差分析 (general linear model procedures) 和多重比较 (Student-Newman-Keuls), 各指标计算公式为 : 萌发率 = 萌发种子数 / 种子总数 100 %; 增值系数 = 增殖后芽数 / 接种外植体数 100%; 根诱导

4 方差来源表 4 各培养因素方差分析 Table 4 Variance analysis of each factor F 值萌发率鳞茎增殖生根率鳞茎膨大基础培养基 * BA * ** NAA * 添加物 * ** * 注 :F 0.01 =29.5;F 0.05 =9.28;F 0.1 =5.93 ** 极显著 ;* 显著种子萌发后期生长状况台湾独蒜兰萌发后不同处理组合在不同时间段的生长状况如表 5 所示, 无菌播种 30 d 后, 各处理组合种子均变绿, 处理 2 未突破种皮, 其余各处理均不同程度的突破种皮, 处理 5 出现少量原球茎褐化播种 60 d 后, 处理 1 处理 4 处理 8 处理 9 长势较好, 原球茎大, 已分化出叶芽其中, 以处理 4 表现最好, 生长健壮, 鳞茎大小可达 mm, 叶芽长达 mm, 其余各处理出现不同程度的褐化播种 90 d 后, 处理 1 幼苗生长细弱, 处理 3 处理 4 后期幼苗生长迅速, 鳞茎大小可达 mm, 植株高达 cm, 生长旺盛, 均超过其余各组综述所述, 处理 4:MS + NAA 0.5 mg L -1 + 蛋白胨 2%, 适合种子萌发及后期的生长 ; 处理 3:TH + NAA 0.5 mg L BA 1.0 mg L -1 + 蛋白胨 2%, 不利于萌发, 但有利于后期壮苗培养, 其假鳞茎大小要超过处理处理号 1 种子变绿, 突破种皮表 5 不同阶段生长状况比较 Table 5 the growth condition of different stages 植株生长状况 30 d 60 d 90 d 萌发后, 大部已分化出叶芽, 长势均匀, 原球茎 mm, 叶芽长 mm 平均高度达 0.5cm, 原球茎为 1mm, 苗细弱, 无褐化综合评价萌发良好, 长苗一般 2 种子变绿, 未突破种皮萌发后, 原球茎细小, 约为 0.1mm, 长势不齐, 且出现大量褐化, 无叶芽分化平均高度 1.2cm, 球茎为 1.3mm, 原球茎阶段褐化严重, 长芽后, 植株生长迅速, 球茎大, 但长势不均匀不利于萌发, 长苗较好 3 种子变绿, 突破种皮 4 种子变绿, 突破种皮, 原球茎大萌发后, 原球茎细小, 约为 mm, 且出现褐化, 无叶芽分化萌发后, 原球茎大, 少数分化出叶芽, 原球茎 mm, 叶芽长 mm 平均高度 2cm, 球茎为 2.0mm 萌发阶段褐化严重, 在生长阶段表现良好, 生长迅速平均高度 1.5cm, 球茎大小 1.5mm, 无褐化, 长势均匀不利于萌发, 长苗良好, 植株健壮利于萌发和后期生长健壮, 长势均匀 5 种子变绿, 突破种皮, 出现褐化萌发后, 原球茎大, 但部分出现褐化, 无叶芽分化平均高度 0.1cm, 球茎 0.6mm, 褐化严重不利于萌发和长苗 6 种子变绿, 突破种皮, 原球茎小萌发后, 原球茎细小, 约为 mm, 少量出现褐化平均高度 0.1cm, 球茎 0.5mm, 褐化严重不利于萌发和长苗 7 种子变绿, 突破种皮, 原球茎小萌发后, 原球茎细小, 约 mm, 部分出现褐化完全褐化不利于萌发和长苗 - 4 -

.813 * 2.341 56.149 ** 16.333 * 注 :F 0.01 =29.5;F 0.05 =9.28;F 0.1 =5.93 ** 极显著 ;* 显著 105 110 2.1.2 种子萌发后期生长状况台湾独蒜兰萌发后不同处理组合在不同时间段的生长状况如表 5 所示, 无菌播种 30 d 后,

5 8 种子变绿, 突破种皮, 原球茎小萌发后, 原球茎较大, 约为 mm, 部分分化出叶芽, 芽长约 mm, 长势不均匀平均高度 0.8cm, 球茎 1.2mm, 长势较均匀, 无褐化萌发和长苗较好 9 种子变绿, 突破种皮, 原球茎大萌发后, 原球茎较大, 约为 mm, 少数分化出叶芽, 芽长约 mm, 长势较均匀平均高度 0.5cm, 球茎大小 1.0mm, 后期长势不均, 少量褐化萌发和长苗一般 2.2 植株再生培养不同处理对丛生芽增殖的影响由表 6 可知,6-BA 对大苞鞘石斛增殖系数的影响较大, 外源添加物和 NAA 对大苞鞘石斛增殖系数的影响小当 6-BA 质量浓度达到 0.2 mg L -1 NAA 质量浓度达到 1.0 mg L -1 时, 增殖系数达到最高水平, 且植株生长健壮整齐根据各因素 R 值大小可知,4 种因素对增殖系数的影响强弱表现为 6-BA>NAA= 添加物, 方差结果表明 ( 表 4),6-BA(F=14.465) 对台湾独蒜兰丛生芽增殖的影响显著丛生芽增殖培养的最佳培养配方为处理 3: MS + 6-BA 0.2 mg L -1 + NAA 1.0 mg L -1 + 土豆 100 g L -1, 其增殖系数最高, 达 4.17, 长势整齐, 植株生长健壮, 新生芽多表 6 不同激素种类和添加物的浓度配比对丛生芽增殖的影响 Table 8 Effect of the different kinds and concentration of hormones and additives on the proliferation of Pleione formosana 处理号 6-BA/mg L -1 NAA/mg L -1 添加物 /g L -1 空列增殖系数香蕉 10% 香蕉 5%+ 土豆 5% 土豆 10% 香蕉 5%+ 土豆 5% 土豆 10% 香蕉 10% 土豆 10% 香蕉 10% 香蕉 5%+ 土豆 5% K K K T=23.25 k k k R 不同处理对生根的影响 135 试验结果如表 7 所示, 通过表中 R 值可知, 添加物的 R 值最大, 为 30.37,6-B 次之, NAA 最小, 为 5.00, 可见 3 个因子对台湾独蒜兰生根诱导率影响的主次关系为 : 添加物 > 6-BA>NAA 方差分析表明 ( 表 4), 添加物 (F=56.149) 和 6-BA(F=40.438) 对台湾独蒜兰根诱导均有极显著影响, 其中香蕉泥和土豆泥混合使用的生根效果要优于各自单独加入台湾独蒜兰生根培养的最佳配方为处理 9:MS + 6-BA 1.0 mg L -1 + NAA 1.0 mg L -1 + 香 - 5 -

0mm, 后期长势不均, 少量褐化萌发和长苗一般 2.2 植株再生培养 2.2.1 不同处理对丛生芽增殖的影响 120 125 由表 6 可知,6-BA 对大苞鞘石斛增殖系数的影响较大, 外源添加物和 NAA 对大苞鞘石斛增殖系数的影响小当 6-BA 质量浓度达到 0.

6 蕉泥 50 g L -1 + 土豆 50 g L -1, 培养 60 天根诱导率达 78%, 平均根数可达 4.67 条株 -1, 根粗壮, 植株生长良好 140 表 7 不同激素种类和添加物的浓度配比对生根的影响 Table 7 Effect of the different kinds and concentration of hormones and additives on the rooting of Pleione formosana 处理号 6-BA/mg L -1 NAA/mg L -1 添加物 /g L -1 空列根诱导率 (%) x=arcsin 平均根数香蕉 10% 香蕉 5%+ 土豆 5% 土豆 10% 香蕉 5%+ 土豆 5% 土豆 10% 香蕉 10% 土豆 10% 香蕉 10% 香蕉 5%+ 土豆 5% K K K T= k k k R 不同处理对假鳞茎膨大的影响不同激素种类和添加物的浓度配比对假鳞茎膨大的影响结果如表 5 所示, 比较 ( 表 5) 各因素 R 值大小可知,4 个因素对原球茎膨大影响的重要次序为添加物 =NAA>6-BA 经方差分析表明 ( 表 4),NAA(F=17.33) 和添加物 (F=16.33) 对假鳞茎膨大的影响显著, 6-BA 对假鳞茎膨大有一定的作用适合假鳞茎膨大的最优组合为处理 3:MS + 6-BA 0.2 mg L -1 + NAA 1.0 mg L -1 + 土豆 100 g L -1, 假鳞茎最大, 达 0.33cm 表 8 不同激素种类和添加物的浓度配比对假鳞茎膨大的影响 Table 8 Effect of the different kinds and concentration of hormones and additives on pseudobulb development of Pleione formosana 处理号 6-BA/mg L -1 NAA/mg L -1 添加物 /g L -1 空列鳞茎大小 (cm) 香蕉 10% 香蕉 5%+ 土豆 5% 土豆 10% 香蕉 5%+ 土豆 5% 土豆 10% 香蕉 10% 土豆 10% 香蕉 10% 香蕉 5%+ 土豆 5% K K K

理号 6-BA/mg L -1 NAA/mg L -1 添加物 /g L -1 空列根诱导率 (%) x=arcsin 平均根数 1 0.2 0.2 香蕉 10% 1 0 0 0 2 0.2 0.5 香蕉 5%+ 土豆 5% 2 29 32.58 1.75 3 0.2 1 土豆 10% 3 17 24.35 1.00 4 0.5 0.

7 k T=2.31 k k R 结论与讨论台湾独蒜兰种子萌发的最适培养基为 MS + NAA 0.5 mg L -1 + 蛋白胨 2%, 壮苗培养最适培养基为 TH + NAA 0.5 mg L BA 1.0 mg L -1 + 蛋白胨 2% 激素对种子萌发阶段无显著影响, 基础培养基和添加物对种子萌发影响显著,MS 适合作为台湾独蒜兰种子萌发的基础培养基,TH 可作为壮苗培养的基础培养基 [12], 添加物以香蕉泥和蛋白胨的效果较好种子突破种皮后, 低浓度的激素对其分化生长有重要作用,6-BA 适合浓度为 0.5 mg L -1,NAA 适合浓度为 mg L -1, 适合浓度的生长素和细胞分裂素的共同调节, 有利于促进植株健壮生长和假鳞茎的膨大丛生芽增殖和假鳞茎膨大的最佳培养配方为 MS + 6-BA 0.2 mg L -1 + NAA 1.0 mg L -1 + 土豆 100 g L -1 在丛生芽的增殖阶段,6-BA 起主导作用, 其适合浓度为 0.2 mg L -1, 当随着浓度的升高, 增殖系数逐渐减小, 植株生长缓慢, 出现畸形苗适宜浓度的 NAA 和添加物对植株生长和假鳞茎膨大有辅助作用丛生芽生根的最佳培养基为 MS + 6-BA 1.0 mg L -1 + NAA 1.0 mg L -1 + 香蕉泥 50 g L -1 + 土豆 50 g L -1 添加物和 6-BA 对根的诱导和生长具有极显著影响, 其中两种不同的添加物混合加入比单独加入的效果要好生长素对根的诱导有重要影响, 但在试验中并没有达到显著水平, 可能是生长素浓度过高, 抑制了根的诱导和伸长适合浓度的外源激素 NAA 6-BA 可明显的促进外植体的增殖和分化, 提高种苗的整齐度, 浓度过高时会对生长起到抑制作用, 且不同植物在不同的生长阶段对激素的种类和浓度的需求不同 [13-15] 在整个试验过程中,NAA 对台湾独蒜兰对种子萌发增殖生根和假鳞茎膨大的影响均很小, 可能是独蒜兰对 NAA 比较敏感, 在组培过程中可以不加或在生根阶段加入较低浓度的 NAA 成倩等在秋花独蒜兰 (Pleion maculate) 的培养过程中, 只加入 BA, 在生根培养时加入 0.2 mg L -1 的 NAA, 与本试验研究的结果相似 [16] [ 参考文献 ] (References) [1] William Tai, Wu Zhengyi, Yu Dejun. Flora of China. Beijing [M]: Science Press,2009. [2] 周育真台湾独蒜兰 (Pleione formosana) 传粉与生殖策略研究 [D]. 福州 : 福州福建农大学, [3] 赵勇, 邵伟丽, 刘志高, 等. 福建虎伯寮自然保护区兰科植物多样性与保育研究 [J]. 福建林业科技, 2009,36(2): [4] 陈之林, 叶秀麟, 粱承邺, 等. 白花独蒜兰的组织培养和快速繁殖 [J]. 植物生理学通讯, 2004,40(4): [5] 黄家林, 胡虹, 李树云. 云南独蒜兰的种子无菌萌发研究 [J]. 园艺学报, 2005,32(2): [6] 李洪林, 付志惠, 杨波. 独蒜兰的离体快速繁殖 [J]. 植物生理学通讯, 2006,41(5): [7] 杨友联, 刘作易, 朱国胜. 独蒜兰种子共生萌发研究 [J]. 微生物学通报, 2008, 35(6): [8] 刘瑞江, 张业旺, 闻崇炜, 等. 正交试验设计和分析方法研究 [J]. 试验技术与管理,2010, 27(9): [9] Lu M-C. High frequency plant regeneration from callus culture of Pleione formosana Hayata[J]. Plant Cell,Tissueand organ culture, 2004, 78(1): [10] 李媛, 朱丹红, 潘会堂, 等. 3 种石斛兰以茎段为外植体的离体快繁技术 [J]. 东北林业大学学报, 2013,41(8): [11] 王瑞霞, 何明高, 宋松泉. 培养基与光照对沼兰种子非共生萌发的影响 [J]. 植物生态学报,2010,34(4): [12] 夏鸿西, 朱利泉, 张明, 等. 植物生长调节剂对石斛生长的影响 [J]. 园艺学报, 1999, 26(4):

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13期

13期中国农学通报,9():- Chinese Agricultural Science Bulletin 药百合种子萌发及染色体倍性检测吴昀, 马怡迪, 张琳, 夏宜平 ( 浙江大学农业与生物技术学院园艺系 / 农业部园艺植物生长发育与品质调控重点开放实验室, 杭州 ) 摘要